李啟航,馬紫微,張曼茹,于華青,葛鳳琴,宋雨晨,郭丹丹,趙 靜,杭鵬洲,朱 華

(1. 揚州大學臨床醫(yī)學院,蘇北人民醫(yī)院,江蘇 揚州 225001;2. 揚州大學醫(yī)學院,江蘇 揚州 225009;3. 大連醫(yī)科大學,遼寧 大連 116000)

膿毒癥是一種臨床上常見的嚴重感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,它通過感染誘發(fā)多種反應(yīng)異常,導致多個器官功能受損,最終導致器官衰竭甚至死亡。心臟是膿毒癥的重要靶器官之一,研究表明膿毒癥患者在發(fā)病早期可能出現(xiàn)器質(zhì)性心肌損傷,如心律失常、心力衰竭等[1]。膿毒癥會引起心肌細胞損傷,其機制包括炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等[2]。研究顯示,適度的炎癥反應(yīng)有助于防御多種病理刺激,但過度炎癥反應(yīng)則會造成器官損傷,甚至衰竭[3]。革蘭陰性菌細胞壁上存在的細菌內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),通過激活Toll 樣受體 4(Toll-like receptor 4, TLR4)來誘導機體產(chǎn)生多種病理生理炎癥反應(yīng)。這個過程會啟動IκB-NFκB信號通路,釋放大量的促炎因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α等,最終導致細胞程序性死亡[4]。由于TLR4在心肌細胞中表達較多,因此心臟是LPS的主要攻擊目標[5]。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是一種高度純化的影響感覺神經(jīng)元存活和纖維生長的神經(jīng)營養(yǎng)因子,主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)BDNF在多種細胞如心肌細胞、平滑肌細胞中表達,并且在心臟功能中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[7]。7,8-二羥基黃酮(7,8-dihydroxyflavone, 7,8-DHF)作為BDNF小分子模擬物,可以激活酪氨酸激酶受體B(tyrosine Kinase receptor B, TrkB)受體,在多種細胞損傷中發(fā)揮良好的保護作用[8],但其在炎癥刺激導致心肌細胞損傷中的作用尚不清楚。本研究旨在探究7,8-DHF在LPS誘導心肌細胞損傷中的作用以及可能的調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株本研究使用H9c2大鼠心肌細胞系,購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器7,8-DHF(阿拉丁,D137213),LPS(Sigma,L2880)。p-STAT3一抗 (Tyr705,CST,#9131);STAT3一抗 (CST,#4904);p-Akt一抗 (CST, #4060);Akt 一抗(CST,#4691);p65一抗(Abcam,ab32536);GAPDH一抗(中杉金橋,TA-08);Lamin B1 一抗(ABclonal,A16909);近紅外熒光二抗(LI-COR,925-32210/32211);Live/Dead活力/細胞毒性檢測試劑盒(Thermo,L3224);MitoSOX試劑線粒體超氧化物指示劑(Thermo,M36008);PMSF(碧云天,ST506);磷酸酶抑制劑(Roche,04906845001);細胞核蛋白與細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(碧云天,P0028);乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒(碧云天,C0017);總超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(碧云天,S01015);BCA試劑盒(碧云天;P0012);普通倒置顯微鏡(Olympus);蛋白電泳系統(tǒng)(BIO-RAD);全波長酶標儀(Bio-Tek);激光近紅外成像系統(tǒng)(LI-COR Odyssey CLx)。

1.3 主要方法

1.3.1細胞培養(yǎng)與處理 按比例取10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素加入高糖DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)H9c2細胞,采用含有EDTA的胰酶進行傳代培養(yǎng)。光學顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。將細胞隨機分為四組:對照組(Ctrl)、LPS組、LPS+7,8-DHF組、7,8-DHF單獨處理組。分別采用不同濃度LPS(1、5、10 mg·L-1)處理細胞24 h。通過細胞活力測定,篩選LPS的有效濃度用于后續(xù)實驗。在LPS加藥前30 min給予7,8-DHF(100 μmol·L-1)預處理,考察7,8-DHF對LPS誘導心肌細胞損傷的作用。

1.3.2細胞活力測定 按每孔200 μL,5×104個細胞數(shù)量的密度,將H9c2細胞接種于96孔板,待均勻分布后放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),采用MTT法檢測心肌細胞活力。待細胞完全貼壁長至約60%密度時進行藥物干預,24 h后棄去培養(yǎng)基加入150 μL MTT工作液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清后每孔加入200 μL DMSO,避光振蕩10 min溶解孔板內(nèi)甲瓚結(jié)晶,待完全溶解后使用酶標儀測定溶液在490 nm波長處的吸光度。

1.3.3細胞毒性測定 采用LDH細胞毒性檢測試劑盒檢測細胞毒性,按每孔200 μL,5×104個細胞數(shù)量的密度,將H9c2細胞接種于96孔板,待均勻分布后放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),加入LPS及不同濃度7,8-DHF藥物處理24 h后取細胞上清液,以2 ∶1的比例與配制好的LDH試劑混合于96孔板,室溫避光振蕩30 min后于酶標儀490 nm波長處測定吸光度。

1.3.4細胞氧化損傷測定 采用SOD試劑盒測定細胞氧化損傷程度, 吸凈細胞培養(yǎng)液,用4 ℃或冰浴預冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍,按照每106個細胞加入100-200 μL的比例加入SOD樣品制備液,適當吹打以充分裂解細胞; 4 ℃ 12 000×g離心3～5 min,取上清作為待測樣品。96孔板中加入上清液和SOD試劑37 ℃孵育30 min后于450 nm處測定吸光度。

1.3.5細胞活死染色 采用Live/Dead?活力/細胞毒性檢測試劑盒檢測活死細胞比例。將H9c2細胞混勻后接種于6孔板,待細胞生長鋪滿,每孔分別加入2 μmol·L-1Cal-AM和4 μmol·L-1EthD-1 37 ℃孵育15 min,最后采用熒光顯微鏡(Olympus IX83 with Prime BSI camera, Japan)進行觀察。綠染的細胞為活細胞,紅染的細胞為死細胞。使用ImagePro Plus圖像分析軟件(Media Cybernetics Inc, Silver Spring)進行分析。死細胞比例為死細胞占總細胞的百分比。

1.3.6線粒體ROS水平測定 將H9c2心肌細胞按分組接種于共聚焦小皿中,Mitosox熒光染料對線粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS水平進行檢測,并使用Hoechst藍色熒光標記細胞核,采用ImagePro Plus圖像分析軟件定量分析細胞ROS熒光強度。

1.3.7細胞總蛋白和核蛋白提取 經(jīng)處理的H9c2細胞在冰上用含有蛋白酶抑制劑PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖溶液提取總蛋白。根據(jù)操作說明,使用細胞核/細胞質(zhì)抽提試劑從H9c2細胞中提取細胞核蛋白。首先取適量細胞質(zhì)蛋白抽提試劑A與細胞核蛋白抽提試劑B于1.5 mL Ep管中,加入PMSF混勻后備用。細胞經(jīng)PBS多次洗滌后,加入含PMSF的細胞質(zhì)蛋白抽提試劑A在冰上充分裂解,裂解完畢用刮刀刮取并收集細胞,分別加入細胞質(zhì)蛋白抽提試劑B并充分渦旋混勻,在冰上靜置10 min以促進裂解,然后將樣品離心(12 000×g、4 ℃、5 min),取離心上清為細胞質(zhì)蛋白提取物。同時,在沉淀物中加入含有PMSF的細胞核蛋白抽提試劑,渦旋30 s、冰浴1 min,如此重復30 min后離心(12 000×g、4 ℃、10 min),取離心上清為細胞核蛋白提取物。采用BCA試劑盒和酶標儀測定蛋白濃度。

1.3.8Western blot 采用10% SDS-PAGE凝膠分離已提取的蛋白質(zhì)樣品(70～100 μg),然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫下采用5%脫脂牛奶封閉2 h。4 ℃下分別采用下列一抗雜交過夜:p-Akt (1 ∶1 000)、Akt (1 ∶1 000)、NF-κB p65 (1 ∶1 000)、p-STAT3 (1 ∶1 000)、STAT3 (1 ∶1 000)、GAPDH (1 ∶1 000)或Lamin B1 (1 ∶500)。然后用含0.5% Tween 20的PBS溶液多次漂洗后,將膜與山羊抗小鼠或山羊抗兔近紅外熒光二抗(1 ∶10 000)在室溫下避光孵育1 h。最后,使用Odyssey CLx激光成像系統(tǒng)掃描,采用Odyssey CLx 5.2軟件定量分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導H9c2心肌細胞損傷濃度篩選首先采用MTT法測定心肌細胞活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,LPS 抑制心肌細胞活力,且呈濃度依賴性降低(Fig1A)。10、30及100 μmol·L-17,8-DHF對細胞活力均無顯著影響(Fig1B)。我們分別檢測了7,8-DHF低、中、高濃度(10、30、100 μmol·L-1)對細胞損傷標志物LDH含量的影響,發(fā)現(xiàn)7,8-DHF在10 μmol·L-1和30 μmol·L-1兩個濃度時未能明顯抑制LPS誘導的LDH,100 μmol·L-17,8-DHF可抑制LPS誘導的心肌細胞LDH水平(Fig1C)。且MTT實驗表明,7,8-DHF(100 μmol·L-1)可逆轉(zhuǎn)LPS誘導的心肌細胞活力降低(Fig1D)。據(jù)此,確定10 mg·L-1LPS誘導損傷,采用100 μmol·L-17,8-DHF干預觀察其保護作用。

Fig1 Effects of 7,8-DHF on LPS-induced myocardial cell viability and LDH

2.2 7,8-DHF抑制LPS誘導的細胞死亡及氧化應(yīng)激采用Live/Dead熒光探針染色檢測心肌細胞的死亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)7,8-DHF可抑制LPS誘導的心肌細胞死亡(Fig2A-B)。與對照組相比,LPS誘導組心肌細胞SOD水平降低,這一變化可被7,8-DHF逆轉(zhuǎn)(Fig2C),此外,采用Mitosox熒光探針觀察細胞中線粒體ROS水平,結(jié)果顯示LPS可顯著增加細胞中ROS水平,7,8-DHF干預抑制LPS誘導心肌細胞的氧化應(yīng)激水平(Fig2D-E)。表明7,8-DHF抑制LPS誘導的心肌細胞死亡和氧化應(yīng)激損傷。

Fig2 Effects of 7,8-DHF on LPS-induced cell mortality and oxidative

2.3 7,8-DHF抑制LPS誘導心肌細胞損傷的作用機制

2.3.17,8-DHF對LPS誘導的心肌細胞損傷中NF-κB p65蛋白表達的影響 為進一步探討7,8-DHF抗LPS誘導心肌細胞損傷的分子機制,我們檢測了調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白NF-κB p65的表達情況。如Fig3,與對照組相比,LPS促進細胞總蛋白以及核蛋白內(nèi)NF-κB p65表達,這一變化可被7,8-DHF逆轉(zhuǎn),7,8-DHF對LPS誘導心肌細胞中NF-κB p65蛋白表達具有抑制作用。

Fig3 Effects of 7,8-DHF on protein expression of NF-κB p65 in LPS-induced H9c2

2.3.27,8-DHF對LPS處理心肌細胞Akt、STAT3蛋白表達的影響 STAT3作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。因此,我們檢測了LPS炎癥損傷模型下STAT3蛋白表達變化。如Fig4A所示,與Ctrl組相比,LPS組的p-STAT3蛋白表達水平明顯升高,而7,8-DHF干預后逆轉(zhuǎn)了p-STAT3蛋白表達。以往研究表明7,8-DHF作為BDNF的小分子模擬物可通過激活PI3K/Akt信號通路參與神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié),然而在LPS誘導的炎癥損傷中是否發(fā)揮調(diào)節(jié)作用仍不清楚。因此,我們進一步對Akt及其磷酸化表達進行檢測。結(jié)果表明:與對照組相比,LPS組p-Akt的蛋白表達水平增加,7,8-DHF干預后,p-Akt的表達則進一步上調(diào)(P<0.05)。

Fig4 Effects of 7,8-DHF on protein expression of Akt and STAT3 in LPS-induced H9c2

3 討論

大量研究表明,膿毒癥導致的心臟功能衰竭是一種最關(guān)鍵的患者死亡原因,迄今為止,膿毒癥導致心肌損傷的機制錯綜復雜[9]?！把装Y假說”是最初膿毒癥累及心臟的重要解釋,生理狀態(tài)下炎癥調(diào)節(jié)因子能夠?qū)崿F(xiàn)動態(tài)平衡,然而,在外界刺激下,細胞可能產(chǎn)生炎癥失衡和氧化應(yīng)激,從而導致心臟損傷。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)7,8-DHF具有良好的心肌保護作用[10-11],但7,8-DHF對LPS誘導心肌細胞損傷的作用及主要機制尚不完全清楚。有研究發(fā)現(xiàn)7,8-DHF通過激活TrkB/Akt/NF-κB p65信號通路減輕視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷引起的細胞炎癥。此外,以往研究表明7,8-DHF通過抑制IκB-α的降解、NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位,阻斷NF-κB信號通路,在LPS誘導的BV2小膠質(zhì)細胞模擬的神經(jīng)炎癥、小鼠神經(jīng)認知功能障礙、急性肺部損傷等模型中均具有明顯改善作用[12-14]。并且研究發(fā)現(xiàn)7,8-DHF也可改善巨噬細胞中炎癥介質(zhì)的表達,減輕細胞炎癥損傷[15]。因此,7,8-DHF是具有抗炎作用的候選化合物。

本研究通過建立LPS誘導的H9c2心肌細胞膿毒癥損傷模型,發(fā)現(xiàn)7,8-DHF可以通過增強細胞活力,減輕細胞氧化應(yīng)激水平來改善細胞損傷。結(jié)果顯示,7,8-DHF在心肌細胞中激活Akt信號通路發(fā)揮心肌細胞的保護作用,同時NF-κB p65作為激活下游信號通路的關(guān)鍵信號分子,在細胞程序性死亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16],本研究中,LPS模型組中STAT3的磷酸化水平和核內(nèi)NF-κB p65的表達水平明顯升高,7,8-DHF明顯降低STAT3磷酸化和NF-κB p65核內(nèi)表達,表明7,8-DHF主要通過激活Akt/NF-κB p65信號通路,阻斷NF-κB p65核表達,抑制下游凋亡信號的激活,從而保護細胞免受LPS誘導的細胞損傷[17]。LPS誘導NF-κB激活通常表現(xiàn)為核轉(zhuǎn)位增多,本研究中LPS處理組心肌細胞漿中未見明顯減少,這一現(xiàn)象與前期文獻報道類似[18],可能有其他機制參與其中,確切機制尚需進一步深入研究。STAT3,Akt在調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)7,8-DHF調(diào)控魚藤酮、過氧化氫誘導心肌細胞損傷中STAT3和Akt信號[10-11],因此本研究中我們檢測上述分子的蛋白表達,結(jié)果提示7,8-DHF減輕LPS誘導的心肌細胞損傷可能與激活Akt、抑制磷酸化STAT3和NF-κB p65蛋白表達有關(guān)。然而,7,8-DHF抑制LPS誘導心肌細胞損傷的確切分子機制仍不完全清楚,上述信號分子之間的調(diào)控關(guān)系有待深入探討。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)7,8-DHF抑制氧化應(yīng)激,改善LPS誘導的細胞損傷,這一保護作用可能與激活Akt、抑制STAT3及NF-κB p65信號有關(guān),為篩選心肌保護藥物靶點提供新思路。