彭騰騰,王 信,李海燕,尹盼盼,范 彬,石曉峰

(1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院,甘肅 蘭州 730050;2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

衰老是人不可逆的必然過程,表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)和機(jī)能、適應(yīng)性和抵抗力的衰退。關(guān)于衰老的理論有很多,最經(jīng)典的是“自由基學(xué)說”[1],該學(xué)說認(rèn)為氧化應(yīng)激是推動(dòng)衰老的首要因素,使用自由基抑制劑及抗氧化劑就能延緩衰老。機(jī)體大量攝入D-半乳糖(D-galactose,D-Gal)后,能造成組織細(xì)胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),機(jī)體中清除自由基的酶活性降低,清除自由基的能力減弱,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性并加速衰老[2]。D-Gal致衰老模型造模時(shí)間短、模型成功率高[3],已應(yīng)用于天然產(chǎn)物對(duì)氧化應(yīng)激損傷的研究[4]。D-Gal致衰老表現(xiàn)在神經(jīng)衰老、肝功能退化等方面,機(jī)制包括氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、免疫衰退等[5]。

紫斑牡丹(Paeoniarockii)是芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)的多年生落葉灌木,為西北牡丹種群的原生植物,主要分布于甘肅、陜西等地[6]。紫斑牡丹花粉是該花雄性生殖器官花藥里的粉末,含有單萜苷類、芪類、黃酮類等活性成分,以及氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)成分,食藥價(jià)值較高,且乙醇提取物的抗氧化活性較好,作為天然抗氧化劑應(yīng)用潛力較大[7]。目前,對(duì)紫斑牡丹花粉的研究主要集中在物質(zhì)基礎(chǔ)和新資源產(chǎn)品的開發(fā)上,尚未見抗衰老相關(guān)效果的報(bào)道。本研究基于紫斑牡丹花粉的抗氧化劑潛力,探究紫斑牡丹花粉對(duì)D-Gal致衰老模型小鼠的抗衰老作用,以期為紫斑牡丹花粉延緩衰老和減少與衰老疾病發(fā)生相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器Aglient 1220型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);MH-500型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司);ME204/02型萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);CP225D十萬分之一天平、SQP型千分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);DE06082型酶標(biāo)儀(美國分子儀器上海有限公司);5424R型冷凍離心機(jī)、U410型超低溫冰箱(德國Eppendorf公司);動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司);SYD-K2040型冰切機(jī)(沈陽德譽(yù)電子儀器有限公司);Pannoramic MIDI型掃描儀(上海達(dá)邁生物科技有限公司)。

1.2 藥物與試劑紫斑牡丹花粉(已破壁,采自甘肅蘭州新區(qū)中川牡丹園,批號(hào):202205);芍藥苷(批號(hào):MUST-18032901,純度≥98%)、芍藥內(nèi)酯苷(批號(hào):MUST-16051601,純度≥98%)、異鼠李素(批號(hào):MUST-16032910,純度≥98%),均購自成都曼斯特生物科技有限公司;氧化芍藥苷(批號(hào):N26GB169459,純度≥98%)、木犀草素(批號(hào):S08GB160295,純度≥98%),均購自上海源葉生物科技有限公司;白藜蘆醇(批號(hào):nkl-00681220907,純度≥98%),購自成都鈉鈳鋰生物科技有限公司;槲皮素(批號(hào):100081-201610,純度≥98%),購自中國食品藥品檢定研究院;色譜甲醇(批號(hào):I1231597234)、色譜乙腈(批號(hào):SHBK0914),均購于德國默克公司;D-Gal(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):20220920);維生素C(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20200309);丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、磷酸化組蛋白γ-H2AX、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase,SA-β-Gal)的ELISA試劑盒,均購自上海源桔生物科技中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)♂ C57BL/6小鼠60只,體質(zhì)量(20±2)g,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(甘)2020-0002,動(dòng)物合格證號(hào):0000666,使用許可證號(hào):SYXK(甘)2019-0001。SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(23±2) ℃,濕度(50±5)%,晝夜明暗交替12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)甘肅省蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn),并嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行,倫理審查批準(zhǔn)號(hào):2022-007。

2 方法

2.1 對(duì)照品和供試品溶液的制備

2.1.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱定對(duì)照品氧化芍藥苷5.09 mg、芍藥內(nèi)酯苷5.10 mg、芍藥苷5.01 mg、白藜蘆醇5.07 mg、槲皮素5.11 mg、木犀草素5.25 mg、異鼠李素5.34 mg,分別置于5 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并定容,搖勻,即得單一對(duì)照品溶液;分別精密吸取單一對(duì)照品溶液各1.0 mL,置于同一10 mL容量瓶中,加50%甲醇稀釋并定容,搖勻,配制成濃度分別為101.8、102.0、100.2、101.4、102.2、105.0、106.8 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱定紫斑牡丹花粉2.0 g,置于100 mL圓底燒瓶中,精密加入75%乙醇50 mL,稱重,回流提取2 h,冷卻后再稱重,用75%乙醇補(bǔ)足失重,離心,吸取上清液40 mL置于圓底燒瓶中,加入5 mol·L-1的HCl溶液10 mL,90 ℃水浴回流2.5 h,放冷,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,加75%乙醇定容,搖勻,精密移取10 mL水解液于蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,用50%甲醇復(fù)溶后,定容于10 mL容量瓶中,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2 色譜條件色譜柱:Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相A:甲醇-乙腈(2 ∶1, V/V),流動(dòng)相B:0.2%磷酸溶液,梯度洗脫(0～5 min,10%A→18%A;5～8 min,18%A→28%A;8～20 min,28%A→40%A;20～27 min,40%A→43%A;27～35 min,43%A→47%A;35～43 min,47%A→52%A;43～46 min,52%A→70%A;46～51 min,70%A→10%A;51～54 min,10%A);檢測(cè)波長:258 nm(0～11.5 min,檢測(cè)氧化芍藥苷),230 nm(11.5～18 min,檢測(cè)芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷),306 nm(18～26 min,檢測(cè)白藜蘆醇),360 nm(26～54 min,檢測(cè)槲皮素、木犀草素、異鼠李素);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL,依照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL,分別置于1 mL容量瓶中,加50%甲醇定容,搖勻,配制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液,依照“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,測(cè)定7個(gè)成分的峰面積,以對(duì)照品溶液的濃度(X,mg·L-1)為橫坐標(biāo),對(duì)照品溶液中各成分的峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液(含氧化芍藥苷40.72 mg·L-1、芍藥內(nèi)酯苷40.80 mg·L-1、芍藥苷40.08 mg·L-1、白藜蘆醇40.56 mg·L-1、槲皮素40.88 mg·L-1、木犀草素42.00 mg·L-1、異鼠李素42.72 mg·L-1)20 μL,依照“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定7個(gè)成分的峰面積,計(jì)算RSD值。

2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取紫斑牡丹花粉2.0 g,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣,測(cè)定7個(gè)成分的峰面積,計(jì)算RSD值。

2.4.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取紫斑牡丹花粉2.0 g,平行6份,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算7個(gè)成分的平均含量和RSD值。

2.4.5加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知含量的紫斑牡丹花粉1.0 g,平行6份,分別置于100 mL圓底燒瓶中,按各成分含量的100%,精密加入單一對(duì)照品溶液適量,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算7個(gè)成分的平均回收率和RSD值。

2.5 含量測(cè)定精密稱取紫斑牡丹花粉2.0 g,平行3份,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,用回歸方程計(jì)算紫斑牡丹花粉中7個(gè)成分的含量。

2.6 動(dòng)物分組、給藥及造模60只C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為6組,每組10只,即:空白對(duì)照組(Con)、模型組(Mod)、維生素C(vitamin C,VC)組、紫斑牡丹花粉低劑量(LD,750 mg·kg-1)組、中劑量(MD,1 500 mg·kg-1)組、高劑量(HD,3 000 mg·kg-1)組。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,Mod組、VC組、紫斑牡丹花粉各劑量組每日頸背部皮下注射500 mg·kg-1D-Gal[8],Con組注射等量生理鹽水,連續(xù)6周。從第4周開始,VC組每天灌胃200 mg·kg-1VC;LD、MD、HD組每天分別灌胃相應(yīng)劑量的花粉液,對(duì)照組和模型組小鼠灌胃等量飲用水,灌胃和注射量10 mL·kg-1,連續(xù)3周,有效劑量通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。實(shí)驗(yàn)期間,讓小鼠自由攝食水,每7天稱質(zhì)量1次,按體質(zhì)量變化及時(shí)調(diào)整注射及灌胃量。

2.7 行為學(xué)評(píng)價(jià)

2.7.1一般狀態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)期間,每日定時(shí)觀察各組小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、毛色、皮膚、飲食與飲水量等。

2.7.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)于第6周進(jìn)行,先訓(xùn)練5 d,d 6測(cè)試,實(shí)驗(yàn)期間仍需正常給藥及造模。定位航行實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)前,先將小鼠放入水迷宮中游泳30 s適應(yīng)水的刺激,再放在平臺(tái)上適應(yīng)10～20 s。隨后,將小鼠依次從4個(gè)象限面朝池壁放入水中,記錄小鼠從入水至找到平臺(tái)所需的時(shí)間,記作定位航行的潛伏期。若小鼠無法在120 s內(nèi)找到平臺(tái),則潛伏期記為120 s,并將其誘導(dǎo)至平臺(tái)停留10 s。空間探索實(shí)驗(yàn):定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,撤去平臺(tái),將小鼠由靶象限(平臺(tái)所在象限)的對(duì)側(cè)放入水中,記錄小鼠120 s內(nèi)的游泳速度及靶象限的停留時(shí)間、穿臺(tái)次數(shù)[9]。

2.8 體質(zhì)量及臟器指數(shù)的測(cè)定行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠禁食不禁水12 h,稱質(zhì)量后,摘眼球取血,血液于4 ℃下靜置至血清析出后,4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min,取上清并分裝,保存于液氮中備用。取血后,小鼠迅速脫臼處死,冰上取出肝、腦組織,用冰生理鹽水漂洗血漬,濾紙吸干,稱重后放入凍存管,于液氮中保存。按照各組小鼠體質(zhì)量和臟器質(zhì)量,計(jì)算臟器指數(shù),臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

2.9 血清、肝腦組織中相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)取肝腦組織適量,按1 ∶9(W/V)加入預(yù)冷的PBS緩沖液,制成10%的組織勻漿,離心后,取上清,參照試劑盒說明,檢測(cè)各組小鼠血清、肝腦組織中的MDA、SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC,以及γ-H2AX、SA-β-Gal數(shù)值。

2.10 HE染色分別取出各組小鼠的肝、腦組織,于10%甲醛溶液中固定,修整、沖洗,二甲苯和梯度乙醇脫水,石蠟包埋,冠狀面切片(片厚3～5 μm),常規(guī)HE染色,再次脫水至透明,稍晾干后,中性樹膠封片,用顯微鏡鏡檢。

2.11 DAPI染色取固定的肝、腦組織,脫水、石蠟包埋、冷凍切片,加DAPI染核,室溫孵育10 min后,將玻片置于PBS(pH 7.4)中,在脫色搖床上洗滌3次,每次6 min,加抗熒光淬滅劑封片,熒光顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素、異鼠李素的色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度均>1.5,保留時(shí)間分別為10.51、12.44、13.81、22.44、30.17、31.76、38.80 min。理論塔板數(shù)以芍藥苷計(jì)>4 000,色譜圖見Fig1。

Fig1 HPLC chromatograms of reference substance (A) and text sample (B)

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1線性關(guān)系考察 結(jié)果表明7個(gè)成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好,回歸方程見Tab1。

Tab1 Results of linear relationship investigation

3.2.2精密度實(shí)驗(yàn) 測(cè)得氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素、異鼠李素峰面積的RSD分別為2.37%、2.53%、2.25%、2.41%、2.47%、2.36%、2.12%,表明儀器精密度良好。

3.2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 測(cè)得氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.24%、1.83%、1.62%、1.45%、1.68%、1.62%、1.48%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 計(jì)算得到氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素、異鼠李素的平均含量分別為1.401、10.546、1.218、0.106、0.793、0.426、4.006 mg·g-1,RSD分別為2.34%、2.53%、2.43%、2.73%、2.36%、2.74%、1.78%,表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.5加樣回收實(shí)驗(yàn) 計(jì)算得到氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素、異鼠李素的平均回收率分別為98.94%、98.73%、98.82%、98.67%、99.40%、98.96%、99.39%,RSD分別為2.81%、2.46%、2.47%、3.77%、2.45%、2.95%、1.72%,表明該方法回收率良好。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果結(jié)果表明,所測(cè)定的7個(gè)成分中,芍藥內(nèi)酯苷和異鼠李素的含量較高,芍藥苷、氧化芍藥苷的含量較低,白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素的含量最低,結(jié)果見Tab2。

Tab2 Sample content determination results(mg·g-1, n=3)

3.4 紫斑牡丹花粉對(duì)衰老小鼠行為學(xué)的影響

3.4.1一般行為學(xué)觀察 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好,反應(yīng)靈敏,行動(dòng)自如,毛色光亮、潤澤柔順,皮膚彈性好,飲食正常。隨著體內(nèi)D-Gal的累積,模型組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、倦怠嗜睡,反應(yīng)遲鈍,少動(dòng)、喜蜷縮,毛色枯黃、脫毛,皮膚松弛、彈性下降,飲食減少等衰老體征,說明衰老小鼠造模成功。與模型組比較,經(jīng)灌胃VC和花粉液后,相應(yīng)體征均有所改善,說明紫斑牡丹花粉具有改善衰老小鼠行為學(xué)體征的作用。

3.4.2水迷宮定位航行及空間探索實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)中,各組小鼠的潛伏期均隨訓(xùn)練天數(shù)增加而縮短(Tab3)。與對(duì)照組比較,模型組d 2～5潛伏期明顯延長(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,HD組d 1～2、LD組d 2、VC組與各劑量組在d 3～5的潛伏期明顯縮短(P<0.05,P<0.01)。隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加,模型組小鼠的定位航行策略呈“邊緣式→隨機(jī)式”,其他組呈“邊緣式→隨機(jī)式→趨向式→直線式”(Fig2)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中,各組小鼠的游泳速度不同,但影響并不明顯[10]。與對(duì)照組比較,模型組靶象限停留時(shí)間和穿臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,MD、HD組均能明顯延長小鼠靶象限停留時(shí)間(P<0.05),VC組、HD組均能明顯提高小鼠靶象限穿臺(tái)次數(shù)(P<0.05),見Tab4、Fig3。水迷宮定位航行及空間探索實(shí)驗(yàn)提示,紫斑牡丹花粉具有較明顯的改善衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶力的作用。

Tab3 Effects of P. rockii pollen on place navigation of Morris water maze in n=10)

Tab4 Effects of P. rockii pollen on spatial exploration of Morris water maze in n=10)

Fig2 Typical positioning of navigation paths in each group of mice

Fig3 Typical spatial exploration pathway of each group of mice

3.5 紫斑牡丹花粉對(duì)衰老小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響Tab5結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠的體質(zhì)量,肝、腦指數(shù)均明顯降低(P<0.01),說明小鼠臟器萎縮或退行性改變,衰老小鼠造模成功,

Tab5 Effects of P. rockii peony on body weight and organ index of n=10)

且衰老過程對(duì)小鼠肝、腦損傷最嚴(yán)重。與模型組比較,紫斑牡丹花粉各劑量組小鼠體質(zhì)量均明顯升高(P<0.05,P<0.01),VC組及MD、HD組小鼠的肝、腦指數(shù)均明顯升高(P<0.05),說明紫斑牡丹花粉具有保護(hù)小鼠臟器損傷的作用。

3.6 紫斑牡丹花粉對(duì)小鼠血清及肝、腦組織中MDA、T-AOC含量的影響如Fig4所示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠血清和肝腦組織中的MDA含量升高,T-AOC含量降低,說明衰老小鼠造模成功。與模型組比較,VC組和MD、HD組小鼠血清、肝腦組織,以及LD組小鼠血清中的MDA含量明顯降低;VC組和LD、HD組小鼠血清、肝腦組織,以及MD組小鼠血清、肝組織中的T-AOC含量明顯升高,提示紫斑牡丹花粉能清除小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物,保護(hù)機(jī)體免受活性氧自由基損傷。

Fig4 Effects of P. rockii pollen on MDA (A) and T-AOC (B) contents in serum, liver and

3.7 紫斑牡丹花粉對(duì)小鼠血清及肝、腦組織中抗氧化酶活性的影響如Fig5所示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠血清和肝腦組織中的GSH-Px、SOD、CAT活性明顯降低,說明衰老小鼠造模成功。與模型組比較,VC組和MD、HD組小鼠血清和肝腦組織中的GSH-Px、SOD、CAT活性均明顯升高,提示紫斑牡丹花粉能促進(jìn)小鼠體內(nèi)過氧化物的分解,清除氧自由基,保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。

Fig5 Effects of P. rockii pollen on activities of GSH-Px (A), SOD (B)and CAT (C) in serum, liver and brain tissues of

3.8 紫斑牡丹花粉對(duì)小鼠肝、腦組織中γ-H2AX、SA-β-Gal水平的影響如Fig6所示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠肝腦組織中的γ-H2AX含量和SA-β-Gal活性明顯升高,說明肝腦組織細(xì)胞發(fā)生了DNA損傷和衰老。與模型組比較,VC組、HD組小鼠肝腦組織中的γ-H2AX含量和SA-β-Gal活性明顯降低,提示紫斑牡丹花粉能延緩衰老和修復(fù)小鼠肝腦組織細(xì)胞DNA損傷。

Fig6 Effects of P. rockii pollen on γ-H2AX content (A) and SA-β-Gal activity (B) in liver and brain tissues of n=6)

3.9 紫斑牡丹花粉對(duì)衰老小鼠肝、腦組織形態(tài)的影響對(duì)照組的肝細(xì)胞形態(tài)完整,胞核明顯,胞質(zhì)豐富,排列有序;模型組的肝竇擴(kuò)張出血,肝細(xì)胞水腫變性,胞質(zhì)受損,有空泡形成;VC組和LD組的肝竇有出血現(xiàn)象,MD組的肝竇有擴(kuò)張,肝細(xì)胞排列不均勻;HD組的肝竇輕度出血,肝細(xì)胞形態(tài)較完整(Fig7A)。說明HD組能明顯保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化損傷。對(duì)照組海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,排列有序;模型組的膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨?神經(jīng)細(xì)胞皮層水腫;LD、MD組的神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、稀疏,局部胞核丟失;VC組、HD組的神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕,數(shù)量增多(Fig7B)。說明HD組可明顯改善神經(jīng)細(xì)胞的損傷異常。

Fig7 HE staining results of mouse liver tissue (A) and brain tissue (B) sections

如Fig8所示,與對(duì)照組比較,模型組肝、腦組織細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,VC組、HD組肝腦組織細(xì)胞、MD組腦組織細(xì)胞凋亡明顯減少(P<0.05,P<0.01),說明紫斑牡丹花粉能抑制衰老小鼠肝腦組織細(xì)胞凋亡。

Fig8 DAPI staining results of mouse liver and brain tissue n=4)

4 討論

衰老是機(jī)體隨年齡增加,各器官生理功能下降和紊亂的綜合表現(xiàn)。衰老模型包括自然衰老和誘導(dǎo)衰老模型兩大類,由于自然衰老模型耗時(shí)長,故本研究采用了誘導(dǎo)衰老模型中較為公認(rèn)的D-Gal致衰老模型[11]。文獻(xiàn)報(bào)道,雌雄性別對(duì)建立小鼠衰老模型無明顯區(qū)別[12],且D-Gal腹腔注射較皮下注射構(gòu)建的衰老模型在氧化應(yīng)激、自由基代謝、腦衰老研究中效果更加明顯[13]。考慮到D-Gal腹腔注射后,在肝內(nèi)經(jīng)半乳糖途徑代謝,肝特異性毒性較強(qiáng),可誘發(fā)嚴(yán)重肝衰竭[14],所以選擇皮下注射建立衰老小鼠模型。D-Gal大量攝入后,機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),致使抗氧化體系改變[15],細(xì)胞DNA受損和代謝變化[16],所以用MDA、T-AOC和相關(guān)抗氧化酶,以及γ-H2AX和SA-β-Gal作為衰老評(píng)價(jià)指標(biāo)。因海馬CA1區(qū)主要編碼時(shí)間和空間記憶[17],衰老能使海馬結(jié)構(gòu)和功能受損,所以觀察小鼠海馬CA1區(qū)的形態(tài)學(xué)變化,能反映腦衰老與學(xué)習(xí)記憶力的關(guān)系。

本研究先通過波長切換法,同時(shí)測(cè)定了紫斑牡丹花粉中的氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素、異鼠李素7個(gè)成分的含量,明確了可能發(fā)揮抗衰老作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),再進(jìn)行了藥效學(xué)評(píng)價(jià)。通過頸背部皮下注射D-Gal(500 mg·kg-1)建立衰老小鼠模型,探討紫斑牡丹花粉對(duì)衰老小鼠行為學(xué)體征,體質(zhì)量和臟器指數(shù),學(xué)習(xí)記憶力,血清、肝腦組織中的MDA、T-AOC含量和抗氧化酶活性等指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示,模型組小鼠的衰老體征變化明顯,體質(zhì)量和肝腦指數(shù)降低,血清和肝腦組織中的GSH-Px、CAT、SOD活性和T-AOC含量降低,MDA含量升高,這與前人建模結(jié)果一致[18]。紫斑牡丹花粉組小鼠肝腦組織中的γ-H2AX、SA-β-Gal水平降低,提示紫斑牡丹花粉能修復(fù)肝腦組織細(xì)胞DNA損傷和延緩衰老。HE、DAPI染色表明,紫斑牡丹花粉能保護(hù)肝、腦組織免受氧化損傷。

本研究結(jié)果提示,紫斑牡丹花粉對(duì)D-Gal致衰老模型小鼠具有抗衰老作用,且高劑量組(3 000 mg·kg-1)效果最明顯,單萜苷類、芪類、黃酮類成分可能為延緩衰老的有效成分,這為紫斑牡丹花粉相關(guān)抗衰老產(chǎn)品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。然而,紫斑牡丹花粉延緩衰老的分子機(jī)制尚不清楚,發(fā)揮抗衰老作用的有效成分是否為協(xié)同或相加作用,均有待深入研究。