王洪民,馬子涵,潘雅穎,高曉明,龔方苑

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇 蘇州 215123)

固有免疫和適應(yīng)性免疫是兩類相對(duì)獨(dú)立又互相協(xié)同的免疫應(yīng)答方式。經(jīng)典的免疫學(xué)理論認(rèn)為免疫記憶是適應(yīng)性免疫區(qū)別于固有免疫的重要特征之一。然而,近年來研究發(fā)現(xiàn),固有免疫細(xì)胞在接受病原體及其代謝產(chǎn)物刺激產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答后,可以通過表觀遺傳和代謝重編程等方式改變細(xì)胞表型及功能,當(dāng)再次接觸不同病原體時(shí),可以產(chǎn)生更強(qiáng)的非特異性免疫反應(yīng),這種現(xiàn)象被稱之為馴化免疫[1]。馴化免疫是由固有免疫細(xì)胞(包括單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞等)所介導(dǎo)的,獨(dú)立于T細(xì)胞和B細(xì)胞的記憶樣功能。馴化免疫中固有免疫細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)性增強(qiáng),會(huì)產(chǎn)生類似免疫記憶樣的特性,這對(duì)于機(jī)體發(fā)揮宿主防御及抗感染等功能具有重要意義[2]。

在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn),免疫復(fù)合物可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生敏感性增強(qiáng)狀態(tài),即固相化-IVIG(coated-IVIG, c-IVIG)處理的單核細(xì)胞再次接受LPS刺激時(shí)其敏感性明顯增強(qiáng)[3]。通過差異富集分析c-IVIG處理的單核細(xì)胞組及對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)差異基因主要在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system, UPS)明顯富集。因單核細(xì)胞在馴化免疫中的反應(yīng)性增強(qiáng)主要體現(xiàn)為炎性細(xì)胞因子如TNF-α,IL-6等的分泌水平增加,由NF-κB通路所介導(dǎo);而UPS通路同樣與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)[4],因此,我們認(rèn)為NF-κB信號(hào)通路中的UPS可能影響了c-IVIG處理的單核細(xì)胞的馴化作用。

UPS是所有細(xì)胞中蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的基本調(diào)節(jié)器,其通過對(duì)底物蛋白的多聚泛素化并經(jīng)蛋白酶體降解影響或調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng),如轉(zhuǎn)錄、免疫反應(yīng)、炎癥過程及腫瘤生長(zhǎng)等[5]。UPS由El泛素活化酶、E2泛素偶聯(lián)酶、E3泛素連接酶和去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)組成,而DUBs作為UPS中的重要組成部分,可通過切割多聚泛素鏈或者從修飾的底物蛋白中去除泛素來逆轉(zhuǎn)泛素化過程,發(fā)揮去泛素化作用,逆向調(diào)節(jié)蛋白降解過程,從而影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能。DUBs的存在使泛素化修飾成為一個(gè)被嚴(yán)格調(diào)控的可逆過程。在細(xì)胞中DUBs發(fā)揮維持游離泛素水平穩(wěn)態(tài)的作用,而穩(wěn)定的游離泛素水平是UPS正常調(diào)節(jié)的重要前提[6]。基于上述我們認(rèn)為的NF-κB信號(hào)通路的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)途徑可能影響了c-IVIG馴化作用的推測(cè),我們進(jìn)一步分析了單核細(xì)胞馴化處理后基因表達(dá)改變量較大的DUBs,發(fā)現(xiàn)去泛素化酶UCHL1在單核細(xì)胞馴化免疫中的作用最為明顯。

UCHL1是一個(gè)由223個(gè)氨基酸組成的半胱氨酸水解酶,也稱為PGP9.5蛋白,在大腦的神經(jīng)元細(xì)胞中大量表達(dá),其同時(shí)具有水解酶和連接酶的活性,這種雙重功能使UCHL1與其他DUBs區(qū)別開來,并使其成為UPS功能的特殊靶點(diǎn)[7]。UCHL1主要細(xì)胞功能被認(rèn)為與其阻止多肽蛋白酶體降解的單體泛素結(jié)合有關(guān),其通過維持細(xì)胞內(nèi)可用的泛素池,調(diào)節(jié)多種細(xì)胞泛素依賴性的生物過程,如細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)代謝、發(fā)育分化等[8]。已有的研究還表明,UCHL1參與了一些炎癥反應(yīng),UCHL1在多種炎癥性腎小球疾病中的表達(dá)明顯升高;抑制UCHL1可減少小鼠心臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);UCHL1通過NF-κB和MAPK信號(hào)調(diào)節(jié)LPS活化的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等[9-11]。因此,UCHL1可能是治療多種炎癥性疾病的潛在靶點(diǎn)。

馴化免疫誘導(dǎo)增強(qiáng)的非特異性免疫應(yīng)答更多的是炎癥反應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明,訓(xùn)練有素的免疫在廣泛的(病理)生理?xiàng)l件下發(fā)揮著重要作用,目前已經(jīng)在多種自身免疫性疾病中發(fā)現(xiàn)了馴化免疫的參與。在自身免疫性疾病患者體內(nèi)存在大量自身抗體,可以參與免疫病理過程。通常,自身抗體可識(shí)別組織抗原形成抗原-抗體復(fù)合物,或直接沉積于炎癥部位,如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜內(nèi)[12]。因此,探究免疫復(fù)合物誘導(dǎo)馴化免疫的機(jī)制對(duì)自身免疫病的預(yù)防及治療尤為重要。本研究我們采用c-IVIG模擬自身免疫疾病中自身抗體的堆積效應(yīng)對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行馴化處理,通過在293T細(xì)胞中構(gòu)建NF-κB信號(hào)通路模型,探究c-IVIG誘導(dǎo)單核細(xì)胞馴化作用的機(jī)制,以期為解釋自身免疫病發(fā)病的機(jī)制提供新的依據(jù),為疾病的預(yù)防和治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與質(zhì)粒 293T細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存;單核細(xì)胞從人外周血分離得到;NF-κB質(zhì)粒購自碧云天公司;UCHL1、USP2a、USP2b、OTUB2、OTUD4、PSMD14由蘇州大學(xué)免疫系鄭慧教授惠贈(zèng);pSuper質(zhì)粒由蘇州大學(xué)免疫學(xué)王帥副教授惠贈(zèng);pcDNA3.1、RL-TK、GFP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存;UCHL1-S18Y、UCHL1-H161Q由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2試劑 人TNF-α酶聯(lián)吸附測(cè)定試劑盒(eBioscience);人單核細(xì)胞CD14磁珠(Miltenyi Biotec);HP Total RNA Kit (Omega);1st-Strand cDNA 合成試劑及TB Green? Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)(TaKaRa);DUBs廣譜抑制劑PR619、UCHL1特異性抑制劑LDN57444 (Selleck);LongTrans轉(zhuǎn)染試劑(Ucallm);兔抗UCHL1多克隆抗體(Thermo Scientific);GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(原平皓生物)。

1.1.3儀器 StepOne Plus Q-PCR儀(Life Technologies);Spark多功能酶標(biāo)儀(Tecan);AttuneTMNxT 聲波聚焦流式細(xì)胞儀(Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1單核細(xì)胞的獲取 收集健康人外周血,將外周血與PBS按 1 ∶1進(jìn)行稀釋,然后將稀釋的外周血緩慢加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液上層,500×g離心30 min;離心結(jié)束后,離心管內(nèi)液面由上至下依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、分離液層與紅細(xì)胞層;用無菌吸管吸取單個(gè)核細(xì)胞層的細(xì)胞置于新的離心管中,加入PBS緩沖液,以400×g離心10 min洗滌去除血小板和死細(xì)胞等成分,獲得的細(xì)胞即為單個(gè)核細(xì)胞。將收集到的單個(gè)核細(xì)胞按107細(xì)胞數(shù)加80 μL預(yù)冷的分選緩沖液的比例進(jìn)行重懸,按107細(xì)胞數(shù)加20 μL抗CD14磁珠標(biāo)記抗體的比例加入抗體,冰上孵育15～30 min,孵育結(jié)束加入20 mL分選緩沖液以500×g離心10 min對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌。將細(xì)胞沉淀重懸于500 μL分選緩沖液中,LS柱置于磁珠分離架上,細(xì)胞懸液過柱,并用分選緩沖液沖洗分離柱以去除未結(jié)合的細(xì)胞,而后將LS柱從分離架上移開,將吸附在磁場(chǎng)中的細(xì)胞推出經(jīng)流式鑒定即可獲得純度達(dá)90%以上的單核細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 富集得到的人單核細(xì)胞采用RPMI 1640(含5%自體血清、1%雙抗)完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);293T細(xì)胞采用DMEM高糖(含10%胎牛血清、1%雙抗)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3單核細(xì)胞的馴化處理 將從人外周血中分離得到的單核細(xì)胞以1×105個(gè)接種于96孔板中,先經(jīng)c-IVIG處理24 h,吸出上清,加10 μg·L-1LPS刺激,48 h收集細(xì)胞上清進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.4293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d將5×104個(gè)細(xì)胞接種于48孔板中,待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前30 min更換成300 μL新鮮的完全培養(yǎng)基。將0.25 μg的質(zhì)粒DNA稀釋到15 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基中,混勻;將0.75 μL LongTrans轉(zhuǎn)染試劑稀釋到15 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基中,混勻;然后將DNA懸液加入LongTrans懸液中,輕輕混勻后室溫靜置15 min。將混合液加入孔板中然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染12 ～ 18 h后,去除含LongTrans和DNA復(fù)合物的培養(yǎng)基,替換為0.5 mL完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液。轉(zhuǎn)染24 h后用50 μg·L-1TNF-α作為激活劑進(jìn)行刺激,48 h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR) 收集細(xì)胞,使用HP Total RNA Kit 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,按照1st-Strand cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行合成cDNA;采用TB Green?Premix Ex TaqTM和引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列為:GAPDH:上游5′-GAACGGGAAGCTCACTGG-3′,下游5′-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3′;UCHL1:上游5′-GAAGGCCAATGTCGGGTAGA-3′,下游5′-GCCATGGTTCACCGGAAAAG-3′;USP2a:上游5′-TTCGACTCGTCCATACTCCA-3′,下游5′-TGGCACTCAGTGGGGACT-3′;USP2b:上游5′-GCTGCTCTCCACCTTCGT-3′,下游5′-GACCCTGGGCACTCTTAGAA-3′;OTUB2:上游5′-GCACTCACGAAGTAGAGCCC-3′,下游5′-CTTTGCCCAAAAGGCTGCAC-3′;OTUD4:上游5′-TGCTTTGCGTCTGAAAGGTG-3′,下游5′- TGTCCTACCCATTCCTGTGGA-3′;PSMD14:上游5′-CACAGTCAGGAACAGGTGTCA-3′,下游5′-CAAAGCCAGGGTGACTGTGA-3′。擴(kuò)增體系為:上下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL,cDNA 1 μL,TB Green 5 μL,ROX 0.2 μL,RNase Free ddH2O 3.4 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 1 min,循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附ELISA分析 收集細(xì)胞上清液,檢測(cè)細(xì)胞分泌TNF-α的水平。包被抗體(TNF-α),4 ℃過夜;PBST洗板3次;用5% BSA封閉液37 ℃封閉2 h;加入稀釋的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品,100 μL每孔,4 ℃過夜;PBST洗板3次,每次1 min;每孔加入100 μL稀釋后的 Biotin-標(biāo)記檢測(cè)抗體,37 ℃ 1 h; PBST 洗滌 3次;每孔加入100 μL 稀釋后的 Avidin-HRP,37 ℃ 30 min;PBST 洗滌5次;每次洗滌后靜置2 min;每孔加入100 μL底物,置于室溫15 min;每孔加入50 μL終止液進(jìn)行終止;酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值,選擇450 nm和570 nm 雙波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè) 將收集的細(xì)胞加入報(bào)告基因細(xì)胞裂解液進(jìn)行充分裂解,15 000×g離心5 min,收集細(xì)胞上清用于后續(xù)測(cè)定;設(shè)置多功能酶標(biāo)儀測(cè)定時(shí)間為10 s,取100 μL螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑加入測(cè)試管底部,然后加入20 μL 待測(cè)樣品,混勻后放入儀器進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定完成后,取100 μL海腎螢光素酶檢測(cè)工作液加入上述測(cè)定管中,輕輕混勻后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8Western blot檢測(cè) 收集細(xì)胞,加入適量的RIPA裂解液(含體積分?jǐn)?shù)為1%的蛋白酶抑制劑),置于冰上搖動(dòng)裂解30 min,4 ℃ 12 000×g離心15 min之后收集細(xì)胞總蛋白。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量測(cè)定。用10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5% BSA在室溫對(duì)膜進(jìn)行封閉2 h,加入適當(dāng)濃度的一抗:UCHL1或GAPDH,4 ℃孵育過夜。孵育結(jié)束后,用TBST洗4次,每次10 min,加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)兔或鼠二抗,室溫孵育1 h后,TBST洗4次,每次10 min,加入ECL發(fā)光試劑顯色,在全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像。

2 結(jié)果

2.1 單核細(xì)胞馴化對(duì)去泛素化酶表達(dá)的影響我們對(duì)前期研究的coated-IVIG處理單核細(xì)胞組(c-IVIG)與對(duì)照組(Medium)細(xì)胞的RNA-seq測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,顯示差異基因在泛素-蛋白酶體途徑通路明顯富集。對(duì)該途徑相關(guān)基因表達(dá)分析得到表達(dá)變化較大的幾種去泛素化酶(USP2、UCHL1、OTUB2、OTUD4和PSMD14)(Fig1A)。接下來我們提取經(jīng)過馴化處理的單核細(xì)胞RNA,通過Q-PCR對(duì)上述基因的表達(dá)做了進(jìn)一步的驗(yàn)證,得到與RNA-seq一致的結(jié)果,即經(jīng)馴化處理的單核細(xì)胞,去泛素化酶USP2(USP2b)、UCHL1、OTUB2和OTUD4的表達(dá)水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig1B)。

Fig1 c-IVIG enhanced expression of deubiquitinase-related genes in trained monocytes

2.2 去泛素化酶對(duì)單核細(xì)胞馴化作用的影響在c-IVIG處理階段或LPS刺激階段加入不同濃度的去泛素化酶廣譜抑制劑PR619處理單核細(xì)胞;收集上清檢測(cè)TNF-α的分泌水平,分析去泛素化酶對(duì)單核細(xì)胞馴化免疫作用的影響。在c-IVIG處理階段加入抑制劑的結(jié)果顯示(Fig2A),TNF-α的分泌水平隨抑制劑濃度的增加而明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且抑制作用呈劑量依賴性。在LPS刺激階段加入抑制劑的結(jié)果顯示(Fig2B),TNF-α的分泌水平也明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但抑制作用并未呈現(xiàn)出劑量依賴性,結(jié)果說明,去泛素化酶主要在c-IVIG處理階段發(fā)揮作用。

Fig2 Deubiquitinating enzyme inhibitor inhibited trained immunity of monocytes

2.3 去泛素化酶對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響在經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路中,單核細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后產(chǎn)生TNF-α。因此,我們以TNF-α作為激活劑,在293T細(xì)胞中過表達(dá)結(jié)果2.1中幾種去泛素化酶,構(gòu)建了NF-κB信號(hào)通路模型。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路的激活情況。結(jié)果如Fig3所示,與對(duì)照組(Medium)相比,幾種去泛素化酶的過表達(dá)均可明顯激活NF-κB信號(hào)通路,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中UCHL1對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活效果最為明顯。因此,后續(xù)我們將圍繞UCHL1進(jìn)行研究。

Fig3 Deubiquitinating enzymes activated NF-κB signaling pathway

2.4 UCHL1的表達(dá)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響我們?cè)?93T細(xì)胞中對(duì)UCHL1進(jìn)行干擾和過表達(dá),TNF-α作為激活劑,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)UCHL1的表達(dá)對(duì)NF-κB信號(hào)通路激活的影響。結(jié)果顯示:干擾UCHL1可明顯抑制UCHL1的表達(dá),并且干擾UCHL1的表達(dá)可明顯降低NF-κB信號(hào)通路的激活,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig4A、4B);而過表達(dá)UCHL1后,NF-κB信號(hào)通路的激活明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且隨著UCHL1表達(dá)量的增加,對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活作用也相應(yīng)增強(qiáng)(Fig4C、4D)。結(jié)果表明,UCHL1正向調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的激活。

Fig4 UCHL1 enhanced activation of NF-κB signaling

2.5 UCHL1與NF-κB通路中關(guān)鍵信號(hào)分子之間的作用我們?cè)谶^表達(dá)或者干擾UCHL1的情況下,同時(shí)過表達(dá)NF-κB通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子(IκB-α、IKK-α、IKK-β、IKK-ε、p65),通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定NF-κB信號(hào)通路的激活情況,從而確定UCHL1作用于NF-κB信號(hào)通路中的步驟。結(jié)果如Fig5A、5B所示,當(dāng)過表達(dá)幾種信號(hào)分子時(shí),均能激活NF-κB信號(hào)通路;但在過表達(dá)p65或IKK-ε的情況下,過表達(dá)或干擾UCHL1對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活無明顯影響;而在過表達(dá)IκB-α、IKK-α、IKK-β的情況下,過表達(dá)UCHL1可明顯激活NF-κB信號(hào)通路,干擾UCHL1則可明顯抑制NF-κB信號(hào)通路的激活,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明UCHL1的表達(dá)可明顯促進(jìn)由IκB-α、IKK-α或IKK-β介導(dǎo)的NF-κB的活化,但不影響p65或IKK-ε誘導(dǎo)的NF-κB激活。

Fig5 UCHL1 expression promoted activation of NF-κB induced by IKK-α, IKK-β or

2.6 UCHL1酶活性對(duì)NF-KB信號(hào)通路的影響UCHL1同時(shí)具有泛素水解酶和泛素連接酶活性,我們將其連接酶位點(diǎn)(S18Y)或水解酶位點(diǎn)(H161Q)進(jìn)行突變,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析UCHL1表達(dá)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活是否依賴于其酶活性。結(jié)果如Fig6A所示,與對(duì)照組相比,突變體UCHL1-S18Y及UCHL1-H161Q對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活效果與UCHL1相一致,且上調(diào)作用更為明顯;但突變體UCHL1-S18Y及UCHL1-H161Q在未經(jīng)TNF-α刺激的情況下,本底也明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此我們將各組TNF-α激活后的熒光素酶活性與本底做比進(jìn)行分析,結(jié)果如Fig6B,顯示UCHL1-H161Q突變體的相對(duì)熒光素酶活性值明顯低于UCHL1,即UCHL1水解酶活性受到抑制的情況下,UCHL1對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控水平會(huì)也受到明顯抑制。因此,我們認(rèn)為,UCHL1的泛素水解酶活性在調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路中起重要作用。

Fig6 Regulation of NF-κB signaling pathway by UCHL1 depended mainly on activity of ubiquitin hydrolase (H161Q site)

2.7 UCHL1對(duì)單核細(xì)胞馴化免疫的影響基于上述UCHL1對(duì)NF-κB通路的明顯激活作用,我們推測(cè)UCHL1可能是單核細(xì)胞馴化免疫調(diào)控的關(guān)鍵分子。通過在c-IVIG處理階段或LPS刺激階段加入不同濃度的UCHL1特異性抑制劑LDN-57444對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行處理,收集細(xì)胞上清,ELISA檢測(cè)TNF-α的分泌水平,分析馴化作用受UCHL1的影響。Fig7A結(jié)果顯示,在c-IVIG處理階段加入U(xiǎn)CHL1抑制劑,TNF-α的分泌水平隨抑制劑濃度的增加而明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是抑制效果并未呈現(xiàn)出劑量依賴性;在LPS刺激階段加入U(xiǎn)CHL1抑制劑的結(jié)果顯示(Fig7B),TNF-α的分泌水平也明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且抑制效果呈現(xiàn)出劑量依賴性,表明在LPS刺激階段加入U(xiǎn)CHL1抑制劑比在c-IVIG處理階段加入的抑制作用更有效。

Fig7 UCHL1 inhibitor inhibited trained

3 討論

馴化免疫可發(fā)生于多種固有免疫細(xì)胞中,在接種過卡介苗的健康志愿者外周鑒定出具有馴化免疫特征的單核細(xì)胞,當(dāng)這群細(xì)胞再次受到刺激時(shí),可以增強(qiáng)其炎性細(xì)胞因子的分泌能力,發(fā)揮對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用;在暴露過低毒力白色念珠菌的小鼠巨噬細(xì)胞上,再次接受病原體感染時(shí)其固有免疫反應(yīng)性增強(qiáng),可以發(fā)揮免疫保護(hù)作用;病毒感染誘導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞的訓(xùn)練免疫也顯示出類似于T細(xì)胞記憶反應(yīng)的受體依賴性病原體特異性記憶效應(yīng);注射白色念珠菌的小鼠顯示出與退行性疾病惡化相關(guān)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的增加,這種記憶反應(yīng)可能歸因于訓(xùn)練的中性粒細(xì)胞[13]。馴化免疫進(jìn)化為提供抗感染的保護(hù),但過度激活的馴化免疫可誘導(dǎo)有害炎癥并促進(jìn)炎癥性疾病的發(fā)展。

目前,已經(jīng)在多種疾病中發(fā)現(xiàn)了馴化免疫的參與:在慢性炎癥性心臟代謝疾病如動(dòng)脈粥樣硬化中,訓(xùn)練有素的免疫可能起到有害作用;在炎癥性腸病中,先天免疫記憶兼具有益或有害的雙重作用;在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病中,小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫記憶被認(rèn)為是神經(jīng)炎癥的潛在原因;癌癥和某些感染也是由馴化免疫缺陷引起的疾病[2]。除上述疾病外,自身炎癥性疾病或過敏的患者在馴化免疫的情況下也會(huì)遭受過度炎癥的有害影響,以類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)為例:RA 患者中分離的單核細(xì)胞表現(xiàn)為馴化免疫表型,這些高度敏感的單核細(xì)胞可以在受到刺激時(shí)產(chǎn)生TNF-α,IL-6和IL-1β等大量炎性細(xì)胞因子;馴化免疫相關(guān)的通路,如PI3K-mTOR和MAPK通路都被激活[14];這種細(xì)胞高反應(yīng)性可以導(dǎo)致機(jī)體長(zhǎng)期處于慢性炎癥狀態(tài)下,產(chǎn)生慢性病發(fā)作,且有證據(jù)表明,RA患者外周單核細(xì)胞具有較正常人群更高的反應(yīng)性。巨噬細(xì)胞作為先天免疫的重要組成部分在炎癥和宿主防御中亦發(fā)揮重要作用,其主要來源于單核細(xì)胞。研究表明,巨噬細(xì)胞同樣可以被訓(xùn)練并持久發(fā)揮作用:經(jīng)過訓(xùn)練的巨噬細(xì)胞在對(duì)抗原暴露的反應(yīng)中也可獲得記憶樣的特性,進(jìn)而靶向自身免疫性風(fēng)濕病如系統(tǒng)性硬化病的治療;訓(xùn)練的巨噬細(xì)胞也可促進(jìn)炎癥性動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展等;RA患者滑膜中的巨噬細(xì)胞在炎癥時(shí)同樣會(huì)分泌大量TNF-α和IL-6等炎性細(xì)胞因子,其反應(yīng)性也呈現(xiàn)出較高的敏感態(tài)[15]。在RA和SLE等自身免疫性疾病患者體內(nèi)存在大量自身抗體,可以在局部病灶(如骨關(guān)節(jié)處)發(fā)生沉積,導(dǎo)致局部微環(huán)境改變。結(jié)合免疫復(fù)合物及自身抗體多參與自身免疫病的事實(shí),進(jìn)一步研究免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的單核細(xì)胞馴化作用機(jī)制可為解釋相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)。

在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中,我們采用固相化-IgG(c-IVIG)模擬自身免疫病中自身抗體的堆積效應(yīng)誘導(dǎo)單核細(xì)胞發(fā)生馴化免疫。通過差異基因富集及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)對(duì)coated-IVIG處理的單核細(xì)胞組及對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),馴化免疫的差異基因主要富集在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)途徑通路;蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果也提示,泛素化是USP2、OTUB2、UCHL1等多種去泛素化酶差異基因的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)。以上結(jié)果提示我們泛素化在參與調(diào)控馴化免疫中發(fā)揮重要作用。通過在RNA-seq結(jié)果中篩選出表達(dá)量變化較大的幾種DUBs(USP2、OTUB2、OTUD4、PSMD14、UCHL1)并在單核細(xì)胞上進(jìn)行了驗(yàn)證。通過在單核細(xì)胞馴化過程中加入U(xiǎn)DBs的廣譜抑制劑,發(fā)現(xiàn)馴化作用受到明顯抑制,說明DUBs在單核細(xì)胞馴化免疫中發(fā)揮著重要的作用。研究表明,單核細(xì)胞馴化處理后其炎性因子的釋放顯著增加為NF-κB通路介導(dǎo),而NF-κB信號(hào)通路的作用主要通過影響其上游因子的泛素化過程來實(shí)現(xiàn)[16-17]。因此,我們推測(cè) NF-κB 信號(hào)通路的UPS在c-IVIG 的馴化作用中可能發(fā)揮重要作用,并且我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一假設(shè),即在NF-κB信號(hào)通路體系中,以TNF-α為NF-κB信號(hào)通路激活劑,DUBs(USP2、OTUB2、UCHL1、PSMD14)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活均有明顯促進(jìn)效果,其中UCHL1的影響效果最為突出。

接下來我們通過對(duì)UCHL1進(jìn)行干擾或者過表達(dá),發(fā)現(xiàn)干擾或過表達(dá)UCHL1可抑制或促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的激活,表明UCHL1正向調(diào)控NF-κB信號(hào)通路。通過對(duì)NF-κB信號(hào)通路中與泛素化相關(guān)的分子(IκB-α、IKK-α、IKK-β、IKK-ε、p65等)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)UCHL1的表達(dá)對(duì)由IKK-α、IKK-β或IκB-α介導(dǎo)的NF-κB的活化具有明顯促進(jìn)作用,而對(duì)p65及IKK-ε介導(dǎo)的NF-κB激活卻沒有影響。因此,我們認(rèn)為UCHL1 對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用可能通過p65 NF-κB因子上游和NEMO/IKK復(fù)合體下游相關(guān)信號(hào)分子的泛素化而影響NF-κB信號(hào)通路的激活。研究表明[18]UCHL1同時(shí)具有泛素水解酶和泛素連接酶活性,其H161催化位點(diǎn)發(fā)揮水解酶作用,18號(hào)位點(diǎn)發(fā)揮連接酶作用,將H161位點(diǎn)突變(H161Q)或18號(hào)位點(diǎn)突變(S18Y)后其水解酶活性或連接酶活性受到抑制。因此,我們還探究了UCHL1的酶活性對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控影響。通過對(duì)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn),在H161Q位點(diǎn)突變的情況下,UCHL1對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控受到明顯抑制。因此,我們認(rèn)為UCHL1的泛素水解酶活性在調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路中起重要作用。此外,我們還用UCHL1的特異性抑制劑LDN-57444抑制c-IVIG模擬的自身抗體效應(yīng)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞馴化免疫,結(jié)果顯示抑制UCHL1可明顯減弱單核細(xì)胞的馴化作用。

綜上,我們認(rèn)為自身免疫性疾病患者體內(nèi)的免疫復(fù)合物可以通過去泛素化酶UCHL1調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的激活從而馴化單核細(xì)胞,增強(qiáng)其敏感性,進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生與進(jìn)展。通過抑制UCHL1可降低單核細(xì)胞的馴化免疫,以此來減少自身免疫相關(guān)炎癥性疾病的發(fā)生。此研究可為自身免疫病的預(yù)防和治療提供一定的理論依據(jù)和新靶點(diǎn)。