莫思懿,曹后康,張可鋒,晉 玲,鐘明利,韋日明,高 雅

(1. 桂林醫(yī)學(xué)院高發(fā)病防治藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 桂林 541199;2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一種以雄激素水平升高、排卵功能障礙和形態(tài)異常為特征的疾病[1]。在全球范圍內(nèi),PCOS的發(fā)病率在2%至26%之間[2],而在我國育齡期婦女患病率為5.6%[3]。患有PCOS的女性,除了生殖系統(tǒng)問題外,往往還會伴隨其他代謝方面的異常,例如糖耐量下降、二型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加、血脂水平異常、高血壓風(fēng)險(xiǎn)升高等,這些因素長期累積可能會增加代謝綜合征和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。西醫(yī)主要以對癥治療為主,且需要進(jìn)行長期的健康管理。大多數(shù)西藥都含有單一的活性成分,能進(jìn)行靶向性治療,但是PCOS的發(fā)病機(jī)制相對復(fù)雜,西藥治療PCOS具有很多局限性[4]。中醫(yī)藥在治療上具有多靶點(diǎn)、多途徑和多環(huán)節(jié)的明顯特點(diǎn),因此,如何運(yùn)用中醫(yī)藥改善PCOS患者的卵巢病變,調(diào)節(jié)激素分泌和維持代謝平衡,是重點(diǎn)研究方向之一。

中藥材當(dāng)歸來源于傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根。有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸含有黃酮類、香豆素類和酚酸類等物質(zhì),具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種功能,能夠防治代謝性疾病[5-6]。臨床用藥規(guī)律分析表明,當(dāng)歸是治療PCOS中藥處方中的核心藥物,使用頻率很高[7]。研究表明[8-9],PCOS疾病及相關(guān)并發(fā)癥與卵巢氧化應(yīng)激失衡密切相關(guān),而Keap1/Nrf2/HO-1通路是調(diào)控氧化應(yīng)激的重要信號通路[8-9]。因此,本實(shí)驗(yàn)用來曲唑聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)大鼠PCOS模型,檢測當(dāng)歸醇提物(ethanol extract ofAngelicaeSinensisRadix,EEA)對PCOS大鼠激素、血脂和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響,同時(shí)關(guān)注Keap1/Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白和基因表達(dá),闡明EEA改善PCOS的潛在機(jī)制,為EEA用于臨床治療PCOS提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物本研究SD雌性大鼠(180±20 )g購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2020-0006。本實(shí)驗(yàn)獲得桂林醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn),批準(zhǔn)號GLMC20210039。

1.2 材料與試劑

1.2.1實(shí)驗(yàn)藥物 來曲唑(K26O10H101137)購自上海源葉生物科技有限公司;二甲雙胍(1115-70-4)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。本研究所用當(dāng)歸采自甘肅岷縣,經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院藥物研究所張可鋒教授鑒定為當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根。EEA提取方法:將當(dāng)歸粉末與60%乙醇按1 ∶10(kg·L-1)的比例混合。將混合物浸入圓底燒瓶中4 h,進(jìn)行2 h的熱回流萃取,過濾混合物以收集濾液,使用相同的方法再次提取殘?jiān)?。合并濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1.0 kg·L-1的生藥濃度(當(dāng)歸粉末的重量除以溶液的體積)。使用安捷倫1260 Infinity II液相色譜儀和Waters ACQUITY UPLC?BHE C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品對EEA的組成進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明,EEA中含有綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯Ⅱ、洋川芎內(nèi)酯Ⅲ、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞(Fig1)。

Fig1 UPLC chromatograms of standard (A) and EEA (B)

1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑 睪酮(testosterone, T)(MM-0577R1)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)(MM-0566R1)、黃體生成素(Luteinizing hormone, LH)(MM-0624R1)、雌二醇(estradiol, E2)(MM-0575R1)的ELISA試劑盒購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase, SOD)(20210126)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)(20210320)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)(20210222)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;甘油三酯(triglyceride, TG)(A110-1-1)、總膽固醇(total cholesterol, TC)(A111-1-1)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)(A112-1-1)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)(A113-1-1)的測試盒購自南京建成生物工程研究所;30%丙烯酰胺(A1010)、過硫酸銨(A1030)、十二烷基硫酸鈉(S1010)、封閉液(SW3015)、Marker(PR1920)和發(fā)光液(SW2040)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;TRIzol試劑(P118)、cDNA第一鏈合成試劑盒(A214)和預(yù)混實(shí)時(shí)熒光定量快速PCR反應(yīng)體系(A301)購自北京康潤誠業(yè)生物科技公司。一抗Keap1(18496-1-AP)、Nrf2(16396-1-AP)、HO-1(19937-1-AP)、GAPDH(10016192)購自Proteintech公司。二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠(ZB-2305)和山羊抗兔(ZB-2301)購自中杉金橋公司。

1.3 儀器FRESCO 21高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司);HM315R型切片機(jī)(德國MICROM);POWERPAC BASIC POWER SUPPLY型電泳儀電源、Mini-Protean Tetra Cell型蛋白電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(BIO-RAD公司);BX51顯微鏡(日本OLYMPUS);Epoch型酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek);Tanon 3500全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)分為正常組、模型組、二甲雙胍組(300 mg·kg-1)、EEA低、中、高劑量組(200、400、800 mg·kg-1)(以生藥量計(jì),給藥劑量是將臨床成人劑量轉(zhuǎn)換為大鼠劑量獲得),每組10 只。第1～4 周,正常組標(biāo)準(zhǔn)飲食,每天灌胃1%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium, CMC-Na)溶液,其余各組喂食高脂飲食,每天灌胃含有來曲唑(1 mg·kg-1)的1% CMC-Na溶液;第5～8周,給藥組灌胃對應(yīng)藥物,正常組和模型組給予等體積的蒸餾水。禁食不禁水16 h,麻醉大鼠后采集血液并收集卵巢。將左側(cè)卵巢保存到-80 ℃液氮中,右側(cè)卵巢用4%多聚甲醛溶液固定。

2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色檢查大鼠卵巢組織病變在多聚甲醛溶液中固定48 h后的卵巢組織,依次經(jīng)過脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精和伊紅染色,中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察病理情況。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中T、FSH、LH和E2的含量將采集的血液常溫靜置1.5 h后,用低溫離心機(jī)以5 000 r·min-1離心12 min,收集血清后按照試劑盒說明書指示,檢測并計(jì)算血清中T、FSH、LH和E2含量。

2.4 生化法檢測血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量收集血清后按照試劑盒說明書指示,檢測并計(jì)算血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C含量。

2.5 生化法檢測卵巢組織中SOD、GSH-Px、MDA的活性或含量用組織勻漿機(jī)加生理鹽水制備10%卵巢組織勻漿,離心后取上清液,按照試劑盒說明書步驟檢測并計(jì)算此3種因子的活性或含量。

2.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Keap1、Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)選取正常組、模型組和EEA高劑量組卵巢組織進(jìn)行檢測,首先使用配置好的裂解液(PMSF:RIPA=1 ∶100)制備5%卵巢組織勻漿,制備蛋白樣本,將蛋白樣本進(jìn)行電泳分離,在300 mA恒定電流下轉(zhuǎn)膜1 h,然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和封閉,在一抗中孵育過夜,一抗孵育濃度分別為:HO-1(1 ∶5 000)、Nrf2(1 ∶5 000))、Keap1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶ 2000)。最后,二抗(稀釋比1 ∶4 000)孵育2 h后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。采用ImageJ軟件標(biāo)定蛋白條帶的灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,得到目的蛋白的相對表達(dá)值;本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相對表達(dá)值均以正常組為標(biāo)準(zhǔn)做歸一化處理。

2.7 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測Keap1、Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)用TRIzol試劑裂解卵巢組織,在4 ℃離心后,獲得總RNA。定量后根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,最后根據(jù)SYBR試劑盒的反應(yīng)條件在Quant Studio3 PCR儀上擴(kuò)增。根據(jù)CT值計(jì)算2-ΔΔCT,并以GAPDH為參照,對各組的表達(dá)進(jìn)行歸一化處理,計(jì)算相對表達(dá)。PCR引物為Keap1:上游5′-TGCCCCTGTGGTCAAAGTG-3′,下游5′-GGTTCGGTTACCGTCCTGC-3′;Nrf2:上游5′-TCTTGGAGTAAGTCGAGAAGTGT-3′,下游5′-GTTGAAACTGAGCGAAAAAGGC-3′;HO-1:上游5′-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3′,下游5′-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3′;內(nèi)參GAPDH:上游5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。

3 結(jié)果

3.1 EEA對PCOS大鼠病理形態(tài)的影響陰道涂片結(jié)果顯示(Fig2),正常組大鼠表現(xiàn)為有規(guī)律的動情周期,依次為動情前期、動情期、動情后期和動情間期;而造模14 d后模型組大鼠基本處于動情間期(Tab1),提示動情周期出現(xiàn)紊亂。卵巢形態(tài)可以看出(Fig3),與正常組相比,模型組能明顯觀察到卵巢多囊樣變;與模型組相比,治療組多囊樣變得到改善。HE染色結(jié)果顯示(Fig4),與正常組比較,模型組大鼠卵巢組織中顆粒細(xì)胞層明顯減少,囊狀擴(kuò)張明顯,黃體數(shù)量明顯減少;與模型組比較,二甲雙胍組、EEA中、高劑量組囊狀擴(kuò)張得到改善,顆粒細(xì)胞層數(shù)明顯增加,且黃體數(shù)目增加。為了確定EEA在改善PCOS的同時(shí)是否對其他器官有毒性,對EEA高劑量組的腦、心、肺、肝、脾和腎進(jìn)行了HE染色。結(jié)果顯示(Fig5)EEA高劑量組腦、心、肺、肝、脾和腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,無明顯病理學(xué)變化,這證實(shí)EAA可改善PCOS,且對大鼠主要器官無明顯毒副作用。

Tab1 Effect of EEA on letrozole-induced estrous cycle grading in PCOS rats(number)

Fig2 Rat vaginal smear during estrous cycle(Pap staining, ×100)

Fig3 Morphology of rat ovaries

Fig4 Effect of EEA on ovarian pathology in PCOS rats induced by letrozole(HE staining, ×40)

Fig5 Effect of EEA on pathology of important organs in PCOS rats(HE staining, × 100)

3.2 EEA對PCOS大鼠模型血清中T、FSH、LH和E2的影響與正常組相比,模型組血清中LH、LH/FSH和T含量升高,E2含量明顯減少(P<0.05或P<0.01);與模型組相比,二甲雙胍組、EEA中劑量組和EEA高劑量組大鼠血清中LH、LH/FSH和T含量下降,且E2含量明顯增加(P<0.05或P<0.01)(Tab2)。

Tab2 Effect of EEA on levels of T, E2, LH, and FSH in serum of PCOS rat n=10)

3.3 EEA對PCOS大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的影響與正常組相比,模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C含量明顯升高,而HDL-C含量明顯降低;與模型組相比,二甲雙胍組和EEA中、高劑量組大鼠血清中TG、TC、LDL-C含量明顯降低,而HDL-C含量明顯升高(P<0.01)(Tab3)。

Tab3 Effect of EEA on serum levels of TG, TC, LDL-C and HDL-C in PCOS n=10)

3.4 EEA對PCOS大鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px、MDA活性或含量的影響與正常組相比,模型組大鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px活性明顯降低、MDA含量明顯升高;與模型組相比,二甲雙胍組和EEA中、高劑量組卵巢組織中SOD、GSH-Px活性明顯升高,MDA含量明顯降低(P<0.01)(Tab4)。

Tab4 Effect of EEA on SOD, GSH-Px activity, and MDA content in ovarian tissue of PCOS rat n=10)

3.5 EEA對PCOS大鼠卵巢中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表達(dá)的影響與正常組相比,模型組大鼠卵巢組織中Keap1蛋白和mRNA表達(dá)明顯上調(diào),而Nrf2和HO-1 蛋白和mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01);與模型組比較,二甲雙胍組、EEA中劑量組和EEA高劑量組中Keap1蛋白和mRNA表達(dá)明顯下調(diào),而Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)(Fig6,Tab5和Tab6)。

Tab5 Effect of EEA on expression of Keap1, Nrf2, and HO-1 proteins in ovarian tissue of PCOS n=3)

Tab6 Effect of EEA on mRNA expression of Keap1, Nrf2, and HO-1 in ovarian tissue of PCOS n=3)

Fig6 Effect of EEA on expression of Keap1, Nrf2, and HO-1 proteins in ovarian tissue of PCOS rats

4 討論

PCOS的發(fā)生率約為10%,是導(dǎo)致排卵異常的最常見原因,且通常伴有胰島素抵抗,并與糖尿病和卵巢癌癥等疾病的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。PCOS對育齡婦女的身心健康有嚴(yán)重影響,青少年P(guān)COS患者更易出現(xiàn)抑郁和焦慮[10]。然而,PCOS病因復(fù)雜,其潛在機(jī)制尚不明確,目前尚無根治PCOS的特效藥物。

來曲唑通過抑制芳香化酶的活性,阻斷雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致體內(nèi)雄激素,特別是卵巢內(nèi)雄激素水平升高,高濃度的雄激素影響卵巢功能,引起排卵障礙和卵巢多囊癥的發(fā)生[11]。T通過影響卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮,如類固醇分泌等,從而干擾卵泡發(fā)育的正常過程,可能導(dǎo)致卵泡異常或發(fā)育不全[12]。本研究中,在來曲唑聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠中觀察到模型組大鼠動情周期紊亂,T、LH和LH/FSH明顯增加,E2含量明顯降低,而TG、TC、LDL-C含量明顯升高,HDL-C含量明顯降低,這與同類研究相一致[13],說明建模成功?；钚匝醯钠胶庠谂陨诚到y(tǒng)的幾個(gè)過程中發(fā)揮著重要的生理作用,包括卵子成熟、排卵和受精等[14]。各種研究表明,氧化應(yīng)激是影響PCOS患者的另一個(gè)系統(tǒng)性問題[15]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)的氧化還原平衡被破壞時(shí),活性氧產(chǎn)生增多,導(dǎo)致SOD和GSH-Px活性下降,無法及時(shí)清除產(chǎn)生的活性氧,MDA水平升高累積,高濃度的MDA對組織細(xì)胞產(chǎn)生毒性傷害,從而影響機(jī)體的正常功能[16]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,經(jīng)過EEA治療后,PCOS大鼠動情周期恢復(fù)正常,肉眼也可治療組大鼠多囊樣變減輕,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)卵巢組織顆粒細(xì)胞層數(shù)增多,卵泡囊狀擴(kuò)張明顯好轉(zhuǎn);T、LH和LH/FSH水平降低,E2含量明顯升高,TG、TC、LDL-C含量明顯降低,HDL-C含量明顯升高,SOD、GSH-Px的活性明顯升高,MDA含量明顯降低。因此,我們推測EEA緩解大鼠PCOS的作用可能與調(diào)節(jié)血脂和抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

目前研究表明,機(jī)體對抗氧化應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制主要來源于兩方面:一方面是抗氧化酶可以清除活性氧;另一方面是Nrf2/HO-1抗氧化信號通路的激活,它可以增強(qiáng)細(xì)胞自身抗氧化能力來抵御氧化損傷,這兩種途徑共同構(gòu)成了機(jī)體抵御氧化應(yīng)激的主要保護(hù)機(jī)制[17]。在正常生理?xiàng)l件下,Nrf2與Keap1結(jié)合;當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí),Nrf2被激活,從Keap1分離,從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,并誘導(dǎo)HO-1的表達(dá),激活HO-1可以增強(qiáng)細(xì)胞自身的抗氧化能力,清除活性氧,從而發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激的積極作用[18]。本研究Western bolt和qRT-PCR結(jié)果表明,與正常組相比,模型組大鼠卵巢組織中Keap1蛋白和mRNA表達(dá)明顯上調(diào),而Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表達(dá)明顯下調(diào);在經(jīng)過EEA治療后,PCOS大鼠卵巢組織中Keap1蛋白和mRNA表達(dá)明顯下調(diào),而Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。這表明EEA可以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用,從而緩解PCOS大鼠卵巢組織損傷。

綜上,EEA能夠有效緩解大鼠PCOS,抑制卵巢組織氧化應(yīng)激,其作用機(jī)制可能與Keap1/Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)(Fig7)。本研究可為EEA的臨床應(yīng)用提供新思路。

Fig7 EEA improved PCOS through Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway