冀 磊,楊 進,蘆殿香

(1.青海省人民醫(yī)院,青海 西寧 810007;2.成都大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都 610081)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是一種以血管過度收縮和閉塞重構(gòu)為特征的破壞性疾病,最終因右心衰竭而過早死亡。構(gòu)成肺血管的主要細胞成分如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和免疫細胞等多種細胞處在高血壓環(huán)境中導(dǎo)致細胞行為發(fā)生改變,促進PH的發(fā)生發(fā)展。內(nèi)皮細胞是與血液接觸的第一層細胞,也是第一個暴露于任何氧氣水平變化中的細胞。內(nèi)皮依賴性的血管張力調(diào)節(jié)依賴于多種血管活性因子,包括一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列環(huán)素和內(nèi)皮源性超極化因子,而血管收縮因子主要是內(nèi)皮素-1、血栓素和血管緊張素II。在這些物質(zhì)中,NO是心血管功能、代謝、神經(jīng)傳遞、免疫等的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,而異常的NO信號是許多疾病的核心特征。NO既可以作為活性舒血管物質(zhì)發(fā)揮抗動脈粥樣硬化、抑制血管平滑肌細胞增殖、血小板聚集和白細胞黏附等多種功能,也可以參與活性氮(reactive nitrogen species,RNS)產(chǎn)生,而RNS的過量產(chǎn)生在PH的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1]。

本文圍繞RNS以及由此引發(fā)的硝化應(yīng)激在PH中的作用進行綜述,以期在PH中以靶向抗硝化治療的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 RNS的種類

Tab1 Reactive nitrogen species

2 PH中RNS的來源

NO是一種快速擴散的氣體,生理狀態(tài)下主要由eNOS在肺血管內(nèi)皮細胞中合成,一旦合成,NO能迅速擴散通過細胞膜,傳遞至血管平滑肌細胞,NO和血管平滑肌內(nèi)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase,sGC)中的鐵原子結(jié)合,使三磷酸鳥苷變?yōu)榄h(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP),繼而激活環(huán)磷酸鳥苷依賴蛋白激酶G(protein kinase G,PKG),使胞質(zhì)Ca2+外流或回收至胞內(nèi)鈣儲存庫中,導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+下降,抑制鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈磷酸化,抑制肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合,從而使血管平滑肌舒張。NO作為肺循環(huán)中強有力的血管擴張劑,其合成減少可以導(dǎo)致肺血管收縮,進而促進PH的發(fā)生發(fā)展。

NO的作用主要取決于其濃度,低水平時刺激sGC,引起血管舒張,高水平時以硝化應(yīng)激為主要途徑,引起血管內(nèi)皮廣泛損傷。NO作為自由基參與硝化應(yīng)激,其來源主要有以下幾種途徑。

2.3 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和神經(jīng)元型一氧化氮合酶的誘導(dǎo)表達生理狀態(tài)下,除eNOS在肺血管內(nèi)皮細胞中合成NO外,iNOS和nNOS也可以合成少量NO。但在病理狀態(tài)下,如低氧誘導(dǎo)的PH,與常氧大鼠相比,低氧暴露增加了大鼠肺中iNOS基因和蛋白水平,抑制iNOS可減輕低氧誘導(dǎo)的大鼠PH[5],表明iNOS來源的NO在低氧誘導(dǎo)的PH中起到致病作用。另一項研究顯示,低氧暴露后,大鼠肺中nNOS基因和蛋白表達水平也有類似的增加[6]。

2.4 飲食來源飲食是人類亞硝酸鹽的主要來源,包括綠葉蔬菜的攝入以及食品添加劑和防腐劑。唾液腺將硝酸鹽從血漿中濃縮并分泌到口腔,口腔中的共生細菌將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,進入胃腸道,進而被吸收到循環(huán)血中,或者在胃里被還原為NO。亞硝酸鹽生成NO,包括酶促和非酶促兩種反應(yīng)。銅、抗壞血酸和多酚類物質(zhì)可促進NO的非酶促生成,而含金屬的蛋白質(zhì)如碳酸酐酶、血紅蛋白和肌紅蛋白可促進NO酶促生成。然而,關(guān)于飲食中亞硝酸鹽衍生的NO在硝化應(yīng)激誘導(dǎo)的PH發(fā)病機制中的作用知之甚少。有研究表明[7],霧化吸入亞硝酸鈉可以改善射血分數(shù)保留的肺動脈高壓患者的肺血管順應(yīng)性,減輕肺血管阻力,緩解右心衰竭。

3 硝化應(yīng)激對PH發(fā)生發(fā)展的影響

3.2 Cav-1作為硝化應(yīng)激成員對PH發(fā)生發(fā)展的影響在敲除脯氨酸羥基化酶(Egl-9 family hypoxia inducible factor 1,Egln1)基因的小鼠肺血管病變中RNS和NT增多,提示存在顯著的硝化應(yīng)激,這是由于HIF-2α和eNOS的激活導(dǎo)致內(nèi)皮細胞Cav-1缺陷,肺血管內(nèi)皮功能障礙所致,在給予CRISPR-Cas9介導(dǎo)的eNOS敲低或轉(zhuǎn)基因表達Cav-1干預(yù)后,可抑制硝化應(yīng)激反應(yīng),改善閉塞性肺血管重塑,并減輕小鼠PH[1]。在低氧誘導(dǎo)的PH模型中也發(fā)現(xiàn)Cav-1基因和蛋白水平均降低,在給予抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸干預(yù)后,可減輕低氧誘導(dǎo)PH大鼠右心室收縮壓及肺血管重構(gòu)[11]。可見,Cav-1作為eNOS的互作蛋白,Cav-1缺失可導(dǎo)致eNOS活性增加,由此生成的NO參與了硝化應(yīng)激反應(yīng),促進了PH的發(fā)生發(fā)展。

3.3 eNOS作為硝化應(yīng)激成員對PH發(fā)生發(fā)展的影響目前對于PH中肺內(nèi)eNOS表達的結(jié)果存在不同的報道。這些eNOS在PH中表達的差異可能是由于使用了不同的研究模型和不同的實驗方法以及疾病進展階段不同,但不管何種原因,研究者普遍認為NO信號在PH中受損。PH時NO生物利用度和活性受損是由于eNOS輔因子可用性降低或eNOS解偶聯(lián)導(dǎo)致的,而不是eNOS水平本身的降低[12]。eNOS、鋅指結(jié)構(gòu)、鈣調(diào)蛋白以及各種輔因子共同構(gòu)成了多聚體蛋白復(fù)合物,eNOS作為該蛋白復(fù)合物中的一員,不僅調(diào)節(jié)該復(fù)合物整體活性,還影響該復(fù)合物的完整性。eNOS衍生的NO除了作為血管擴張劑外,還可以促進血管生成。叢狀病變是重度PH的一個標志,研究表明,在叢狀病變中發(fā)現(xiàn)了高水平的eNOS,而eNOS來源的NO,已被證明在血管重構(gòu)過程中發(fā)揮了促進血管生成的作用[13]。由此可見,eNOS輔因子的缺乏,導(dǎo)致eNOS解偶聯(lián),此時生成的NO作為RNS參與了硝化應(yīng)激反應(yīng),進而導(dǎo)致PH的發(fā)生發(fā)展。

3.4 NO-cGMP-PKG異常作為硝化應(yīng)激成員對PH發(fā)生發(fā)展的影響在PH動物模型,隨著NO的減少,內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能受損,這并不是由于sGC表達減少導(dǎo)致的,因為在特發(fā)性PH(idiopathic pulmonary arterial hypertension,IPAH)患者及PH動物模型中sGC水平是升高的,在ROS和RNS升高的情況下,NO的受體sGC被氧化,使其對NO信號不敏感,從而降低了NO舒張血管的能力,sGC激動劑的應(yīng)用可以有效改善PH[14]。5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase type 5,PDE5)主要表達于血管平滑肌,可以降解cGMP,PDE5在PH中表達增加,靶向PDE5的藥物,如西地那非在PH動物模型和PH患者中具有改善PH的作用[15],這也間接支持cGMP消耗增加導(dǎo)致NO依賴性血管舒張受損。cGMP可以激活PKG影響平滑肌細胞的功能。PKG基因缺失可以誘導(dǎo)PH的發(fā)生。

3.6 硝化應(yīng)激影響PH發(fā)生發(fā)展的臨床證據(jù)通過對PH患者中硝化應(yīng)激標記物的觀察性研究,或靶向硝化應(yīng)激信號通路療法對臨床結(jié)果影響的研究,表明硝化應(yīng)激在PH發(fā)病機制中起到了重要作用。酪氨酸硝化是硝化應(yīng)激的標志物,通過對原發(fā)或者繼發(fā)PH患者肺組織進行免疫組化染色,結(jié)果顯示硝基酪氨酸明顯升高,提示PH患者的肺部處于硝化應(yīng)激狀態(tài)[18]。eNOS作為NO的主要來源,在IPAH肺叢狀病變中大量表達,也有研究表明,與健康對照者相比,eNOS蛋白水平在IPAH患者的肺中雖然沒有顯著變化,但活性顯著增加,導(dǎo)致ONOO-生成增多,誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞損傷[4]。這些研究均表明PH患者體內(nèi)硝化應(yīng)激增加,提示抗硝化治療在臨床上可能是有益的。

4 靶向RNS的治療方法

目前靶向RNS在PH中的治療方法主要有:增加NO含量、他汀類藥物調(diào)節(jié)炎癥和氧化酶活性、補充BH4、抗氧化劑清除ROS/RNS、NOX酶抑制劑減少ROS生成等幾個方面,最終達到減少ROS/RNS,恢復(fù)NO和蛋白質(zhì)正常功能,改善PH的目的。具體如下:

4.1 增加NO含量目前臨床上治療PH的藥物主要是針對肺血管進行調(diào)控,如抑制血管收縮或促進血管擴張,主要包括前列環(huán)素類似物、內(nèi)皮素受體拮抗劑、PDE5抑制劑和sGC抑制劑、鈣通道阻滯劑[19],其中,只有PDE5抑制劑直接靶向NO信號通路。作為PDE5抑制劑,西地那非、他達拉非和伐地那非已批準用于PH患者的治療。研究表明,上述藥物可以改善動脈性PH(pulmonary arterial hypertension,PAH)患者6米步行時間、WHO功能分級,西地那非還可以改善中國PAH患者運動耐量及血流動力學(xué),與傳統(tǒng)治療相比,西地那非可改善PAH患者1年、2年和3年的生存率[20]。

吸入NO早在1999年就被批準用于治療新生兒持續(xù)PH,對于緩解成人PH也部分有效。然而,這種治療并沒有降低呼吸衰竭危重患兒的死亡率。此外,高達40%的嬰兒對吸入的NO沒有反應(yīng)[21],原因可能是與吸入的NO從治療作用轉(zhuǎn)化成有害的活性氮有關(guān),如形成NO2或ONOO-。

4.2 他汀類藥物調(diào)節(jié)炎癥和氧化酶活性他汀類藥物在調(diào)節(jié)炎癥和血管氧化酶活性方面具有廣泛的作用,已被證明在動物模型中可以改善PH。他汀類藥物可以通過抑制RAS同源基因家族成員A的激活,也可以通過上調(diào)eNOS的表達來改變血管張力。然而,在PH患者中使用他汀類藥物的證據(jù)并不像在動物模型研究中那樣有說服力,一項三盲、隨機對照試驗、結(jié)果顯示,瑞舒伐他汀用于慢性阻塞性肺疾病合并PH有降低肺動脈收縮壓趨勢,但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義[22]。另一項研究表明,阿托伐他汀可有效降低慢性阻塞性肺疾病合并PH患者的肺動脈壓力[23]。他汀類藥物對于臨床PH患者的有效性仍需要隨機臨床試驗進行驗證。

4.3 補充BH4BH4是eNOS的重要輔助因子。BH4由三磷酸鳥苷從頭合成,以三磷酸鳥苷水解酶I作為該途徑中的第一個限速酶,過表達三磷酸鳥苷水解酶的轉(zhuǎn)基因小鼠對PH具有保護作用。在氧化應(yīng)激條件下,BH4很容易被解偶聯(lián)eNOS衍生的ONOO-氧化為BH2。由此導(dǎo)致的BH4減少是eNOS解偶聯(lián)的主要原因,eNOS解偶聯(lián)進一步導(dǎo)致硝化應(yīng)激。補充BH4在PH動物模型和PH患者中取得了一定的成效,動物實驗表明,降低細胞內(nèi)BH4水平,可以減少內(nèi)皮細胞和離體血管中NO的合成并增強超氧化物的生成,而給予BH4以劑量依賴性方式抑制超氧化物的生成。外源性補充BH4可以減少eNOS解偶聯(lián),提高NO生物活性,減少超氧化物生成[24],但其有益作用可能并不完全來自于eNOS功能的改善。

4.4 抗氧化劑清除ROS/RNS在PH實驗動物模型中,已表明抗氧化劑可逆轉(zhuǎn)PH的發(fā)生發(fā)展。在PH患者中也表明與氧化應(yīng)激有關(guān)的關(guān)鍵氧化酶活性上調(diào)。盡管大量的實驗證據(jù)表明,抗氧化劑對PH以及心肌肥厚向右心衰竭的轉(zhuǎn)變具有保護作用,但PH患者是否應(yīng)該接受藥物和/或膳食抗氧化劑治療尚無明確證據(jù)?？寡趸瘎┰豢紤]用于治療與PH相關(guān)的疾病,如應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸治療特發(fā)性肺纖維化,在潑尼松聯(lián)合硫唑嘌呤的標準治療基礎(chǔ)上加用N-乙酰半胱氨酸可能有利于特發(fā)性肺纖維化的治療。然而,另一項評估特發(fā)性肺纖維化反應(yīng)的研究報告表明,聯(lián)合使用潑尼松、硫唑嘌呤和N-乙酰半胱氨酸會增加患者死亡和住院的風(fēng)險?？寡趸瘎㎞-乙酰半胱氨酸治療可減輕慢性缺氧誘導(dǎo)的大鼠PH[11]。錳卟啉作為另一種ROS/RNS清除劑,可減輕Cav-1缺陷小鼠的右心室收縮壓和血管重構(gòu)[1],然而,另一種抗氧化劑TEMPOL,在缺氧和SU5416/缺氧誘導(dǎo)的PH大鼠中具有減少右心室收縮壓的作用,但對肺動脈重塑沒有影響[25],因此,抗氧化治療在PH的臨床前模型中是否有效仍存在爭議,這可能是與選擇的藥物、劑量和實驗設(shè)計有關(guān)。例如,根據(jù)濃度和肺細胞類型,TEMPOL可以是促氧化劑或抗氧化劑[26]。對于PH患者是否應(yīng)給予抗氧化劑治療這一問題,需要進一步的研究。

4.5 NOX酶抑制劑減少ROS生成模擬Cav-1支架結(jié)構(gòu)域的多肽是eNOS和NOX酶活性的有效抑制劑,并且在動物模型中被證明可以有效預(yù)防PH。這種方法的臨床實用性尚未得到證明,Cav-1的多肽是否可以減少PH中過量的ROS和RNS仍有待確定。抑制ROS生成在預(yù)防PH中也有一定的應(yīng)用前景,包括使用夾竹桃麻素抑制免疫細胞中的NOX 2或使用選擇性的NOX 1或NOX 4抑制劑以減少ROS的生成[27],進而抑制硝化應(yīng)激反應(yīng)。

5 結(jié)語和展望

硝化應(yīng)激增加是PH的標志。在PH肺組織存在明顯的ONOO-、NT和特定蛋白的硝基化。硝化應(yīng)激導(dǎo)致肺血管細胞發(fā)生細胞毒性,影響蛋白質(zhì)的翻譯后修飾及其功能,并誘導(dǎo)eNOS解偶聯(lián),導(dǎo)致血管擴張劑NO的生物利用度減低,最終引起血管收縮和血管重構(gòu)導(dǎo)致PH(Fig1)。

Fig1 Nitrative stress in pathogenesis of pulmonary hypertension

目前,對于PH的研究主要集中在對血管舒縮功能進行調(diào)控,針對PAH的靶向治療旨在糾正內(nèi)皮功能障礙。雖然eNOS在PH患者肺組織中的表達水平與對照組相比有上調(diào)、不變或下調(diào),但目前研究普遍強調(diào)NO對PH的保護作用。但我們之前的研究發(fā)現(xiàn),NO與PH之間的關(guān)系復(fù)雜,推測在PH中NO作為舒血管活性物質(zhì)發(fā)揮保護作用與作為自由基發(fā)揮氧化/硝化應(yīng)激損害作用之間可能存在一個閾值[28]。因此,對于PH的治療,抑制硝化應(yīng)激可能會改善PH患者臨床預(yù)后,但是通過吸入或膳食增加NO作為治療PH的方案需要斟酌,推測與疾病發(fā)展階段密切相關(guān),疾病早期增加NO可能有益,疾病晚期或弊大于利。