劉偉萍,陳建芬,安金琪,羅 藝,劉鳳斌

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)1.第一附屬醫(yī)院脾胃病科、2.博士后科研流動(dòng)站、3.第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405;4. 廣東燕嶺醫(yī)院中醫(yī)骨傷科,廣東 廣州 510507;5.粵北人民醫(yī)院中醫(yī)科,廣東 韶關(guān) 512000;6.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院白云分院內(nèi)一科,廣東 廣州 510000)

目前,肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原發(fā)性肝癌的90%,全球每年的發(fā)病率將可能超過(guò)100萬(wàn)例[1],5年的總生存率僅10%～18%[2],是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。HCC可由慢性乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、嗜酒,以及與糖尿病和肥胖相關(guān)的代謝綜合征引起[3]。目前,HCC的常規(guī)治療包括肝移植、手術(shù)切除、經(jīng)皮消融、放療及靶向藥物治療[4]。大約50%的HCC患者接受靶向藥物治療,傳統(tǒng)一線治療藥物為索拉非尼或侖伐替尼,二線藥物為瑞戈非尼、卡博替尼或雷莫西魯單抗[3]。然而,只有10%的HCC患者被治愈,大多數(shù)患者最終發(fā)展為晚期,甚至發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1],且容易出現(xiàn)耐藥性、副作用明顯,導(dǎo)致患者生存時(shí)間短、生活質(zhì)量差。因此,迫切需要尋找有效和安全的藥物防治HCC。

天然產(chǎn)物在HCC的防治中越來(lái)越重要[5-6],裙帶菜作為藥食同源的天然海產(chǎn)物,具有產(chǎn)量大、口感好、價(jià)格低廉和開發(fā)簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)。而裙帶菜多糖(sulfated polysaccharide fromUndariapinnatifida,SPUP)也已被證實(shí)具有抗腫瘤、降糖、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗凝等多種活性[7-9]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)了SPUP可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[10]。值得注意的是,SPUP可通過(guò)活性氧介導(dǎo)的線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡[11];另外,SPUP可通過(guò)SIRT1/p53通路抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性、遷移和侵襲[9,12]。然而,SPUP對(duì)HCC細(xì)胞增殖和遷移的進(jìn)一步作用及相關(guān)機(jī)制尚未明確。本研究旨在探討SPUP對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響及潛在的機(jī)制,為安全有效地使用SPUP防治HCC提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721、L-02細(xì)胞(貨號(hào):CL-0103、CL-0216、CL-0111),均購(gòu)自中國(guó)武漢普諾賽公司。

1.2 藥物與試劑SPUP的制備和鑒定參見(jiàn)前期研究已發(fā)表文獻(xiàn)[10]。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶(中國(guó)武漢普諾賽公司,貨號(hào):PM150210A、164210、PB180225);MTT(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào):91466);Hoechst 33258染色試劑盒、結(jié)晶紫、DAPI(上海碧云天公司,貨號(hào):C0003、C0121、C1005);Transwell小室、Matrigel膠(美國(guó)Corning公司,貨號(hào):3460、354234);LC3B、vimentin、E-cadherin、Bcl-2、Bax、caspase-3、SQSTM1/p62、Beclin-1、MMP-2、MMP-9、β-actin一抗,以及Alexa Fluor? 488山羊抗兔熒光二抗、Alexa Fluor? 594山羊抗小鼠熒光二抗(美國(guó)CST公司,貨號(hào):83506S、5741S、14472S、4223S、41162S、9662S、39749S、3495S、40994S、13667S、3700S、4412S、8890S)。

1.3 主要儀器超凈臺(tái)(Protect-2FD-S,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);光學(xué)顯微鏡(DMil,德國(guó)Leica公司);熒光顯微鏡(IX73,德國(guó)Leica公司);酶標(biāo)儀(MUltiskan GO,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);化學(xué)顯影儀(ChemiDoc MP,美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HepG2、SMMC-7721和L-02細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)胰酶消化傳代,細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞以3 000個(gè)/孔接種在96孔板中,待貼壁后,加入不同濃度的SPUP(25、50、100、200、400、800、1 000 mg·L-1)干預(yù)24、48、72 h后,加入MTT,繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育4 h后,加入DMSO,酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)以1 000個(gè)/孔的密度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC細(xì)胞接種到6孔板中,過(guò)夜貼壁后,加入SPUP(400、800、1 000 mg·L-1)培養(yǎng)6 h,然后換新鮮的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)14天后,用4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,計(jì)數(shù)并拍照。

2.4 Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡根據(jù)試劑盒說(shuō)明書,以4×105個(gè)/孔的密度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC細(xì)胞接種在6孔板中,分別加入SPUP(400、800、1 000 mg·L-1)干預(yù)48 h后,固定液固定,加入Hoechst 33258染色,熒光顯微鏡下觀察藍(lán)色的細(xì)胞核。

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)以6×105個(gè)/孔的密度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC細(xì)胞接種在6孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿后,用槍頭垂直于孔板劃痕,PBS洗去脫落的細(xì)胞,加入SPUP(400、800、1 000 mg·L-1)干預(yù)0、24 h后,在光學(xué)顯微鏡下拍照,ImageJ軟件測(cè)量每組劃痕的寬度。

2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)以1 ∶8的比例將Matrigel基質(zhì)膠用DMEM培養(yǎng)基稀釋后,鋪在Transwell上室,放進(jìn)培養(yǎng)箱凝固后,每孔加入含1×105個(gè)HCC細(xì)胞及SPUP(400、800、1 000 mg·L-1)的無(wú)血清培養(yǎng)基,下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。48 h后取出上室,棉簽擦拭微孔膜內(nèi)側(cè),清洗后,多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,晾干,光學(xué)顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)。

2.7 免疫熒光法為了檢測(cè)LC3B、vimentin和E-cadherin的表達(dá),將HCC細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到24孔板中,過(guò)夜使其貼壁。然后分別用SPUP(400、800、1 000 mg·L-1)處理細(xì)胞48 h,多聚甲醛固定,0.2% Triton X-100通透細(xì)胞。5% BSA中封閉60 min后,加入一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,隨后與熒光偶聯(lián)二抗室溫孵育1 h。室溫下DAPI染細(xì)胞核,熒光顯微鏡下檢測(cè)。

2.8 Western blot檢測(cè)凋亡及遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)以4×105個(gè)/孔的密度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC細(xì)胞接種在6孔板中,SPUP(400、800、1 000 mg·L-1)處理細(xì)胞48 h后,用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液提取細(xì)胞蛋白。定量的蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE凝膠上電泳,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5% BSA室溫封閉,加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜,再在室溫下孵育二抗?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影,ImageLab軟件成像和定量。

3 結(jié)果

3.1 SPUP抑制HCC細(xì)胞增殖如Fig1A、1B所示,SPUP對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞活性均表現(xiàn)出明顯的抑制作用,并呈時(shí)間和濃度依賴性,而對(duì)人正常肝細(xì)胞L-02無(wú)明顯的抑制作用(Fig1C),表明SPUP可能是一種具有選擇性殺傷肝癌細(xì)胞的候選天然化合物。SPUP對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的IC50值在24 h分別為1 234、1 187 mg·L-1,48 h分別為496.5、343.1 mg·L-1,在72 h分別為250.5、128.4 mg·L-1。此外,SPUP明顯降低了HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的克隆形成能力(P<0.01),進(jìn)一步驗(yàn)證了SPUP干預(yù)對(duì)HCC細(xì)胞活性的長(zhǎng)期抑制作用(Fig1D、1E)。

Fig1 Effects of SPUP on cell viability of HCC cells and normal liver

3.2 SPUP誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡由于SPUP對(duì)兩種HCC細(xì)胞增殖均有抑制作用,進(jìn)一步研究了SPUP是否會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示(Fig2A),SPUP處理后,核藍(lán)色染色強(qiáng)度增強(qiáng),更容易觀察到凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及凋亡的典型形態(tài)學(xué)特征,如染色質(zhì)凝集、細(xì)胞核多裂、固縮,且呈劑量依賴性。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)(Fig2B-D),結(jié)果顯示SPUP可上調(diào)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3的蛋白表達(dá),并下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。提示SPUP可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而抑制HCC細(xì)胞生長(zhǎng)。

Fig2 SPUP augmented apoptosis in HCC cell

3.3 SPUP刺激HCC細(xì)胞自噬如Fig3A所示,SPUP處理HepG2細(xì)胞后,LC3B的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。同時(shí),SPUP干預(yù)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞后,Beclin-1的蛋白表達(dá)明顯增加,p62的表達(dá)明顯減弱(Fig3B-D)。提示自噬可能是SPUP抑制HCC細(xì)胞增殖的機(jī)制。

Fig3 SPUP induced autophagy in HCC cell

3.4 SPUP抑制HCC細(xì)胞的遷移、侵襲能力繼續(xù)觀察了SPUP對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示(Fig4A-C),SPUP干預(yù)后,劃痕愈合程度明顯減弱,遷移率下降(P<0.01)。如Fig4D-G所示,通過(guò)Transwell上室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)。結(jié)果提示,SPUP干預(yù)后削弱了HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

Fig4 SPUP inhibited HCC cell metastasis and

3.5 SPUP抑制HCC細(xì)胞EMT和MMPs表達(dá)考慮到SPUP在兩種HCC細(xì)胞中均能抑制遷移和侵襲性,其作用是否與調(diào)控EMT過(guò)程相關(guān)尚不清楚。免疫熒光結(jié)果顯示(Fig5A),SPUP下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物vimentin水平,上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin水平,提示SPUP的抗轉(zhuǎn)移作用可能與EMT機(jī)制相關(guān)。由于基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲,因而檢測(cè)了SPUP對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響。結(jié)果顯示(Fig5B-D),SPUP可明顯抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá),表明SPUP的抗遷移、侵襲能力可能與抑制MMPs相關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SPUP對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。

Fig5 SPUP inhibited EMT and

4 討論

目前,高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍然是HCC患者高死亡率的主要原因。傳統(tǒng)治療耐藥性高、副作用明顯、費(fèi)用昂貴,因此,越來(lái)越多HCC患者求助于補(bǔ)充替代醫(yī)學(xué),尤其是天然化合物[6]。相關(guān)體內(nèi)及體外研究已證實(shí)SPUP具有抗HCC的作用[9],本研究也發(fā)現(xiàn)SPUP可明顯抑制兩種HCC細(xì)胞的增殖,這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[9,11-12]。另外,SPUP對(duì)正常肝細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用,這些結(jié)果表明SPUP可能通過(guò)調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖和死亡來(lái)抑制HCC的發(fā)生,可能是一種安全有效治療HCC的候選天然產(chǎn)物。

腫瘤細(xì)胞通常會(huì)獲得細(xì)胞凋亡抵抗力,導(dǎo)致癌細(xì)胞過(guò)度增殖,因此,靶向細(xì)胞凋亡已被證實(shí)為一種有效的癌癥治療策略[13]。線粒體細(xì)胞凋亡始于導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡的內(nèi)源性信號(hào)。Bcl-2激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào),導(dǎo)致Bax的釋放,從而改變線粒體膜的結(jié)構(gòu),并打開線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)。然后,Cyt-c和其他促凋亡分子通過(guò)MPTP釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中,Cyt-c與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor 1,Apaf-1)結(jié)合,從而增強(qiáng)Apaf-1的聚合能力。Apaf-1/Cyt-c復(fù)合物可以結(jié)合ATP/dATP并連接到caspase募集區(qū),從而募集caspase-9,并啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終激活caspase-3誘導(dǎo)凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)SPUP可以上調(diào)Bax和cleaved caspase-3的蛋白表達(dá),并下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),表明SPUP抑制HCC細(xì)胞增殖,可能是由于誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的凋亡。

除了細(xì)胞凋亡,自噬也是腫瘤細(xì)胞死亡的一種獨(dú)特模式。自噬與通過(guò)消化細(xì)胞內(nèi)大分子和細(xì)胞器產(chǎn)生的能量和代謝物有關(guān),可啟動(dòng)正常的細(xì)胞死亡過(guò)程,抑制腫瘤生長(zhǎng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明,自噬和凋亡通常發(fā)生在同一細(xì)胞內(nèi),自噬可作為細(xì)胞凋亡的上游調(diào)控機(jī)制[15]。本研究發(fā)現(xiàn)SPUP可調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、p62和LC3B的表達(dá),因此,推斷SPUP介導(dǎo)的自噬可能促進(jìn)HCC細(xì)胞死亡。

除了上述細(xì)胞凋亡和自噬調(diào)節(jié)機(jī)制外,SPUP還能抑制HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在腫瘤EMT中,上皮細(xì)胞和基質(zhì)周圍的腫瘤細(xì)胞失去其極性和黏附特性,在形態(tài)上變得與成纖維細(xì)胞相似,從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力[16]。另外,腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移需要消除細(xì)胞間接觸,EMT過(guò)程中上皮細(xì)胞分化成的間質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)蛋白水解酶降解ECM,降低E-cadherin表達(dá),而MMPs是降解ECM成分最重要的酶,從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力[17-18]。本研究中,SPUP可抑制EMT標(biāo)志物vimentin、MMPs標(biāo)志物MMP-2和MMP-9表達(dá),促進(jìn)E-cadherin的表達(dá),表明SPUP抑制HCC細(xì)胞遷移、侵襲的機(jī)制可能與抑制HCC細(xì)胞的EMT和MMPs相關(guān)。

上述結(jié)果表明了SPUP在抑制HCC方面的潛在作用,其可抑制HCC細(xì)胞增殖,可能與細(xì)胞程序性死亡(自噬和凋亡)相關(guān)。另外,SPUP可抑制HCC細(xì)胞遷移和侵襲,可能與抑制EMT和MMPs相關(guān)。本研究可能為天然藥物SPUP用于未來(lái)HCC的防治提供新的線索。