謝 群,林麗彬,鄭偉男,徐 麗,林揚元

(莆田學(xué)院1. 腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)福建省高校重點實驗室、2. 護理學(xué)院、3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,福建 莆田 351100)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的類型,具有高侵襲性、轉(zhuǎn)移性和低生存率等特點。研究HCC侵襲轉(zhuǎn)移等分子機制,探尋新的基因治療靶點及其作用機制,對于提高患者生存率及改善預(yù)后有著重要價值[1]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200核苷酸,且不編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的片段,可通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄前及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方式來調(diào)控基因表達,從而影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡和自噬等[2]。lncRNA作為致癌基因或抑癌基因,參與腫瘤細胞的多種生物學(xué)過程,被證實在包括HCC在內(nèi)的多種癌癥的診斷、預(yù)后預(yù)測和治療中具有潛在價值,例如:H19的高表達與HCC發(fā)生、預(yù)后、生存相關(guān),可作為判斷HCC患者預(yù)后的候選指標[3];OGFRP1和DRHC分別通過AKT/mTOR、Wnt/β-catenin或MEK/ERK信號通路,調(diào)控HCC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[4-5]。但是,大部分lncRNA的功能及調(diào)控機制還很不明確,探討與HCC相關(guān)lncRNA的生物學(xué)功能及作用機制對于揭示HCC分子機制具有重要意義,也是靶向功能性lncRNA以期達到治療目的的新思路。

AC245100.1是課題組新近發(fā)現(xiàn)的一種新的lncRNA,本研究通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)集,分析AC245100.1的轉(zhuǎn)錄本之一ENST00000452996.1在HCC中的表達模式及臨床意義,同時構(gòu)建靶向ENST00000452996.1的shRNA慢病毒載體,探討其對肝癌細胞生物學(xué)功能的影響及調(diào)控機制,以期為HCC診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株人肝癌細胞HepG2(貨號:SCSP-510)、Hep3B(貨號:SCSP-5045)和Huh-7(貨號:SCSP-526),以及人胚腎細胞293T(貨號:SCSP-502),均購自中國科學(xué)院上海細胞庫;人肝癌細胞JHH-7(貨號:CTCC-004-0053)由浙江美森細胞科技有限公司提供。

1.2 試劑MEM(貨號:MA0217)和DMEM/F12(貨號:MA0214)培養(yǎng)基、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:MA0220)、細胞核蛋白與細胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(貨號:MA0211),均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;DMEM培養(yǎng)基(貨號:C11995500BT)、TRIzol試劑,均購自Invitrogen公司;CCK-8試劑盒、GSK-3β抑制劑TDZD-8(貨號:B1249),購自美國APExBIO公司;Transwell小室(貨號:353097),購自美國Becton Dickinson公司;Matrigel膠(貨號:356234),購自美國Corning公司;抗體ERK1/2(貨號#4695)、p-ERK1/2(貨號#4370)、p-GSK-3βSer9(貨號#5558)、GSK-3β(貨號#12456)、β-catenin(貨號#9562)、p-β-catenin(貨號#9561),均購自Cell Signaling Technology公司;β-actin(貨號:AF5001)和Histone H3(貨號:AH433)抗體,購自碧云天生物技術(shù)公司;shRNA干擾序列,由上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成;原位熒光雜交(fluorescent in situ hybridization,FISH)探針,由武漢賽維爾生物科技有限公司合成;表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)(貨號:C029),購自Novoprotein公司。

1.3 儀器Eclipse CI顯微鏡(Nikon公司);MultiskanTM FC酶標儀(ThermoFisher Scientific公司);FACS Calibur流式細胞儀(Becton Dickinson公司);垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1數(shù)據(jù)獲取與分析 采用TCGA數(shù)據(jù)集下載數(shù)據(jù)并進行分析。下載HCC組織及其癌旁組織50對,分析ENST00000452996.1在HCC組織及其癌旁組織中的差異表達。下載371例HCC組織中ENST00000452996.1表達及其臨床病理學(xué)特征相關(guān)數(shù)據(jù),其中365例具有完整的Edmondson-Steiner分級數(shù)據(jù),367例具有完整腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis,TNM)分期臨床特征,347例具有完整病理分期臨床特征。分別分析ENST000004 52996.1表達及其與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性,此外,326例具有完整生存時間的病例納入生存分析。

1.4.2細胞培養(yǎng) Hep3B和HepG2細胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基,Huh-7和293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,JHH-7細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.3qRT-PCR檢測 TRIzol提取總RNA,使用SYBR Master Mixture進行qRT-PCR,檢測肝癌細胞中ENST00000452996.1表達。引物序列為:ENST0000 0452996.1:上游5′-ATGAACCCACCATCACCATA-3′,下游5′-CTCCCTCAGTGCTAGACCCT-3′;內(nèi)參照GAPDH:上游5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′,下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.4.4FISH檢測 采用FISH法檢測ENST00000 452996.1在肝癌細胞中的表達及亞細胞定位。FISH探針序列5′-CGAAGCTTAGTGAAACGGCG-3′。融合生長的細胞用4%多聚甲醛固定,蛋白酶K(20 mg·L-1)37 ℃作用15 min,加入預(yù)雜交液37 ℃孵育60 min,于探針液中40 ℃孵育過夜,依次用2×檸檬酸鈉(saline sodium citrate,SSC)、1×SSC和0.5×SSC洗滌,最后用DAPI返染,使用顯微鏡拍照分析。

1.4.5慢病毒shRNA載體構(gòu)建與病毒包裝設(shè)計 采用靶向ENST00000452996.1的shRNA干擾序列(5′-CGGGAAATCTCGTAATGGCAT-3′),設(shè)置對照序列(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′),將shRNA干擾序列和對照序列分別克隆到含慢病毒綠色熒光蛋白的載體GV493,用Helper系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞,48 h后,收集含病毒的細胞上清液,經(jīng)離心、過濾及濃縮后,梯度稀釋法測定病毒滴度。將病毒濃縮液置-80 ℃保存,實驗組與對照組分別命名為shENST00000452996.1和shCtrl。

1.4.6肝癌細胞生物學(xué)功能檢測

1.4.6.1 CCK-8檢測細胞增殖活性 細胞以每孔1×104個接種于96孔板,shENST00000452996.1和shCtrl分別感染細胞,分別在24、48、72、96、120 h時,每孔添加CCK-8溶液10 μL,37 ℃孵育2 h后,酶標儀450 nm處測量吸光度(absorbance,A)。

1.4.6.2 平板克隆實驗 細胞以每孔3×103個接種于6孔板中,shENST00000452996.1和shCtrl分別感染細胞,觀察細胞克隆形成,于培養(yǎng)12 d時,觀察細胞可見克隆形成(每個克隆≥10個細胞)后,4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下拍照計數(shù)每孔形成的克隆數(shù)。

1.4.6.3 細胞凋亡檢測 細胞以每孔7×105個接種于6 cm培養(yǎng)皿,shENST00000452996.1和shCtrl分別感染細胞48 h,按照Annexin-V/PI雙染色法凋亡檢測試劑盒說明書操作,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,TreestarFlowJo v10.6.2分析數(shù)據(jù)。

1.4.6.4 劃痕實驗 細胞以每孔3×105個接種于6孔板,待細胞融合后,用200 μL的移液器吸頭在培養(yǎng)板底部呈“一”字型劃痕,并拍照記錄劃痕位置,shENST00000452996.1和shCtrl分別感染細胞48 h,在同一位置拍攝記錄劃痕區(qū)域細胞遷移情況。采用ImageJ軟件測定劃痕區(qū)域面積(area,A),細胞遷移率/%=(A0 h-A48 h)/A0 h×100。

1.4.6.5 Transwell檢測 遷移實驗時,細胞以每孔3×104個接種于Transwell小室上室內(nèi),shENST000 00452996.1和shCtrl分別感染細胞,上室內(nèi)加入200 μL含1%胎牛血清的培養(yǎng)基,下室內(nèi)加入600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后,擦除上室內(nèi)未穿膜的細胞,4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下隨機選取5個視野拍照,并計算穿膜細胞數(shù)平均值。侵襲實驗時,Transwell小室聚碳酸酯膜內(nèi)側(cè)預(yù)鋪Matrigel膠,其他步驟與遷移實驗相同。

1.4.7Western blot檢測ERK/GSK-3β/β-catenin信號相關(guān)蛋白的表達 分別提取shENST0000045 2996.1和shCtrl感染細胞48 h的全細胞蛋白,Western blot法分別檢測ERK1/2、p-ERK1/2、GSK-3β、p-GSK-3βSer9、β-catenin和p-β-catenin蛋白表達,以β-actin作為內(nèi)參照。采用細胞核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白,檢測細胞核β-catenin蛋白表達,以Histone H3作為內(nèi)參照,分別分析各種蛋白相對表達量。此外,shENST00000452996.1感染細胞的同時,分別加入ERK激動劑EGF(40 μg·L-1)和GSK-3β抑制劑TDZD-8(20 μmol·L-1)作用48 h,檢測全細胞ERK1/2、p-ERK1/2、p-GSK-3βSer9、GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin及細胞核β-catenin的蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果TCGA數(shù)據(jù)集50對HCC組織和癌旁組織中,與癌旁組織相比,HCC組織中ENST00000452996.1表達明顯增高(Fig1A)。分析365例具有完整Edmondson-Steiner分級臨床信息發(fā)現(xiàn),高表達的ENST00000452996.1與Edmondson-Steiner分級密切相關(guān)(Tab1),分析367例具有完整TNM分期臨床信息和347例具有完整病理分期臨床信息發(fā)現(xiàn),ENST00000452996.1表達與TNM分期和病理分期均不相關(guān)。對326例具有完整生存期的臨床資料進行Kaplan-Meier分析顯示,高表達的ENST00000452996.1與患者低生存率緊密相關(guān),見Fig1B。

Tab1 Relationship between lncRNA ENST00000452996.1 expression and clinicopathological parameters in HCC using TCGA database

Fig1 The expression level of lncRNA ENST00000452996.1 in HCC tissues based on TCGA database

2.2 lncRNA ENST00000452996.1在HCC細胞系中的表達及亞細胞定位采用qRT-PCR法檢測ENST00000452996.1在HCC細胞系中的表達。如Fig2A所示,ENST00000452996.1在Huh-7、JHH-7、Hep3B和HepG2細胞中均有表達。采用FISH法檢測ENST00000452996.1的亞細胞定位,發(fā)現(xiàn)其主要位于細胞質(zhì)中(Fig2B)。

Fig2 lncRNA ENST00000452996.1 expression levels and cellular distribution in

2.3 干擾lncRNA ENST00000452996.1表達對Huh-7細胞增殖能力的影響CCK-8結(jié)果顯示(Fig3A),與shCtrl組比較,shENST00000452996.1作用Huh-7細胞24 h,其吸光度值無明顯變化,從48 h開始,吸光度值隨著時間增加而明顯下降,提示細胞增殖能力減弱?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示(Fig3B、3C),干擾ENST00000452996.1表達后,細胞的集落形成數(shù)量明顯少于shCtrl對照組。結(jié)果提示,shENST 00000452996.1抑制細胞增殖,表明ENST0000045 2996.1促進肝癌細胞增殖。

Fig3 Effect of shENST00000452996.1 on proliferation

2.4 干擾lncRNA ENST00000452996.1表達對Huh-7細胞凋亡的影響流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示(Fig4),與shCtrl組比較,shENST00000452996.1作用48 h后,凋亡細胞明顯增加,提示其促進細胞凋亡,表明ENST00000452996.1抑制Huh-7細胞凋亡。

Fig4 Effect of shENST00000452996.1 on apoptosis of Huh-7 n=3)

2.5 干擾lncRNA ENST00000452996.1表達對Huh-7細胞遷移、侵襲的影響劃痕實驗結(jié)果顯示(Fig5A、5B),劃痕處的創(chuàng)面愈合率由shCtrl組的(27.6±6.2)%降至shENST00000452996.1組的(14.8±2.9)%,提示干擾ENST00000452996.1表達可明顯降低細胞的遷移能力。Transwell實驗結(jié)果顯示(Fig5C、5D),與shCtrl組比較,shENST000 00452996.1組細胞的遷移和侵襲能力均明顯減弱。結(jié)果提示shENST00000452996.1抑制細胞的遷移和侵襲,表明ENST00000452996.1能夠促進肝癌細胞遷移和侵襲。

Fig5 Effects of lncRNA ENST00000452996.1 knockdown on migration and invasion of Huh-7

2.6 干擾lncRNA ENST00000452996.1表達對肝癌細胞ERK/GSK-3β/β-catenin信號通路的影響為了進一步探討ENST00000452996.1對肝癌細胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控機制,對ERK/GSK-3β/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達進行檢測。如Fig6所示,與shCtrl組比較,干擾ENST00000452996.1表達后,全細胞的p-ERK1/2、p-GSK-3βSer9和β-catenin表達均明顯下調(diào),而GSK-3β和p-β-catenin表達明顯上調(diào),細胞核β-catenin表達明顯下降。分別采用ERK1/2激動劑EGF、GSK-3β抑制劑TDZD-8激活或阻斷相應(yīng)通路的活性,Western blot結(jié)果顯示,與shENST00000452996.1組比較,EGF明顯提高干擾ENST00000452996.1表達后全細胞p-ERK1/2、p-GSK-3βSer9、β-catenin,以及核β-catenin的表達水平,降低了GSK-3β和p-β-catenin的表達水平;與shENST00000452996.1組比較,TDZD-8明顯提高干擾ENST00000452996.1表達后全細胞p-GSK-3βSer9、β-catenin及細胞核β-catenin的表達,明顯降低GSK-3β和p-β-catenin的表達。以上結(jié)果提示,干擾ENST00000452996.1表達通過ERK/GSK-3β/β-catenin信號通路,調(diào)控肝癌細胞惡性生物學(xué)行為,表明ENST00000452996.1通過調(diào)控ERK/GSK-3β/β-catenin信號通路,發(fā)揮促進肝癌細胞增殖、遷移、侵襲的作用。

Fig6 Effects of lncRNA ENST00000452996.1 knockdown on ERK/GSK-3β/β-catenin signaling

3 討論

近年來,相繼報道了許多l(xiāng)ncRNA參與HCC的發(fā)生發(fā)展,但只有少數(shù)lncRNA的功能與作用機制被研究。本研究報道了1個由人1號染色體CH17-172B3克隆上基因編碼的新lncRNA,AC245100.1,其生物學(xué)作用及相關(guān)機制尚未見報道。TCGA分析發(fā)現(xiàn),lncRNA AC245100.1的轉(zhuǎn)錄本之一ENST00000452996.1在HCC組織中呈現(xiàn)高表達,且與HCC組織Edmondson-Steiner分級及患者低生存率密切相關(guān),而Edmondson-Steiner分級是腫瘤預(yù)后的重要因素,由此提示ENST00000452996.1可能參與HCC發(fā)生發(fā)展過程[6]。

為了探討ENST00000452996.1的致癌作用及生物學(xué)功能,本研究通過構(gòu)建靶向ENST00000452 996.1的shRNA慢病毒載體,感染Huh-7細胞,檢測發(fā)現(xiàn)細胞的增殖、遷移和侵襲能力均減弱,細胞凋亡能力增強,表明ENST00000452996.1能夠增強肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲,并阻止細胞凋亡,提示其能夠促進HCC的惡性進展。鑒于ENST00000452 996.1促進肝癌細胞惡性生物學(xué)行為的作用,有必要對其致癌作用機制進行深入探討。

ERK/GSK-3β/β-catenin信號通路在腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[7],但ENST00000452996.1與ERK/GSK-3β/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系尚未見報道。本研究結(jié)果顯示,干擾ENST00000452996.1表達后,全細胞的ERK1/2總蛋白變化不明顯,p-ERK1/2、p-GSK-3βSer9、β-catenin和細胞核β-catenin表達均下調(diào),而GSK-3β和p-β-catenin表達增強。ERK1/2是被廣泛研究的絲裂原活化蛋白激酶信號通路調(diào)控因子,通過磷酸化激活下游轉(zhuǎn)錄因子,促進細胞因子和生長因子等的磷酸化,將細胞外信號向細胞核中逐級傳遞,促進腫瘤細胞增殖、分化等過程[8]。GSK3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,作用的底物包括轉(zhuǎn)錄因子、信號蛋白等百余種,參與調(diào)節(jié)糖代謝、細胞增殖、分化、遷移、凋亡等諸多事件[9]。有研究報道,活化ERK在Thr43位點磷酸化可以通過90 ku核糖體S6激酶(p90RSK)觸發(fā)GSK-3β絲氨酸9(Ser9)位點的磷酸化,導(dǎo)致GSK-3β失活[10]。本研究中,干擾ENST00000452996.1表達后,ERK1/2磷酸化受到抑制,GSK3β在Ser9位點上的磷酸化隨即也受到抑制,GSK-3β活性增加,β-catenin磷酸化增強,β-catenin核轉(zhuǎn)位受到抑制,說明ENST00000452996.1能夠增強ERK1/2的磷酸化,導(dǎo)致GSK3β在Ser9位點發(fā)生磷酸化,失活的GSK-3β與β-catenin解離,促進β-catenin的核轉(zhuǎn)位。細胞核β-catenin的積累是GSK-3β信號激活的關(guān)鍵事件,GSK-3β通路失活會導(dǎo)致細胞核中β-catenin的異常積累,GSK-3β信號通過磷酸化β-catenin,調(diào)控參與癌癥進展的細胞活動[11-12]。當(dāng)GSK-3β信號通路被激活時,β-catenin從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核,與T細胞轉(zhuǎn)錄因子(T cell factor,TCF)和淋巴增強因子(lymphoid enhancer factor,LEF)結(jié)合,觸發(fā)c-Myc、細胞周期蛋白D1、基質(zhì)金屬蛋白酶7等靶基因,以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標記物的轉(zhuǎn)錄,激活下游基因轉(zhuǎn)錄,促進腫瘤進展[13-14]。

為了進一步闡明ERK1/2與GSK-3β之間的關(guān)系,選用ERK1/2激動劑EGF處理干擾ENST00000452996.1表達后的細胞,消除了ERK1/2磷酸化受抑制的狀態(tài),此時GSK-3在Ser9位點的磷酸化得以恢復(fù),GSK-3β出現(xiàn)失活,意味著ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是GSK3β失活所必需的。TDZD-8是GSK-3β非ATP競爭性的小分子抑制劑,主要磷酸化GSK-3β的Ser9位點,從而降低GSK-3β的活性[15-16]。為了證實GSK-3β與β-catenin之間的關(guān)系,本研究證實了用TDZD-8處理干擾ENST00000 452996.1表達的細胞,GSK-3β在Ser9位點的磷酸化得以恢復(fù),削弱感染細胞GSK-3β的激活狀態(tài),降低對β-catenin的磷酸化,且GSK-3β與β-catenin解離,β-catenin核轉(zhuǎn)位效應(yīng)得以增強。進一步佐證了干擾ENST00000452996.1表達可以抑制ERK1/2磷酸化,繼而阻止GSK-3β的Ser9位點磷酸化,增加GSK-3β活性,導(dǎo)致β-catenin磷酸化,β-catenin核轉(zhuǎn)位受到抑制。推斷ENST00000452996.1通過ERK/GSK-3β/β-catenin信號通路,增強肝癌細胞增殖、遷移及侵襲能力,抑制細胞凋亡,從而發(fā)揮促進HCC的作用。

綜上所述,本研究報道了一種新的致癌lncRNA ENST00000452996.1,并發(fā)現(xiàn)其能夠通過ERK/GSK-3β/β-catenin途徑,促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力及抑制細胞的凋亡。研究結(jié)果為探尋HCC發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機制及靶基因防治研究提供了實驗依據(jù)和新思路。