張 昊,廖 明,張學(xué)榮,周 怡,孔露平,胡少聰,肖曼琪,張子彥,羅小玲,3

(廣西醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.生命科學(xué)研究院, 3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部,廣西 南寧 530021)

神經(jīng)毒素是眼鏡蛇屬蛇毒的主要致死成分,是一種分子量約為7 ku的堿性小分子多肽。神經(jīng)毒素的肽鏈結(jié)構(gòu)包含15～18種氨基酸類(lèi)別和60～74個(gè)氨基酸數(shù)量[1]。眼鏡蛇神經(jīng)毒素是一種從眼鏡蛇蛇毒中分離出來(lái)的短鏈肽,具有中樞鎮(zhèn)痛作用,該神經(jīng)毒素在鎮(zhèn)痛方面有著高效性、無(wú)耐受性、無(wú)成癮性、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)[2]。

經(jīng)口給藥是最常見(jiàn)的給藥方式,對(duì)口服藥物,需要考慮在胃腸道惡劣的消化環(huán)境中,保證藥物的穩(wěn)定性和利用率[3]。將藥物遞送到作用靶點(diǎn)以及提高藥物的利用率,一直是口服藥物待解決的重要難題。選擇直腸給藥的方式可以避免胃腸道的破壞和肝臟的首過(guò)效應(yīng),藥物通過(guò)直腸黏膜快速吸收達(dá)到一定血藥濃度,從而發(fā)揮藥理作用。避免了口服給藥、靜脈注射等方式帶來(lái)的不良反應(yīng)[4]。對(duì)部分肝臟毒性較強(qiáng)、刺激性較強(qiáng)的藥物是一種安全可替代給藥途徑。同時(shí),由于直腸內(nèi)具有沒(méi)有消化液并且藥物可以長(zhǎng)期存留的特點(diǎn),特殊制作的栓劑或者凝膠系統(tǒng)可以顯著提高部分藥物的溶解度和生物利用度[5]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康KM小鼠,雌雄各半,清潔級(jí),18～22 g;健康SD大鼠,雌雄各半,清潔級(jí),180～220 g。均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(桂)2020-0003,使用許可證號(hào)為SCXK(桂)2020-0004,倫理審查編號(hào)為202112062。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循動(dòng)物倫理原則。

1.2 材料眼鏡蛇蛇毒凍干粉(廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所,粗毒LD100為 0.7 mg·kg-1,干毒含水量<5%,非水溶物含量<0.8%);CM Sephadex Fast Flow色譜柱(美國(guó)Pharmacia Biotech公司,17-0719-01);Sephadex G-50色譜柱(美國(guó)Pharmacia Biotech公司,17-0043-01);磷酸二氫鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng),3494);磷酸氫二鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng),3497);氯化鈉(成都市科龍化工試劑廠(chǎng),7647-14-5);Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,P1320);考馬斯亮藍(lán)R-250(北京索萊寶科技有限公司,6104-59-2);馬抗眼鏡蛇毒血清(賽倫生物公司);HRP標(biāo)記山羊抗馬IgG(武漢三鷹生物公司,5A00001-13)

1.3 主要儀器KTATMstart層析系統(tǒng)(美國(guó)GE公司);LGJ-18冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展公司);GS-800凝膠掃描儀器(美國(guó)BIO-RAD公司);Mini-PROTEAN Tetra電泳儀(美國(guó) BIO-RAD公司);JB-P5包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)

1.4 方法

1.4.1眼鏡蛇神經(jīng)毒素分離純化及純度鑒定 (1)稱(chēng)取2.0 g眼鏡蛇蛇毒凍干粉,取10 mL濃度為0.05 mol·L-1(pH 6.8)的PB緩沖液溶解,4 ℃過(guò)夜;第二天,用低溫離心機(jī)10 000 r·min-1離心10 min后,取上清液經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾至新離心管。(2)收集到的上清液采用KTATMstart層析系統(tǒng),首先進(jìn)行CM Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換層析。用0.05 mol·L-1的PB緩沖液平衡后,再用0～0.5 mol·L-1的含NaCl的PB緩沖液進(jìn)行階段性梯度洗脫,流速1 mL·min-1,平衡液不收集,收集洗脫液,10 mL每一管。收集最高致死峰進(jìn)行透析脫鹽、凍干濃縮處理,用于下一步分離純化。(3)選擇最高致死峰進(jìn)行Sephadex G-50 凝膠過(guò)濾色譜。凍干粉取5 mL濃度為0.05 mol·L-1(pH 6.8)的PB緩沖液溶解,預(yù)處理過(guò)程同上。采用KTATMstart色譜系統(tǒng),全程使用0.05 mol·L-1的PB緩沖液進(jìn)行平衡,流速2 mL·min-1,收集平衡液,10 mL每一管。收集最高致死峰進(jìn)行透析脫鹽、凍干濃縮處理,用于下一步SDS-PAGE電泳純鑒定及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(4)取Sephadex G-50 凝膠過(guò)濾色譜后的最高致死峰進(jìn)行Tris-SDS-PAGE凝膠電泳。取15 μL濃度為5 g·L-1的樣品與15 μL的Tris-Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液(2×)混合。采用15.5%分離膠、10%夾層膠、4%濃縮膠進(jìn)行電泳。取20 μL混合物上樣到樣品槽內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)蛋白使用預(yù)染超低分子量蛋白質(zhì)Marker。濃縮膠電壓30 V,夾層膠與分離膠電壓100 V。(5)電泳完成后,使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色,脫色后,使用凝膠掃描儀器進(jìn)行成像。

1.4.2眼鏡蛇神經(jīng)毒素蛋白含量測(cè)定 使用BCA法測(cè)定蛋白峰濃度。根據(jù)樣品數(shù)量配置足量BCA 工作液后,配置0.5 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。將標(biāo)準(zhǔn)品按要求稀釋成不同濃度,分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·L-1。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入到96孔板中,各孔再加入 200 μL配置好的 BCA 工作液,37 ℃ 放置20～30 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

1.4.3眼鏡蛇神經(jīng)毒素小鼠腹腔注射全數(shù)致死量(LD100)測(cè)定[6]預(yù)實(shí)驗(yàn)通過(guò)少量小鼠確定最小全死量(Dm) 和最大全不死量(Dn)。確定神經(jīng)毒素的全數(shù)致死量(LD100)在 100 μg·kg-1～500μg·kg-1此范圍內(nèi),再按等差值設(shè)置各劑量組進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。將60只KM小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,分別給小鼠腹腔注射眼鏡蛇神經(jīng)毒素100、200、300、400、500 μg·kg-1及生理鹽水,注射體積為0.2 mL,注射完成后觀(guān)察小鼠生命體征和死亡情況,確定小鼠腹腔注射LD100。觀(guān)察24 h內(nèi)小鼠所產(chǎn)生的行為反應(yīng)及死亡情況,并將死亡的小鼠進(jìn)行解剖觀(guān)察內(nèi)部臟器變化。

1.4.4眼鏡蛇神經(jīng)毒素大鼠直腸灌注給藥急性毒性測(cè)定[7]由于并未有文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)毒素直腸給藥的安全劑量,參照部分參考文獻(xiàn)的口服安全劑量進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。此劑量約為腹腔注射劑量的 100 倍。確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)大鼠直腸給藥的安全劑量。將60只SD大鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,分別給直腸灌注10、20、30、40 和50 mg·kg-1眼鏡蛇神經(jīng)毒素及生理鹽水,灌注體積為2 mL。直腸灌注后觀(guān)察大鼠的生命體征和死亡情況,檢測(cè)大鼠直腸灌注眼鏡蛇神經(jīng)毒素急性毒性。

1.4.5眼鏡蛇神經(jīng)毒素大鼠直腸灌注實(shí)驗(yàn)分組和給藥 探究眼鏡蛇神經(jīng)毒素能否通過(guò)直腸給藥途徑進(jìn)入大鼠血液,使用SD大鼠進(jìn)行直腸給藥實(shí)驗(yàn)。將大鼠分為對(duì)照組和3 h實(shí)驗(yàn)組兩組,每組2只大鼠。3 h實(shí)驗(yàn)組在0 h時(shí)給藥眼鏡蛇神經(jīng)毒素,對(duì)照組在0 h給藥相同體積的生理鹽水。給藥方式為直腸灌注給藥。直腸灌注前禁食不禁水24 h,且在正式實(shí)驗(yàn)前用少量生理鹽水潤(rùn)洗腸道,將大鼠腸道內(nèi)的糞便排清。將大鼠頭部固定,尾部抬高約與桌面形成60度角的高度,保持尾高頭低的姿勢(shì),用灌胃針深入大鼠直腸約5 cm進(jìn)行直腸灌注。灌注完成以后用小型橡膠塞堵住直腸口,并且保持頭低尾高約15 min。根據(jù)上述直腸灌注給藥急性毒性測(cè)定的最大安全劑量給藥。以50 mg·kg-1大鼠體質(zhì)量的劑量直腸給藥上述提取的眼鏡蛇神經(jīng)毒素,給藥體積為2 mL。

1.4.6大鼠直腸組織取材及石蠟組織切片的制作 給藥完成3 h后將兩組大鼠進(jìn)行麻醉。分別解剖取材對(duì)照組和3 h實(shí)驗(yàn)組大鼠直腸,用生理鹽水沖洗3～4次實(shí)驗(yàn)組腸道內(nèi)外,去除腸道內(nèi)容物及可能殘留的眼鏡蛇神經(jīng)毒素。用眼科剪取3 cm長(zhǎng)的直腸組織,用濾紙吸干組織表面液體,放入多聚甲醛中浸泡。直腸組織在多聚甲醛中浸泡48 h后,進(jìn)行組織包埋。先將直腸組織采用梯度乙醇浸泡脫水,乙醇濃度依次為:50%、70%、80%、95% Ⅰ、95% Ⅱ、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ。每種濃度浸泡時(shí)間:30 min,其中在95%乙醇中浸泡12 h以上。然后直腸組織依次浸泡于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明,每種溶劑中浸泡10 min。直腸組織浸蠟后,用石蠟包埋成組織蠟塊。用切片機(jī)將組織蠟塊切成厚度為5 μm的組織橫向切片。

1.4.7利用免疫組化技術(shù)觀(guān)察神經(jīng)毒素在大鼠直腸組織中的分布 組織切片采用免疫組織化學(xué)技術(shù),通過(guò)化學(xué)標(biāo)記法對(duì)腸道組織中的眼鏡蛇神經(jīng)毒素分布進(jìn)行橫向定位。對(duì)照組和3 h實(shí)驗(yàn)組采用同等實(shí)驗(yàn)條件,一抗選擇馬抗眼鏡蛇毒血清、二抗選擇HRP標(biāo)記羊抗馬IgG進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)完成后每組各選擇一張切片進(jìn)行鏡下觀(guān)察,觀(guān)察各組直腸切片中眼鏡蛇神經(jīng)毒素在直腸黏膜中的分布。對(duì)于每個(gè)直腸樣本,選擇10個(gè)代表性視野,并計(jì)算每個(gè)視野相關(guān)評(píng)分。整個(gè)直腸樣本的評(píng)分是這10個(gè)單個(gè)視野評(píng)分的算術(shù)平均值。將鏡下200×視野使用Aipathwell軟件進(jìn)行自動(dòng)分析,將陽(yáng)性部分用黃色像素點(diǎn)表示。根據(jù)AI計(jì)算出各項(xiàng)評(píng)分,從陽(yáng)性面積比率、平均光密度值、H-SCORE值三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià),使用統(tǒng)計(jì)軟件分析比對(duì)對(duì)照組與3 h實(shí)驗(yàn)組免疫組織化學(xué)鏡下結(jié)果的差異性。

1.4.8Shotgun質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)大鼠血漿中神經(jīng)毒素 將神經(jīng)毒素直腸給藥3 h后的實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血,離心分離血漿。SDT法裂解蛋白質(zhì)后,BCA法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。使用胰蛋白酶將蛋白質(zhì)酶解成為肽段,采用C18Cartridge對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽,脫鹽后將樣本凍干,再使用40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶。復(fù)溶后,樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析,采用HPLC液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液,B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。先用95%的A液平衡色譜柱,再經(jīng)過(guò)分析柱分離樣品。經(jīng)過(guò)分離柱后的樣品,通過(guò)高分辨率質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,檢測(cè)方式為正離子。質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件,采用軟件(Maxquant)進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)參數(shù)設(shè)置見(jiàn)Tab1。

Tab1 (Maxquant) Parameter settings for checking library identification

1.4.9HE染色觀(guān)察神經(jīng)毒素對(duì)大鼠直腸的組織結(jié)構(gòu)影響 同上述條件,完成直腸取材后,制作直腸石蠟組織切片。切片使用HE染液進(jìn)行染色。在顯微鏡下瀏覽組織切片情況,對(duì)切片中基本病理改變?nèi)绯溲?、淤血、出血、水腫、變性、壞死、增生、纖維化、機(jī)化、肉芽組織、炎性變化等情況進(jìn)行觀(guān)察,觀(guān)察神經(jīng)毒素對(duì)大鼠直腸的組織結(jié)構(gòu)變化。

1.4.10醋酸扭體法測(cè)定眼鏡蛇神經(jīng)毒素經(jīng)直腸給藥鎮(zhèn)痛活性 將50只小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,分別為NS對(duì)照組(生理鹽水)、直腸低劑量組(10 mg·kg-1神經(jīng)毒素)、直腸中劑量組(30 mg·kg-1神經(jīng)毒素)、直腸高劑量組(50 mg·kg-1神經(jīng)毒素)、腹腔注射組(0.1 mg·kg-1神經(jīng)毒素)。給藥體積為0.2 mL。環(huán)境溫度為25 ℃。給藥后3 h測(cè)量疼痛閾值。醋酸扭體法測(cè)定鎮(zhèn)痛活性,小鼠腹腔注射0.01 mL·g-10.6%的醋酸溶液,記錄醋酸注射后15 min內(nèi)的扭體次數(shù),并計(jì)算各組對(duì)扭體反應(yīng)的抑制率。抑制率=(陰性對(duì)照組扭體次數(shù)-實(shí)驗(yàn)組扭體次數(shù))/陰性對(duì)照組扭體次數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 眼鏡蛇毒分離純化色譜結(jié)果及蛋白濃度測(cè)定結(jié)果如Fig1,眼鏡蛇粗毒經(jīng)CM Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換色譜后得到6個(gè)洗脫峰。?、蠓暹M(jìn)行第二步分離純化。經(jīng)過(guò)Sephadex G-50 凝膠過(guò)濾色譜后獲得單一主峰Ⅲa峰,如Fig2所示。此峰收集的蛇毒蛋白致死能力最強(qiáng),濃度為5 g·L-1。

Fig1 CM Sepharose Fast Flow cation exchange chromatograms

Fig2 Sephadex G-50 gel filtration chromatograms

2.2 Tris-SDS-PAGE凝膠電泳神經(jīng)毒素純度鑒定取Sephadex G-50 凝膠過(guò)濾色譜后的Ⅲa峰進(jìn)行Tris-SDS-PAGE凝膠電泳,顯示如Fig3所示為單一條帶,神經(jīng)毒素達(dá)到電泳純,分子量在7 ku左右。

Fig3 Tris-SDS-PAGE gel electrophoresis results of neurotoxin electrophoresis(Ⅲa-1, 75 μg of protein; Ⅲa-2, Ⅲa-3, sequential doubling dilution of 1/2 concentration)

2.3 眼鏡蛇神經(jīng)毒素小鼠腹腔注射LD100檢測(cè)結(jié)果腹腔注射神經(jīng)毒素中毒癥狀表現(xiàn)為行動(dòng)安靜遲緩,逐漸發(fā)展至全身肌張力降低,俯臥于籠中、腹部貼地,呼吸急促并伴隨有深度腹式呼吸,驚跳翻正反射消失等,最終表現(xiàn)為中毒死亡。部分動(dòng)物死亡時(shí)眼球明顯外凸,經(jīng)組織解剖,心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器未出現(xiàn)明顯異常改變。不同劑量的死亡情況見(jiàn)Tab2,當(dāng)腹腔注射劑量達(dá)到400 μg·kg-1時(shí),24 h內(nèi)小鼠達(dá)到全數(shù)致死。

Tab2 Deaths of cobra neurotoxin mice injected intraperitoneally

2.4 眼鏡蛇神經(jīng)毒素大鼠直腸灌注給藥急性毒性測(cè)定結(jié)果給大鼠直腸灌注不同劑量的眼鏡蛇神經(jīng)毒素后,大鼠呼吸頻率正常、飲食正常、無(wú)異常呼吸音、生命體征良好,未出現(xiàn)明顯中毒癥狀。由Tab3可知,直腸給藥大劑量的眼鏡蛇神經(jīng)毒素毒性較低,均未出現(xiàn)大鼠死亡。50 mg·kg-1直腸給藥仍然是安全劑量。

Tab3 Death by rectal instillation in cobra neurotoxin rats

2.5 眼鏡蛇神經(jīng)毒素在大鼠直腸組織中的分布對(duì)照組和3 h實(shí)驗(yàn)組同步實(shí)驗(yàn),取對(duì)照組和3 h實(shí)驗(yàn)組每一組中的一張石蠟切片,在顯微鏡下觀(guān)察。相比于對(duì)照組,3 h實(shí)驗(yàn)組的大鼠直腸顯示眼鏡蛇神經(jīng)毒素在直腸組織黏膜層大量分布,并且深入黏膜下層。此部分組織內(nèi)含有大量杯狀細(xì)胞、血管、淋巴管。提示眼鏡蛇神經(jīng)毒素通過(guò)直腸進(jìn)入到了體內(nèi),結(jié)果如Fig4所示。

Fig4 Distribution of cobra neurotoxin in rectal tissue (yellow markers are positive markers measured by computer) ×200

2.6 眼鏡蛇神經(jīng)毒素在兩組大鼠直腸鏡下視野差異性分析采用陽(yáng)性面積比率、平均光密度值、H-SCORE評(píng)分指標(biāo),半定量分析標(biāo)本。通過(guò)隨取獲取標(biāo)本200×的放大倍數(shù)下10個(gè)視野均值作為此標(biāo)本的評(píng)分指數(shù)。累計(jì)不同視野下不同等級(jí)陽(yáng)性像素面積、累計(jì)光密度值、組織像素面積,從而計(jì)算出陽(yáng)性面積比率、平均光密度值、H-SCORE,對(duì)照組和3 h實(shí)驗(yàn)組的抗原位點(diǎn)分布有著明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,詳見(jiàn)Tab4。

Tab4 Analysis of variance of results of 10 randomized visual field scores in control group and 3 h experimental

2.7 Shotgun質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)大鼠血漿神經(jīng)毒素剔除大鼠血漿原有蛋白質(zhì),質(zhì)譜的Besepeak圖譜如Fig5所示,為不同時(shí)間點(diǎn)不同肽段產(chǎn)生不同的信號(hào)強(qiáng)度,與眼鏡蛇蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配,鑒定到的蛋白質(zhì)和多肽匯總見(jiàn)Tab5,6。質(zhì)譜結(jié)果顯示,3 h實(shí)驗(yàn)組血液中共篩選到7種眼鏡蛇毒有關(guān)蛋白,15種眼鏡蛇毒有關(guān)多肽片段。其中包括Cobra venom factor和Zinc finger protein的片段,此片段與神經(jīng)毒素片段有高度相關(guān)性。提示神經(jīng)毒素能夠以直腸給藥的方式進(jìn)入大鼠血液中。

Fig5 Rat plasma Basepeak plot

Tab5 Cobra proteins detected by mass spectrometry in rat plasma

Tab6 Cobra peptide fragments detected by mass spectrometry in rat plasma

Tab7 Calculation of number of acetic acid torsion and inhibition rate in different groups of )

2.8 神經(jīng)毒素對(duì)大鼠直腸組織結(jié)構(gòu)的影響HE染色結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,大鼠直腸給藥神經(jīng)毒素后,直腸組織各層結(jié)構(gòu)清晰,黏膜上皮完整,固有層腸腺數(shù)量豐富,排列緊密,間質(zhì)偶見(jiàn)少量炎性細(xì)胞,肌層肌纖維排列規(guī)則,未見(jiàn)其它明顯異常。對(duì)照組和3 h實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有明顯差異,結(jié)果如Fig6。說(shuō)明眼鏡蛇神經(jīng)毒素對(duì)大鼠直腸組織不會(huì)產(chǎn)生損傷,組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯病理變化。

Fig6 Pathological and histological characteristics of rat rectum ×20.0

2.9 眼鏡蛇神經(jīng)毒素經(jīng)直腸給藥后鎮(zhèn)痛活性測(cè)定在醋酸扭體實(shí)驗(yàn)當(dāng)中,直腸給藥眼鏡蛇神經(jīng)毒素3 h后能夠起到降低醋酸引起的化學(xué)疼痛作用,與對(duì)照組相比,高劑量組和中劑量組鎮(zhèn)痛作用明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低劑量組沒(méi)有明顯的鎮(zhèn)痛效果(P>0.05)。直腸給藥組的鎮(zhèn)痛效果稍差于腹腔注射組。直腸給藥組小鼠醋酸扭體抑制率達(dá)50%。說(shuō)明眼鏡蛇神經(jīng)毒素通過(guò)直腸途徑給藥發(fā)揮了鎮(zhèn)痛作用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)陽(yáng)離子交換和凝膠過(guò)濾兩步法提取了純度較高的眼鏡蛇神經(jīng)毒素。通過(guò)直腸灌注方式給藥,對(duì)藥物吸收的直腸黏膜部位進(jìn)行免疫組化,同時(shí)進(jìn)行血漿質(zhì)譜蛋白質(zhì)檢測(cè)和小鼠鎮(zhèn)痛活性測(cè)定,是證明神經(jīng)毒素從直腸黏膜吸收并且入血繼而發(fā)揮全身鎮(zhèn)痛作用的動(dòng)態(tài)定性驗(yàn)證過(guò)程。本研究提純的神經(jīng)毒素具有阻斷神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)的作用,這是發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的基礎(chǔ),且分子量與Liang等[8]的結(jié)果相符合。由于有研究證實(shí)眼鏡蛇毒成分中具有鎮(zhèn)痛物質(zhì),本文選擇眼鏡蛇毒中起鎮(zhèn)痛主要作用的神經(jīng)毒素作為研究對(duì)象。提純后的單一成分相較于復(fù)雜的眼鏡蛇粗毒混合物具有更穩(wěn)定更有效的鎮(zhèn)痛效果。

疼痛是一種應(yīng)激反應(yīng),也是由身體損傷或疾病引起的癥狀。與細(xì)胞中的信號(hào)分子密切相關(guān),這些分子包括激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、淋巴因子、生長(zhǎng)因子和趨化因子,它們可以改變細(xì)胞中的離子,從而引起疼痛。非甾體抗炎藥(NSAIDs)或嗎啡類(lèi)止痛藥被廣泛用作抗炎藥物。但非甾體抗炎藥可能會(huì)造成胃腸道損傷,嗎啡類(lèi)藥物有成癮性、耐受性等不良并發(fā)癥和副作用[9]。鎮(zhèn)痛研究的重點(diǎn)是尋找無(wú)耐受性、無(wú)依賴(lài)性和無(wú)副作用的天然藥物[10]。本研究證實(shí)眼鏡蛇神經(jīng)毒素直腸灌注方式能夠發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,且高劑量組和中劑量組鎮(zhèn)痛作用明顯,有別于其他已經(jīng)報(bào)道的通過(guò)靜脈或者腹腔注射眼鏡蛇毒素的方式發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。如部分文獻(xiàn)報(bào)道的:靜脈注射LD50為1.987 5 mg·kg-1的眼鏡蛇毒液中的新型小分子肽,可提高小鼠的疼痛閾值;腹腔注射0.2 mg·kg-1的NTXI可以將小鼠在熱板上的痛閾值從100%提高到184.35%,鎮(zhèn)痛作用起效緩慢,在治療后2 h開(kāi)始,4 h后達(dá)到最大效果,且無(wú)耐受性、無(wú)依賴(lài)性[11]。相較于以上給藥方式,直腸給藥方式起鎮(zhèn)痛作用起效時(shí)間沒(méi)有較大差別,發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的時(shí)間相差不大,3 h后便能起到鎮(zhèn)痛作用,能夠達(dá)到和注射相近的鎮(zhèn)痛效果。同時(shí),對(duì)直腸給藥以后的腸道黏膜進(jìn)行了病理分析,確定該藥物對(duì)直腸組織不會(huì)產(chǎn)生明顯損傷。

如今研究較多關(guān)于藥物發(fā)揮吸收作用的方式,其中最常見(jiàn)方式有口服給藥、靜脈注射給藥、腹腔注射給藥、皮下注射給藥等。直腸的環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定,酶活性較低,有利于解決一些藥物口服吸收差、首過(guò)代謝效應(yīng)廣泛、對(duì)胃有刺激、在胃環(huán)境中穩(wěn)定性不好等問(wèn)題。直腸給藥有相較于其他給藥方式的優(yōu)勢(shì)。國(guó)內(nèi)外臨床批準(zhǔn)了許多用于局部吸收和全身吸收的直腸制劑,其中包括布洛芬、水合氯醛、咖啡因、對(duì)乙酰氨基酚等一些常見(jiàn)的鎮(zhèn)痛劑[12]。同時(shí),直腸給藥系統(tǒng)中,如何提高藥物的生物利用度也是一項(xiàng)需要解決的問(wèn)題。某些藥物,需要通過(guò)加入適當(dāng)?shù)奈沾龠M(jìn)劑來(lái)達(dá)到有效血藥濃度,現(xiàn)代制藥和新型直腸藥物輸送系統(tǒng)(RDDS) 的幫助下,讓藥物提高生物利用度和控制釋放成為可能[13]。神經(jīng)毒素本身是一種分子量較小的多肽,為三指毒素能夠從直腸黏膜滲透到體內(nèi)提供的可能。直腸給藥副作用小,起效快。對(duì)小孩、老年或昏迷患者這些特殊人群,選擇直腸給藥可以降低治療風(fēng)險(xiǎn),降低操作難度[14]。具體直腸給藥方式的選擇也是一項(xiàng)值得討論的問(wèn)題,常見(jiàn)的直腸給藥有灌腸和栓劑兩種方式,本文選擇的是灌腸的方式給藥。有關(guān)于其他鎮(zhèn)痛藥如布洛芬的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究,認(rèn)為灌腸方式的藥物吸收量大,吸收速度快,相比于直腸栓劑能更快的發(fā)揮鎮(zhèn)痛和解熱作用[15]。

眼鏡蛇神經(jīng)毒素為一種小分子量多肽,分子量小,進(jìn)入血液循環(huán)以后分散成為多種片段,本文質(zhì)譜檢測(cè)到的Cobra venom factor為神經(jīng)毒素有關(guān)片段,也是眼鏡蛇毒液中的重要成分,具有神經(jīng)毒性。具有鎮(zhèn)痛[16]、抗炎、抗腫瘤[17]等作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大鼠血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析用到的是Shotgun質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù),它是一種高通量的蛋白質(zhì)分析方法,也稱(chēng)為蛋白質(zhì)組學(xué)中的無(wú)序分析。該技術(shù)通過(guò)將蛋白質(zhì)樣品消化成小片段,然后利用質(zhì)譜儀進(jìn)行分析,以確定它們的氨基酸序列和相對(duì)豐度[18]。這種方法得以在單次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)鑒定和定量數(shù)千個(gè)蛋白質(zhì)。通過(guò)此方法,更加精確有效的尋找到了大鼠血漿中的蛇毒片段。但本研究存在的局限性是無(wú)法確定直腸給藥制劑發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果的量效關(guān)系,只能確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在血液當(dāng)中的相對(duì)豐度,無(wú)法做到定量檢測(cè)具體進(jìn)入體內(nèi)藥物濃度的大小,此次檢測(cè)為定性檢測(cè)血液中是否存在蛇毒成分。后續(xù)進(jìn)一步可通過(guò)質(zhì)譜結(jié)合標(biāo)記技術(shù)定量化檢測(cè)進(jìn)入血液的蛇毒含量,探索發(fā)揮有效藥理作用的藥物濃度,并且比較不同時(shí)間點(diǎn)不同給藥方式的鎮(zhèn)痛效果,會(huì)更加擁有實(shí)際價(jià)值。

綜上所述,眼鏡蛇神經(jīng)毒素作為一種生物毒素具有很大的臨床藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值,通過(guò)直腸方式灌注給藥眼鏡蛇神經(jīng)毒素能夠通過(guò)此途徑入血并且發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。后續(xù)神經(jīng)毒素若能夠與相應(yīng)促進(jìn)藥物吸收的促進(jìn)劑結(jié)合,其吸收效果可能會(huì)更加明顯。此研究為后續(xù)研究神經(jīng)毒素直腸給藥新制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為臨床鎮(zhèn)痛藥物開(kāi)發(fā)提供方向。