徐志東,周軍偉,倪 超,柯希權(quán),馬振增,鄧曉晶,趙 睿,顧 林,任 志,鄭海倫

(1.蚌埠醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科,安徽 蚌埠 233030;2.伯楨生物類(lèi)器官研究院,上海 200438)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率已上升至世界惡性腫瘤的第3位,嚴(yán)重威脅人類(lèi)的身體健康[1]。盡管在早期診斷、手術(shù)切除、化療和放療等策略上取得了進(jìn)展,但結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)率仍然很高,患者的生存率并沒(méi)有提高[2]。此外,化療和放療往往與毒性和威脅生命的副作用有關(guān),這明顯影響患者的生活質(zhì)量。鑒于這些因素,有必要開(kāi)發(fā)更有效、副作用更少的針對(duì)結(jié)直腸癌通路的治療方法,并協(xié)同提高化療的療效。各種研究報(bào)道,幾種天然生物活性成分對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞具有抗增殖和抗癌作用。血根堿(sanguinarine, SNG)是一種存在于白屈菜和博落回等罌粟科及蕓香科植物中的苯并菲啶類(lèi)生物堿[3],其藥理具有多樣性,近年來(lái)對(duì)SNG進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)SNG可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制增殖以及抗侵襲、遷移等多方面發(fā)揮抗腫瘤功效[4],這些研究在多種類(lèi)型腫瘤中已被證實(shí),包括胰腺癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌等。有研究[5]發(fā)現(xiàn),SNG可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用,并在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中,SNG是腺苷酸激活蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase, AMPK)的變構(gòu)激活劑,可以引起細(xì)胞自噬和凋亡。AMPK不僅是調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和能量代謝的關(guān)鍵因子,同時(shí)還參與細(xì)胞在應(yīng)激條件下,通過(guò)消化功能失調(diào)的細(xì)胞器和蛋白質(zhì),實(shí)現(xiàn)自噬的過(guò)程,這在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移方面起重要的作用[6]。

類(lèi)器官是指在體外實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的3D培養(yǎng)和擴(kuò)增,形成結(jié)構(gòu)和功能與原組織高度相似的微型器官,擁有新陳代謝和自我組裝的能力,是目前唯一的人源性組織水平的研究手段,患者源性的類(lèi)器官是近來(lái)出現(xiàn)的新型臨床前模型[7]。結(jié)直腸癌類(lèi)器官是從患者手術(shù)切除的腫瘤組織內(nèi)提取的結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),這種模型可模擬患者體內(nèi)環(huán)境,其對(duì)化療藥的敏感性也更強(qiáng)。與動(dòng)物模型相比,類(lèi)器官模型的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)周期短,操作簡(jiǎn)便,且患者源性的類(lèi)器官更具有人源性和近生理性[8],與細(xì)胞系相比,類(lèi)器官模型是3D培養(yǎng),研究人員可以更直接的觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)變化和特征[9],因此,在未來(lái)腫瘤領(lǐng)域的研究與應(yīng)用方面,類(lèi)器官模型具有重要的意義和價(jià)值。目前SNG在結(jié)直腸癌方面的報(bào)道較少,且在結(jié)直腸癌類(lèi)器官上尚未見(jiàn)到研究。本研究中,主要探討了SNG對(duì)結(jié)直腸癌類(lèi)器官生長(zhǎng)的影響,并探究與AMPK信號(hào)通路之間的關(guān)系,以期為SNG用于臨床治療結(jié)直腸癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源本研究有關(guān)結(jié)直腸癌的實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)的監(jiān)督指導(dǎo)下完成(倫理批件號(hào):2023YJS122)。結(jié)直腸癌腫瘤組織取自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者,樣本的獲取已獲得患者的知情同意。

1.2 主要試劑和耗材SNG(MCE,HY-N0052)、3-MA(MCE,HY-19312)、CCK-8檢測(cè)盒(MCE,HY-K0301),Advanced DMEM/ F12(Gibco,12634010)、PBS(Gibco,C10010500BT)、結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)基(海伯楨生物,K2103-CR-500)、Matrigel膠(上海伯楨生物,M315066)、ATP檢測(cè)試劑盒(上海伯楨生物,E238003)、腫瘤組織消化液(上海伯楨生物,K601003-500)、紅細(xì)胞裂解液(上海伯楨生物,E238010-100)、類(lèi)器官消化液(上海伯楨生物,E238001-500)、RIPA裂解緩沖液(上海碧云天,P0013C)、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天,P0012)、4%多聚甲醛固定液(上海碧云天,P0099)、蘇木精-伊紅染色試劑盒(上海碧云天,C0105M)、Ki67抗體(Mouse,BD)、CK20抗體(Mouse,Santa)、CK7抗體(Mouse,Santa)、Ep-CAM抗體(Mouse,Santa)、鼠二抗(Santa)、AMPK抗體(CST,2532)、p-AMPK抗體(CST,2531)、mTOR抗體(CST,2972)、p-mTOR抗體(CST,2971)、p62抗體(CST,5114)、Beclin1抗體(CST,3738)、GAPDH抗體(Abcam,ab8245)、HRP標(biāo)記山羊抗兔(Abcam,ab6721)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠(Abcam,ab6728)。

1.3 結(jié)直腸癌細(xì)胞分離及培養(yǎng)在無(wú)菌培養(yǎng)皿中,用含2%雙抗的PBS溶液震蕩洗滌結(jié)直腸癌手術(shù)切除腫瘤組織3～5次后,剪碎成0.5～1 mm3的組織碎片,加入10 mL的腫瘤原代消化液,37 ℃搖床消化30～40 min,使結(jié)直腸癌細(xì)胞逐漸從組織碎片中脫落,之后再加入終濃度為2%的FBS,終止消化。300 r·min-1離心3 min,棄上清,加入1 mL Advanced DMEM/F12溶液重懸。使用100 μm的濾網(wǎng)過(guò)濾,收集濾液,加入1 mL的紅細(xì)胞裂解液吹打混勻,靜置1 min,去除其中的紅細(xì)胞,300 r·min-1離心3 min,棄上清,臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù),用Matrigel膠包裹重懸的細(xì)胞沉淀,24孔板接種。接種密度:腫瘤細(xì)胞5×104個(gè)/孔,Matrigel膠25 μL/孔。將24孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中20 min,加入結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)基500 μL/孔,將24孔板放置在37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每隔2 d觀察細(xì)胞狀態(tài)和類(lèi)器官形成數(shù)量,3 d后給類(lèi)器官換液,視類(lèi)器官生長(zhǎng)情況進(jìn)行傳代,一般7 d左右。

1.4 HE染色將腫瘤組織置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h,并收集已培養(yǎng)7 d的成熟的結(jié)直腸癌類(lèi)器官,固定于4%多聚甲醛溶液中1 h,固定成功后用3%瓊脂糖包埋類(lèi)器官。對(duì)組織和類(lèi)器官進(jìn)行乙醇梯度脫水,二甲苯透明(類(lèi)器官10 min、腫瘤組織20 min),浸蠟(類(lèi)器官2 h、腫瘤組織3 h)。石蠟包埋后,4 ℃過(guò)夜,再進(jìn)行石蠟切片(5 μm)、攤片、烤片。樣本切片進(jìn)行脫蠟、復(fù)水、蘇木精(60 s)、水洗(1 min)、伊紅(5 min)、乙醇梯度脫水、二甲苯、封片、鏡檢。

1.5 免疫組化染色將腫瘤組織置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h,并收集已培養(yǎng)7 d的成熟的結(jié)直腸癌類(lèi)器官,固定于4%多聚甲醛溶液中1 h,固定成功后用3%瓊脂糖包埋類(lèi)器官。對(duì)組織和類(lèi)器官進(jìn)行乙醇梯度脫水,二甲苯透明(類(lèi)器官10 min,腫瘤組織20 min),浸蠟(類(lèi)器官2 h,腫瘤組織3 h)。石蠟包埋后,再進(jìn)行切片(5 μm)、攤片、烤片。脫蠟水化后加入枸櫞酸鹽溶液,高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)15～20 min,室溫冷卻,3%過(guò)氧化氫室溫孵育(15 min),水洗(10 min),加入4% BSA進(jìn)行封閉,室溫孵育1 h,敷一抗,4 ℃過(guò)夜。PBS 10 min/3 次,敷二抗1 h,PBS 10 min/3 次,DAB顯色90 s,蘇木精(90 s),鹽酸酒精分化(2 s),水洗(1 min),溫水返藍(lán)(5 min),乙醇梯度脫水,二甲苯,封片,鏡檢。

1.6 CCK-8細(xì)胞活力將結(jié)直腸癌類(lèi)器官去膠,消化成單細(xì)胞,用Matrigel膠包裹并接種于96孔板中,接種密度:2 000個(gè)細(xì)胞/孔,2 d后,用不同濃度SNG(0.1、0.3、1、3、9、27 μmol·L-1)處理類(lèi)器官,每組3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)置DMSO對(duì)照組,培養(yǎng)3d。CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒,加入CCK-8溶液(10 μL/孔),37 ℃孵育2 h,450 nm處檢測(cè)吸光度,計(jì)算細(xì)胞存活率和藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。檢測(cè)的時(shí)間選擇類(lèi)器官生長(zhǎng)的d 3、d 6、d 9。

1.7 Western blot檢測(cè)將結(jié)直腸癌類(lèi)器官消化成細(xì)胞團(tuán)塊,用Matrigel膠包裹并接種于24孔板中,接種密度:1×105個(gè)細(xì)胞/孔,0.5、1、2 μmol·L-1濃度SNG處理,培養(yǎng)3 d。分別收集不同處理組的類(lèi)器官,消化1 min,吹打去膠,并制備成細(xì)胞懸液,加入RIPA裂解緩沖液(冰上裂解30 min),BCA蛋白定量法計(jì)算上樣量,SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,封閉1 h,與AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、p62和Beclin1一抗孵育(4 ℃過(guò)夜),室溫敷二抗(搖床1 h),ECL試劑盒顯影,凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.8 ATP含量檢測(cè)將結(jié)直腸癌類(lèi)器官去膠,消化成單細(xì)胞,用Matrigel膠包裹并接種于96孔板中,接種密度:2 000 個(gè)細(xì)胞/孔,2 d后,用3 μmol·L-1SNG單藥組、3 mmol·L-1AMPK抑制劑單藥組(3-MA)以及SNG協(xié)同3-MA聯(lián)合組處理類(lèi)器官,培養(yǎng)3 d。此外,用Matrigel膠包裹并接種于96 孔板中,2 000個(gè)細(xì)胞/孔,2 d后,設(shè)置SNG(1 μmol·L-1)分別與不同濃度臨床化療藥組(奧沙利鉑:0.21、0.62、1.85、5.56、15.56、50 μmol·L-1;伊立替康: 0.21、0.62、1.85、5.56、15.56、50 μmol·L-1;5-氟尿嘧啶:0.21、0.62、1.85、5.56、15.56、50 μmol·L-1)以及化療藥單藥組(奧沙利鉑:0.21、0.62、1.85、5.56、15.56、50 μmol·L-1;伊立替康: 0.21、0.62、1.85、5.56、15.56、50 μmol·L-1;5-氟尿嘧啶:0.21、0.62、1.85、5.56、15.56、50 μmol·L-1),協(xié)同處理結(jié)直腸癌類(lèi)器官,培養(yǎng)3 d。使用ATP酶檢測(cè)試劑盒,按照說(shuō)明書(shū),每孔中加入50 μL的ATP檢測(cè)試劑和50 μL的Advanced DMEM/F12,充分混勻,37 ℃孵育30 min,通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè),計(jì)算ATP相對(duì)含量。檢測(cè)的時(shí)間選擇藥物處理后的d 3。

2 結(jié)果

2.1 患者源性結(jié)直腸癌類(lèi)器官構(gòu)建顯微鏡下觀察原代結(jié)直腸癌類(lèi)器官的構(gòu)建過(guò)程,在結(jié)直腸癌培養(yǎng)基的培養(yǎng)下,腫瘤組織碎片和細(xì)胞團(tuán)塊不斷的進(jìn)行生長(zhǎng)與擴(kuò)增,48～72 h組織碎片就可以出現(xiàn)形態(tài)為囊腺樣的三維細(xì)胞團(tuán),形成囊樣結(jié)構(gòu),3～5 d后逐漸擴(kuò)增并形成結(jié)直腸癌類(lèi)器官(Fig1),d 7,類(lèi)器官平均直徑可以生長(zhǎng)到150～250 μm,表明類(lèi)器官完成初步構(gòu)建。原代培養(yǎng)7 d后,形成成熟的結(jié)直腸癌類(lèi)器官,可以進(jìn)行傳代。培養(yǎng)成熟的結(jié)直腸癌類(lèi)器官能在體外維持其形態(tài)學(xué)特征的穩(wěn)定性,并且可以維持傳代10代以上(Fig2),此外,可以進(jìn)行凍存,復(fù)蘇后的類(lèi)器官仍具有良好的細(xì)胞活性。

Fig1 Growth of patient-derived colorectal cancer organoids in primary culture

Fig2 Subculture and resuscitation of colorectal cancer organoids over 10 generations

2.2 患者源性結(jié)直腸癌類(lèi)器官的形態(tài)特征類(lèi)器官是可以自我組裝的細(xì)胞集合體,HE染色顯示(Fig3),類(lèi)器官中細(xì)胞自我組織的細(xì)胞排列形態(tài)與結(jié)直腸癌原組織的細(xì)胞排列形態(tài)幾乎一致。腫瘤細(xì)胞形態(tài)的異質(zhì)性高,排列不規(guī)則,細(xì)胞多核,細(xì)胞核染色大而深。通過(guò)免疫組化染色(Fig4),檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物CK20、CK7、Ki67、Ep-CAM的表達(dá)。腸癌標(biāo)志物CK20在上皮性腫瘤組織和類(lèi)器官中表達(dá),CK7表達(dá)陰性,Ki67促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,Ep-CAM陽(yáng)性顯示,對(duì)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有作用。通過(guò)HE和免疫熒光的鑒定,提示結(jié)直腸癌類(lèi)器官已構(gòu)建成功。

Fig3 HE staining of colorectal cancer tissues and organoids

Fig4 Immunohistochemical staining of colorectal cancer tissue and organoids

2.3 SNG對(duì)患者源性結(jié)直腸癌類(lèi)器官生長(zhǎng)影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著SNG濃度的升高,結(jié)直腸癌類(lèi)器官的細(xì)胞存活率逐漸下降(P<0.05),在光鏡下(Fig5),類(lèi)器官的生長(zhǎng)狀況也隨SNG濃度的增加,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯,類(lèi)器官逐漸碎裂,6例患者結(jié)直腸癌類(lèi)器官經(jīng)藥物作用并計(jì)算出IC50(72 h):CRC1為2.818 μmol·L-1,CRC2為2.285 μmol·L-1,CRC3為2.571 μmol·L-1,CRC4為2.457 μmol·L-1,CRC5為2.091 μmol·L-1,CRC6為2.877 μmol·L-1。在SNG 2 μmol·L-1的濃度處理下(Fig6),隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長(zhǎng),類(lèi)器官細(xì)胞的存活率也逐漸下降(P<0.05)。以上表明,SNG可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖,并且結(jié)直腸癌類(lèi)器官的生長(zhǎng),在SNG的濃度和處理時(shí)間上都有依賴性。

Fig5 Effect of different concentrations of sanguinarine on organoid growth in colorectal cancer

Fig6 Effect of sanguinarine treatment time on organoid growth in colorectal Effe)

2.4 SNG對(duì)結(jié)直腸癌類(lèi)器官相關(guān)蛋白的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig7),與DMSO對(duì)照組相比,低濃度SNG組(0.5 μmol·L-1)處理可使類(lèi)器官中p-AMPK的表達(dá)升高,調(diào)控生長(zhǎng)代謝的mTOR和p-mTOR的表達(dá)下降,而高濃度SNG組(2 μmol·L-1)的p-AMPK、mTOR和p-mTOR蛋白水平變化最大,提示SNG抑制結(jié)直腸癌類(lèi)器官的生長(zhǎng)形成可能與p-AMPK和p-mTOR表達(dá)有關(guān),且自噬相關(guān)蛋白p62和Beclin1的蛋白表達(dá)水平隨著SNG的劑量增加也逐漸升高,提示SNG可能與結(jié)直腸癌類(lèi)器官的自噬有關(guān)。

Fig7 Effect of sanguinarine on expression of APMK/mTOR-related proteins in colorectal cancer

2.5 SNG聯(lián)合AMPK抑制劑對(duì)結(jié)直腸癌類(lèi)器官生長(zhǎng)的影響3-MA作為AMPK的抑制劑,可以抑制AMPK的磷酸化,通過(guò)ATP含量檢測(cè)(Fig8),與2 μmol·L-1SNG處理組相比,聯(lián)合組中3-MA減緩了SNG導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制,細(xì)胞存活率明顯增加,提示SNG抑制結(jié)直腸癌類(lèi)器官的生長(zhǎng)形成可能是通過(guò)促進(jìn)p-AMPK表達(dá)導(dǎo)致的。

Fig8 Effect of 3-MA combined with sanguinarine on organoid growth

2.6 臨床化療藥單用及聯(lián)合SNG應(yīng)用對(duì)結(jié)直腸癌類(lèi)器官的影響SNG和臨床化療藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用明顯高于臨床化療藥單用藥組(Fig9)。通過(guò)ATP含量檢測(cè),計(jì)算聯(lián)合藥物組和單藥組的IC50,通過(guò)3例患者的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示,聯(lián)合用藥普遍可以增強(qiáng)單藥組對(duì)結(jié)直腸癌類(lèi)器官生長(zhǎng)的抑制性,當(dāng)奧沙利鉑或伊立替康在患者來(lái)源的結(jié)直腸類(lèi)器官上出現(xiàn)耐藥情況時(shí),SNG的聯(lián)合作用仍可以有效抑制類(lèi)器官的生長(zhǎng),SNG具有協(xié)同臨床化療藥對(duì)結(jié)直腸癌的抑制作用。

Fig9 Effect of sanguinarine combined with clinical chemotherapeutic agents on organoid growth in colorectal cancer

3 討論

類(lèi)器官擁有類(lèi)似真實(shí)器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu),并可以模擬出來(lái)源組織或器官的部分生理結(jié)構(gòu)和功能[10]。患者源性的腫瘤類(lèi)器官因其更接近來(lái)源腫瘤和組織的生理結(jié)構(gòu),保留來(lái)源腫瘤的部分特定功能,并且結(jié)果也可以得出與臨床上患者更加相似的藥物反應(yīng),因此,腫瘤類(lèi)器官進(jìn)入了研究人員的視野。腫瘤類(lèi)器官的研究和應(yīng)用是最近的10年里,腫瘤關(guān)鍵的進(jìn)展之一。由于部分類(lèi)器官模型存在許多活性干細(xì)胞群,并且能夠在體外實(shí)現(xiàn)極大地?cái)U(kuò)增,因此,類(lèi)器官也可以被構(gòu)建成各類(lèi)發(fā)育或疾病模型[11],具有潛力無(wú)窮的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和廣闊和臨床診斷治療應(yīng)用前景。通過(guò)類(lèi)器官模型,研究人員可深入觀察人體的組織變化,更好地模擬疾病發(fā)生,發(fā)展的過(guò)程[12]。應(yīng)用結(jié)直腸癌類(lèi)器官模型,探究天然生物活性成分對(duì)結(jié)直腸癌及癌前病變的作用與機(jī)制是一個(gè)相當(dāng)有前景的方向。SNG是一種苯并菲啶類(lèi)生物堿,主要存在于蕓香科及藍(lán)堇科植物中,如博落回、白屈菜等[3],其藥理作用具有多樣性,近年來(lái)開(kāi)發(fā)這種生物堿成為癌癥選擇性藥物是醫(yī)學(xué)科研的熱點(diǎn)。

在本研究中,我們通過(guò)類(lèi)器官3D模型探究SNG對(duì)結(jié)直腸癌類(lèi)器官生長(zhǎng)的影響及可能的機(jī)制?；颊邅?lái)源的結(jié)直腸癌類(lèi)器官更具有人源性和近生理性,收集患者術(shù)后樣本,原代構(gòu)建結(jié)直腸癌類(lèi)器官,培養(yǎng)成熟的結(jié)直腸癌類(lèi)器官能在體外維持其形態(tài)學(xué)特征的穩(wěn)定性。通過(guò)HE染色,類(lèi)器官中細(xì)胞自我組織的細(xì)胞排列形態(tài)與結(jié)直腸癌原組織的細(xì)胞排列形態(tài)幾乎一致,排列不規(guī)則,細(xì)胞多核,細(xì)胞核染色大而深。免疫組化染色觀察,結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物Ki67、CK20、CK7、Ep-CAM表達(dá),通過(guò)鑒定,腸癌標(biāo)志物CK20在上皮性腫瘤組織和類(lèi)器官中表達(dá),CK7表達(dá)陰性,Ki67促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,Ep-CAM陽(yáng)性顯示,對(duì)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有作用,提示結(jié)直腸癌類(lèi)器官成功構(gòu)建。CCK-8結(jié)果表明,隨著SNG濃度的升高,結(jié)直腸癌類(lèi)器官的細(xì)胞活力呈劑量和時(shí)間依賴性降低,說(shuō)明SNG可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。自噬是細(xì)胞內(nèi)一種保守的自我降解系統(tǒng),在應(yīng)激條件下,對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要的作用,可以將細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和其他大分子傳遞到溶酶體中進(jìn)行降解,以滿足能量的供應(yīng)需求[13]。近幾年來(lái),Beclin1、p62是研究較多的自噬相關(guān)蛋白,Beclin1是自噬與腫瘤關(guān)聯(lián)的重要紐帶,參與自噬體膜形成,同時(shí)還可以誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生,在腫瘤中發(fā)揮重要作用[14]。p62的主要功能是參與蛋白泛素化及衰老、受損細(xì)胞器的循環(huán)周轉(zhuǎn),并隨降解產(chǎn)物包裹進(jìn)入自噬泡而被降解[15]。我們通過(guò)Western blot探究了不同濃度SNG對(duì)結(jié)直腸癌類(lèi)器官蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,SNG可以上調(diào)p62和Beclin1的表達(dá),且呈濃度依賴性。自噬主要受AMPK/mTOR信號(hào)通路、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和其他相關(guān)自噬信號(hào)通路的調(diào)控[16]。AMPK/mTOR信號(hào)通路作為調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典信號(hào)通路之一,為許多腫瘤提供了潛在的治療靶點(diǎn)。AMPK是真核細(xì)胞中高度保守的蛋白質(zhì),是細(xì)胞的“代謝和能量感受器”,可以在生理水平的代謝應(yīng)激下維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和能量平衡,細(xì)胞通過(guò)調(diào)控自身的新陳代謝以滿足能量供應(yīng)的需求[17]。mTOR是生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)信號(hào)的整合器,其主要功能是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期,它能整合上游的多種信號(hào)調(diào)控細(xì)胞的凋亡和自噬[18]。3-MA作為AMPK的抑制劑,可以抑制AMPK的磷酸化,我們使用3-MA處理腸癌類(lèi)器官,通過(guò)ATP含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),AMPK抑制劑可以減緩SNG對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,提示3-MA可能通過(guò)抑制SNG促進(jìn)的p-AMPK表達(dá)增加的作用。為了進(jìn)一步探究SNG對(duì)結(jié)直腸癌類(lèi)器官的抑制作用是否通過(guò)靶向AMPK/mTOR信號(hào)通路,因此,我們研究了不同濃SNG對(duì)類(lèi)器官所表達(dá)的AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR蛋白影響,Western blot的結(jié)果顯示,AMPK的表達(dá)基本沒(méi)有變化,而p-AMPK蛋白表達(dá)含量升高,且呈濃度依賴性。mTOR和p-mTOR的表達(dá)明顯降低,這個(gè)結(jié)果表明,SNG抑制結(jié)直腸癌類(lèi)器官生長(zhǎng)的作用可能與AMPK/mTOR信號(hào)通路磷酸化有關(guān)。SNG聯(lián)合臨床化療藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SNG與結(jié)直腸癌臨床化療藥奧沙利鉑、伊立替康、5-氟尿嘧啶協(xié)同對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制作用不僅在藥物濃度上有依賴作用,而且SNG聯(lián)合組明顯高于化療藥單用藥組。當(dāng)奧沙利鉑或伊立替康在患者來(lái)源的結(jié)直腸類(lèi)器官上出現(xiàn)耐藥情況時(shí),SNG的聯(lián)合作用仍可以有效抑制類(lèi)器官的生長(zhǎng),說(shuō)明SNG可以協(xié)同臨床化療藥治療結(jié)直腸癌。

綜上所述,SNG可能是一種很有前途的化療增敏劑,可以為將來(lái)開(kāi)發(fā)結(jié)直腸癌新型候選藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。