王 嬋,邱會(huì)琴,唐亞婷,朱方媛,范彥英,楊彩紅

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,山西 太原 030001)

急性腎臟損傷(acute kidney injury, AKI)后的纖維化和炎癥反應(yīng),導(dǎo)致的慢性結(jié)構(gòu)變化漸進(jìn)性進(jìn)展被認(rèn)為是慢性腎病(chronic kidney disease, CKD)發(fā)生的重要病因之一。缺血/再灌注的發(fā)生[1]、抗腫瘤藥物的應(yīng)用[2]、橫紋肌溶解癥[3]、細(xì)菌感染甚至服藥不當(dāng)[4],均會(huì)引起AKI的發(fā)生,其中藥物引起的AKI在所有AKI病例中的比例持續(xù)增加[5]。

藥物性AKI動(dòng)物模型的構(gòu)建有利于研究腎損傷的發(fā)病機(jī)制,其組織形態(tài)的變化與生態(tài)指標(biāo)及臨床表現(xiàn)的相互關(guān)系的研究,是篩選有效藥物,闡明療效機(jī)制的重要媒介?，F(xiàn)有技術(shù)中,藥物性AKI多使用對(duì)腎臟有損傷的藥物構(gòu)建,如順鉑(cisplatin, CDDP)、脂多糖等。對(duì)藥物腎損傷模型的成功構(gòu)建有助于幫助尋找保護(hù)腎功能,促進(jìn)腎臟AKI恢復(fù),延緩腎臟疾病進(jìn)展和控制并發(fā)癥的機(jī)制和藥物。

C57BL/6作為廣泛使用的近交小鼠品系,主要包括C57BL/6J和C57BL/6N兩個(gè)核心亞型,在研究藥物引起的AKI模型中發(fā)揮了不可替代的作用。兩者由于表型差異的不同出現(xiàn)遺傳變異,但還是經(jīng)常被用于各種疾病模型及潛在機(jī)制的研究[6]。Simon等[7]對(duì)C57BL/6J和C57BL/6N進(jìn)行了全面的基因組序列比較和表型分析,發(fā)現(xiàn)了這兩種亞系在基因組序列、視網(wǎng)膜、心血管、新陳代謝、神經(jīng)、行為和感覺(jué)以及免疫功能等方面存在明顯表型差異,可能影響其潛在遺傳機(jī)制及表現(xiàn)差異。目前尚未發(fā)現(xiàn)有研究比較順鉑誘導(dǎo)腎損傷模型在C57BL/6J和C57BL/6N小鼠亞系之間的差異性。順鉑腎損傷主要表現(xiàn)為腎小管擴(kuò)張或萎縮,腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),進(jìn)而發(fā)展為腎間質(zhì)纖維化,最終導(dǎo)致不可逆性腎功能不全[8]。因此,降低炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和減少腎間質(zhì)纖維化過(guò)程對(duì)于臨床上尋求促進(jìn)藥物AKI恢復(fù)的治療手段具有重要意義。基于此,本研究將探究順鉑在C57BL/6J和C57BL/6N小鼠亞系腎損傷模型的構(gòu)建,及其在C57BL/6J和C57BL/6N亞系小鼠腎小管的損傷、間質(zhì)纖維化和炎癥因子的表達(dá)是否存在差異影響。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑CDDP(cisplatin, 批號(hào):153513),上海陶素生化科技有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、4%多聚甲醛固定液,武漢博士德生物工程有限公司;肌酐(creatinine, CRE)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)檢測(cè)試劑盒,南京建成科技有限公司;β2微球蛋白(β2-microglobulin, β2-MG)試劑盒,上海酶免生物科技有限公司;白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)(GB11113),武漢賽維爾生物科技有限公司;白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)(A11115)和白細(xì)胞介素18(interleukin-18, IL-18)(A1115),武漢Abcolonal 生物科技有限公司;β肌動(dòng)蛋白單抗(一抗)(AC038),武漢Abcolonal生物科技有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(二抗)(BA1054),武漢博士德生物工程有限公司;ECL超敏發(fā)光液,上海羿圣生物科技有限公司。

1.2 儀器電子天平(CP124C,中國(guó)常州),倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰);高速冷凍離心機(jī)(徳國(guó) Eppendorf);電熱恒溫培養(yǎng)箱(B667902,上海智城);凝膠電泳及成像設(shè)備(美國(guó)Bio-Rad)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12周C57BL/6J和N雄性小鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量為(26 ± 2)g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2021-0006。飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25～26) ℃,相對(duì)濕度45%～60%,12 h晝夜交替照明,自由攝食飲水,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有動(dòng)物均經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SYDL2022004),實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證編號(hào)為SYXK(晉)2019-0007。

1.4 動(dòng)物分組和給藥J及N亞系C57BL/6小鼠置正常環(huán)境飼養(yǎng)適應(yīng)1周,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、順鉑組,每組8～10只。順鉑組腹腔注射3.33 mg·kg-1,隔天給藥,共6次,連續(xù)給藥2周,累積劑量20 mg·kg-1,建立亞急性腎損傷模型。正常對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水。給藥結(jié)束后觀察1周,隨后用1%戊巴比妥(0.1 mL/10 g, ip)麻醉小鼠,眼眶采血留取血液標(biāo)本,留取小鼠雙側(cè)腎臟用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 腎功能測(cè)定小鼠眼眶靜脈采血,血樣置非抗凝管中,常溫下靜置2 h后離心(4 ℃, 3 000 r·min-1, 20 min),抽取上清,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血清中血Scr、BUN和β2-MG含量的測(cè)定。

1.6 ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子的含量同上采血,抽取上清,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血清中血IL-1β、IL-6、IL-18炎癥因子的含量測(cè)定。

1.7 腎臟組織病理變化腎臟稱重后,取腎臟皮質(zhì)部分組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定至少24 h,剩余腎臟組織置-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將固定的腎臟組織常規(guī)石蠟包埋后切片(厚度4 μm),按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行HE、Masson和PAS染色。HE染色用于觀察腎臟組織形態(tài)變化;Masson染色觀察腎臟纖維化程度,PAS染色觀察腎臟組織糖原沉積情況,腎小管損傷評(píng)分基于腎小管受損的百分比,利用光學(xué)顯微鏡在高倍視野下,對(duì)腎小管上皮細(xì)胞丟失、壞死、腎小管內(nèi)碎片和管型形成程度進(jìn)行評(píng)分:無(wú)損傷為0分;<25%為1分;25%～50%為2分;50%～75%為3分;>75%為4分[9]。使用Image-pro plus 8.0軟件測(cè)量腎臟藍(lán)染膠原纖維相對(duì)面積、紫紅色糖原沉積相對(duì)面積,計(jì)算膠原纖維面積百分比、糖原沉積面積百分比,并取平均值。

1.8 Western blot印跡法檢測(cè)腎臟IL-1β、IL-6和IL-18蛋白表達(dá)水平取20 mg腎臟皮質(zhì)組織加入200 μL裂解液,研磨后置于搖床搖晃,冰上裂解30 min, 離心(4 ℃, 13 000×g, 20 min),取上清并進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取等量蛋白加入蛋白上樣緩沖液混勻,煮沸15 min,進(jìn)行SDS-PAGE電泳。隨后轉(zhuǎn)膜,脫脂牛奶封閉2 h;分別加入IL-1β (1 ∶1 000) 、IL6 (1 ∶1 000)、IL-18 (1 ∶1 000)、β-actin (1 ∶5 000)抗體,4 ℃孵育過(guò)夜,二抗室溫孵育1 h,用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影。用Image Lab軟件對(duì)凝膠條帶進(jìn)行灰度值測(cè)定及定量分析,各泳道以β-actin為內(nèi)參對(duì)目的條帶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2 結(jié)果

2.1 順鉑給藥前后C57BL/6J和N亞系體重變化、生存率的差異如 Fig1所示,C57BL/6J和C57BL/6N亞系小鼠給藥前體質(zhì)量均一,CDDP給藥后C57BL/6N小鼠體質(zhì)量比C57BL/6J亞系小鼠體質(zhì)量下降明顯,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。生存曲線結(jié)果顯示,C57BL/6N小鼠存活率較C57BL/6J亞系小鼠高,存活率100%,C57BL/6J亞系小鼠存活率為80%,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig1 Effects of cisplatin on body weight change and survival rate between C57BL6J and 6N

2.2 順鉑在C57BL/6J和N亞系對(duì)腎功能指標(biāo)影響的差異如 Fig2所示,與Control組相比,CDDP給藥后C57BL/6J和C57BL/6N亞系小鼠血清Scr、BUN和β2-MG值均有升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C57BL/6N系小鼠與C57BL/6J系小鼠腎功能指標(biāo)比較,Scr和BUN均值明顯偏高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。

Fig2 Effect of renal function in cisplatin-induced renal injury model in C57BL/6J and N substrain

2.3 順鉑腎損傷模型中炎癥因子水平在C57BL/6J和N亞系的差異表現(xiàn)如 Fig3所示,與Control組相比,CDDP給藥后C57BL/6J和C57BL/6N亞系血清中IL-1β、IL-6和IL-18炎癥因子分泌水平均明顯升高(P<0.05)。C57BL/6N小鼠與C57BL/6J系小鼠比較,IL-1β、IL-6和IL-18均值明顯偏高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig3 Changes in inflammatory cytokines in cisplatin-induced renal injury model in C57BL/6J and N substrain

2.4 順鉑腎損傷模型中腎臟組織病理變化在C57BL/6J和N亞系的差異表現(xiàn)如Fig4所示,HE染色結(jié)果顯示,Control組C57BL/6J和C57BL/6N亞系小鼠腎臟組織無(wú)明顯異常,CDDP組C57BL/6J和C57BL/6N亞系小鼠均可見(jiàn)大量的腎小管上皮細(xì)胞水樣變性,細(xì)胞腫脹,胞質(zhì)疏松淡染,腎小管管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的上皮細(xì)胞,腎小管形態(tài)不規(guī)則,病理組織學(xué)評(píng)分與Control組相比,腎小管損傷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。C57BL/6 N亞系小鼠與C57BL/6 J亞系小鼠相比,腎小管損傷嚴(yán)重,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Masson染色結(jié)果顯示,C57BL/6N亞系小鼠纖維化藍(lán)染面積增加,與C57BL/6J系相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);PAS染色結(jié)果顯示,C57BL/6 N亞系小鼠與C57BL/6 J亞系Control組小鼠相比腎臟組織可見(jiàn)系膜擴(kuò)張,糖原沉積增加(P<0.05),CDDP組兩亞系組均可見(jiàn)明顯糖原沉積,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig4 Effect of the pathological changes of renal tissue in cisplatin-induced renal injury model in C57BL/6J and N substrain

2.5 順鉑腎損傷模型中炎癥因子IL-6、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平在C57BL/6J和N亞系的差異表現(xiàn)如Fig5所示,與Control組相比,CDDP組C57BL/6J和C57BL/6N兩亞系小鼠腎皮質(zhì)組織IL-6、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01或P<0.05)。C57BL/6N小鼠與C57BL/6J系小鼠比較, 其組織中IL-6、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)明顯偏高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig5 Changes in protein expression levels in cisplatin-induced renal injury model in C57BL/6J and N substrain

3 討論

順鉑主要通過(guò)腎臟排泄,可通過(guò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2、銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1)被近端小管細(xì)胞所攝取,其腎毒性主要以腎小管細(xì)胞損傷和死亡為常見(jiàn)的組織病理學(xué)特征。同時(shí),順鉑在腎小管可引起炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體損傷,進(jìn)一步導(dǎo)致腎血流減少和腎小球?yàn)V過(guò)率下降[8,10]。本研究腎功能結(jié)果顯示,兩種小鼠CDDP組血清Scr、BUN和β2-MG含量明顯升高,提示腎小球?yàn)V過(guò)率下降,腎功能受損;病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),腎小管上皮細(xì)胞變性,壞死脫落,這些結(jié)果均提示使用順鉑隔天腹腔注射連續(xù)兩周后腎損傷模型構(gòu)建成功。以往研究發(fā)現(xiàn),在慢性草酸鈣晶體形成出現(xiàn)鈣質(zhì)沉積相關(guān)(calcium oxalate, CaOx)腎病模型中,C57BL/6N小鼠比C57BL/6J小鼠更容易出現(xiàn)CaOx晶體沉積,最后發(fā)展為CKD[11]。也有研究報(bào)道,在急性CaOx腎病模型中發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠比C57BL/6N小鼠具有更多的腎臟CaOx晶體沉積,這可能與Nnt蛋白有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示,C57BL/6N小鼠的Scr明顯增加,BUN也略高于C57BL/6J小鼠,觀察到的這些表型差異可能與小鼠品系之間的遺傳變異密切相關(guān)[11]。

現(xiàn)有證據(jù)表明,在AKI反復(fù)發(fā)作或加重之后,近端小管上皮反復(fù)損傷,修復(fù)或反應(yīng)過(guò)程中結(jié)締組織嚴(yán)重積聚,從而持續(xù)產(chǎn)生和分泌促纖維化因子,導(dǎo)致腎小管萎縮、腎小管間質(zhì)纖維化以及長(zhǎng)期功能障礙[13-15]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟組織形態(tài)學(xué)染色結(jié)果顯示,CDDP給藥后腎臟組織可見(jiàn)大量的腎小管上皮細(xì)胞水樣變性,壞死脫落,腎小管形態(tài)不規(guī)則;腎臟組織膠原纖維化嚴(yán)重;系膜擴(kuò)張,糖原過(guò)度沉積。在對(duì)其進(jìn)行腎小管損傷評(píng)分、纖維化百分比、糖原沉積陽(yáng)性百分比定量分析后,我們發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)的腎損傷在C57BL/6N小鼠比C57BL6J小鼠病理?yè)p傷明顯,C57BL/6N小鼠腎臟纖維化程度尤為嚴(yán)重。同時(shí)C57BL/6N小鼠注射CDDP后雖然體重較C57BL/6J小鼠下降明顯,但精神狀態(tài)、活躍度較C57BL/6J小鼠表現(xiàn)良好,其生存率也較C57BL/6J高,提示C57BL/6N小鼠更適合作為順鉑腎損傷模型的建立動(dòng)物。糖原沉積多與遺傳、代謝及免疫反應(yīng)發(fā)生有關(guān),我們發(fā)現(xiàn)未給藥之前,C57BL/6N小鼠腎臟糖原沉積較C57BL/6J小鼠明顯,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,給予順鉑后C57BL/6N小鼠糖原沉積比C57BL/6J小鼠更為嚴(yán)重,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這些結(jié)果提示我們C57BL/6N小鼠可能作為某些糖原沉積癥的天然模型或者誘發(fā)動(dòng)物更為合適。

IL-1β和IL-6作為促炎核心因子,二者在感染、自身免疫、癌癥和慢性炎癥中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用;IL-18作為獨(dú)特的細(xì)胞因子,參與癌癥、抑郁癥和認(rèn)知障礙、腎缺血/再灌注以及各種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。大量研究表明,強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)與順鉑腎毒性的發(fā)病機(jī)制息息相關(guān),腎損傷誘導(dǎo)大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子的合成與釋放[16-17]。促炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等參與CDDP誘導(dǎo)的AKI,槲皮素可通過(guò)降低IL-1β、IL-6和TNF-α參與介導(dǎo)保護(hù)順鉑AKI[18]。本研究結(jié)果顯示,CDDP可誘導(dǎo)小鼠腎臟組織中IL-6、IL-1β、IL-18等炎癥因子表達(dá)水平的升高。其中C57BL/6N系小鼠與C57BL/6J系小鼠比較,均值明顯偏高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示C57BL/6N系小鼠較C57BL/6J系小鼠免疫反應(yīng)強(qiáng)烈,其原因可能與遺傳差異有關(guān)。

綜上所述,本研究主要比較了C57BL/6J和C57BL/6N系小鼠在CDDP給藥后腎損傷差異性,結(jié)果顯示,C57BL/6J和C57BL/6N小鼠順鉑腎損傷模型均可成功制備,但C57BL/6N系小鼠炎癥損傷反應(yīng)高于C57BL/6J系小鼠,生存率及生存狀態(tài)均優(yōu)于C57BL/6J系小鼠,腎功能損傷,組織病理?yè)p傷、腎臟糖原沉積程度及腎組織纖維化程度均較C57BL/6J系小鼠明顯。C57BL/6N系小鼠在炎癥、糖原沉積方面的特點(diǎn)和纖維化程度及動(dòng)物存活率的優(yōu)點(diǎn)有助于腎臟疾病的研究,這為以后選取疾病模型或指導(dǎo)未來(lái)相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了一定的參考依據(jù)。

(致謝:特別感謝山西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室各位老師和同學(xué)們的幫助。)