薛彤彤，謝萌蒙，孫輝，李沖偉,

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心/黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點實驗室/黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080；2樺南農(nóng)盛園食品有限公司，黑龍江樺南 154400）

0 引言

紫蘇(Perillafrutescens)又名荏、赤蘇等，是唇形科紫蘇屬且生長周期較短的一年生草本植物，是中國衛(wèi)生部頒發(fā)的第一批藥用和食用同源的植物[1]。紫蘇籽和葉均可直接食用，根莖可入中藥[2]，紫蘇籽富含α-亞麻酸、油酸、維生素B1和其他不飽和脂肪酸，具有血脂調(diào)節(jié)功能、增強記憶力、止咳平喘、解熱消炎、抗衰、抗過敏和抗腫瘤等功能[3]，在營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域堪稱“植物腦黃金”[4]，具有極高的開發(fā)價值。紫蘇原產(chǎn)于東亞地區(qū)，因經(jīng)濟效益顯著，現(xiàn)美國、加拿大、俄羅斯也有大面積商業(yè)種植[5]。紫蘇在中國華北、西北、華南、西南、華中及臺灣均有分布和栽培，其栽培史距今已超過2000年。中國是紫蘇出口量最大的國家，常年出口日本、韓國等地[6]。近年來，隨著紫蘇種植面積的不斷增加，紫蘇種植過程中的連作障礙現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，這給紫蘇籽的品質(zhì)和產(chǎn)量帶來了嚴(yán)重的影響[7]。

已有研究證實，引起作物連作障礙的原因，除了土壤理化性質(zhì)劣變、微生物群落結(jié)構(gòu)改變和病原微生物豐度增加外，自毒作用也是導(dǎo)致作物連作障礙的一個主要因素[8]。作物在生長過程中不斷向環(huán)境釋放次生代謝物作為信號因子，包括有機酸、酚類、醌類、香豆素、黃酮類和甾族化合物等物質(zhì)，其中以酚酸類物質(zhì)較多。隨著作物種植年限的增長，在土壤中這些信號分子積累到一定濃度反過來會對植物生長產(chǎn)生影響，往往表現(xiàn)為對植物的毒害作用[9]。近年來，酚酸作為一類主要的植物化感物質(zhì)被學(xué)者廣泛關(guān)注[10]。

酚酸類化感物質(zhì)主要包括苯甲酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸和迷迭香酸等[11]。蔡淼[12]研究表明，苯甲酸是穿心蓮連作障礙的化感物質(zhì)，它們通過破壞穿心蓮抗氧化酶代謝合成過程，對穿心蓮的生長造成不利影響。李培棟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，酚酸物質(zhì)可以降低黃瓜幼苗根系活力，增加花生植株的發(fā)病率抑制幼苗的生長。焦煥然等[14]研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類化感物質(zhì)導(dǎo)致植物根際土壤病原真菌豐度增加，對植物根系造成損害，引起中藥材產(chǎn)量、品質(zhì)下降。Zhou 等[15]研究表明，阿魏酸（肉桂酸衍生物）能夠通過改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)抑制黃瓜幼苗的生長。Cui 等[16]以蘭州百合為研究對象，配制不同濃度的根際分泌物2,4-DTBP，探究其對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明微生物群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生變化，土壤真菌病原微生物增加，有益微生物豐度降低。近年來，對化感作用的研究主要集中在化感物質(zhì)的來源方面（植物根系分泌物、秸稈分解和根際土壤提取液），單一化感物質(zhì)對植物自毒作用的研究相對較少[17]。課題組前期利用高效液相色譜檢測到連作2年和連作3年紫蘇根際土壤中存在著一定濃度的苯甲酸(2.08 mmol/L)，因此，筆者以紫蘇種子為研究對象，在催芽過程中添加不同濃度的苯甲酸，探討苯甲酸作為化感物質(zhì)對紫蘇種子萌發(fā)、幼苗生長及葉片抗氧化酶活性的影響，旨在為探究紫蘇連作障礙機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗時間、地點

實驗于2021年9—12月在黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生態(tài)學(xué)專業(yè)實驗室進行。

1.2 實驗材料

供試紫蘇種子為‘龍紫蘇1 號’，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院魏國江提供。

將0.1221 g 苯甲酸溶解于100 mL 蒸餾水得到10 mmol/L 苯甲酸母液，將母液稀釋，蒸餾水作為對照，配制0、1、1.5、2、2.5、3 mmol/L苯甲酸溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子萌發(fā)實驗選擇大而飽滿的紫蘇種子，浸種30 min后取出洗凈，實驗采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)法，在每個培養(yǎng)皿中鋪設(shè)2 層濾紙，分別添加5 mL 各濃度處理液，每個培養(yǎng)皿擺放30粒種子，每組做3次重復(fù)。將它們隨機放置在25℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每天輪換添加等量的蒸餾水和苯甲酸溶液，在每個培養(yǎng)皿中保持相同的溶液濃度，定期記錄每個培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)量。發(fā)芽判別參考GB/T 3543.4—1995，當(dāng)紫蘇種子胚根與種子的長度相同，胚芽長為種子長度的一半時，判定為種子發(fā)芽。測量紫蘇種子胚根、胚軸、株鮮重和連續(xù)7 d種子發(fā)芽情況，計算發(fā)芽率(Gp)、發(fā)芽勢(GE)、發(fā)芽指數(shù)(GI)、活力指數(shù)。

活力指數(shù)=種苗生長量×GI…………………… (4)

式中，M1為發(fā)芽勢天數(shù)內(nèi)的正常發(fā)芽粒數(shù)，M為實驗種子數(shù)，Gt為發(fā)芽實驗周期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)。1.3.2 幼苗生長實驗幼苗生長實驗采用于育苗盒育苗法，每個濃度培養(yǎng)4株紫蘇幼苗。育苗15 d后，選取長勢良好的幼苗移栽至花盆中，實驗期間花盆擺放位置隨機。每個花盆繼續(xù)加入對應(yīng)濃度的苯甲酸5 mL，對照組加入等量蒸餾水。實驗期間保持土壤濕潤，連續(xù)觀察幼苗生長情況。45 d后測量幼苗根重及葉片抗氧化酶活性，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)。葉片酶活性采用張治安等[18]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0 版(SPSS Inc.，Armonk，NY，USA)選用單因素方差分析(ANOVA)和顯著差異(LSD)檢驗對所有參數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05 作為顯著性水平，應(yīng)用Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯甲酸對紫蘇種子萌發(fā)的影響

由表1 可以看出，不同處理紫蘇種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢變化不顯著，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)有顯著變化，總體表現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制。發(fā)芽率在低濃度條件下上升，1.5 mmol/L 苯甲酸處理達到最大，2.5 mmol/L 時抑制率達到50%。發(fā)芽勢在苯甲酸0～2.5 mmol/L 濃度范圍內(nèi)增加，1.5 mmol/L 時發(fā)芽勢達到最高(P<0.05)。當(dāng)苯甲酸濃度為1.5 mmol/L 時，紫蘇種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)表現(xiàn)一致均達到最高，即紫蘇種子萌發(fā)效果最好。結(jié)果表明，紫蘇種子在低濃度的苯甲酸條件下更易萌發(fā)，隨著苯甲酸濃度的增加發(fā)霉和死亡的種子數(shù)目逐漸增多，說明高濃度的苯甲酸嚴(yán)重?fù)p害了紫蘇種子的活性導(dǎo)致種子霉變甚至死亡，抑制種子萌發(fā)。

表1 苯甲酸濃度對紫蘇種子萌發(fā)的影響

2.2 苯甲酸對紫蘇幼苗生長的影響

由表2 可以看出，紫蘇幼苗的胚根長、胚軸長和鮮重受到苯甲酸的抑制，隨著苯甲酸濃度的增加逐漸降低，與對照組具有顯著差異(P<0.05)，說明苯甲酸能夠抑制紫蘇幼苗的生長，且濃度越高抑制效果越嚴(yán)重。

表2 苯甲酸濃度對紫蘇幼苗生長的影響

由圖1可知，隨著苯甲酸濃度的升高，紫蘇幼苗根重明顯下降，且與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)，根重較對照組分別降低了15.79%、23.68%、28.95%、33.79%和46.84%。結(jié)果表明，不同濃度苯甲酸對紫蘇根的生長起到顯著的抑制作用。

圖1 不同濃度苯甲酸對紫蘇幼苗根重的影響

2.3 苯甲酸對紫蘇葉片抗氧化酶活性的影響

2.3.1 紫蘇葉片SOD 活性SOD 酶在細胞中起著清除超氧陰離子自由基的作用，廣泛存在于動植物和微生物細胞中。如圖2所示，隨著外源苯甲酸濃度的增加，紫蘇葉片SOD酶活性呈先上升后下降的趨勢，苯甲酸濃度1.5 mmol/L時紫蘇葉片SOD活性最高，比對照組增加20.26%(P<0.05)。苯甲酸濃度超過2.5 mmol/L，SOD活性比對照組顯著降低，表明紫蘇葉片SOD活性受到顯著抑制。

圖2 不同濃度苯甲酸對紫蘇葉片SOD酶的影響

2.3.2 紫蘇葉片POD活性POD 是以電子受體催化氧化底物的一種氧化還原酶，能將自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基自由基或氧負(fù)離子而清除，從而保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，維持正常生命活動。同時，還具有抗氧化作用，對生物體的許多生理生化過程有著重要影響[19]。如圖3所示，隨著外源苯甲酸濃度的升高，紫蘇葉片POD 活性呈下降趨勢，較對照組分別降低了13.93%、18.22%、19.29%、22.14%和30.36%，與對照組存在顯著差異(P<0.05)。

圖3 不同濃度苯甲酸對紫蘇葉片POD酶的影響

2.3.3 紫蘇葉片CAT 活性CAT 酶普遍存在于植物組織中，是重要的酶促防御系統(tǒng)之一，能夠清除代謝中產(chǎn)生的H2O2，避免過氧化氫積累對細胞造成損傷，其是與植物抗逆性相關(guān)的酶。如圖4 所示，隨著外源苯甲酸濃度的增加，紫蘇葉片CAT 活性呈下降趨勢，較對照組分別降低了4.22%、8.41%、19.55%、31.31%和54.13%，與對照組差異顯著(P<0.05)。

圖4 不同濃度苯甲酸對紫蘇葉片CAT酶的影響

3 討論

連作障礙是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要原因之一，其中，以酚酸類物質(zhì)的影響最大，已成為研究連作障礙問題的典型代表物質(zhì)[19-20]。紫蘇種子粒徑小、種皮較薄，易受化感物質(zhì)作用，故本實驗探討外源添加不同濃度苯甲酸對紫蘇種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。本研究結(jié)果表明，隨著苯甲酸濃度的增加，紫蘇種子的萌發(fā)呈現(xiàn)低濃度促進和高濃度抑制的現(xiàn)象，這一結(jié)果與韓春梅[21]的研究結(jié)果一致，具體表現(xiàn)為1.5 mmol/L 達到最大促進濃度，2.5 mmol/L達到半數(shù)抑制濃度，隨著苯甲酸濃度的繼續(xù)增加，發(fā)霉和死亡的種子數(shù)目逐漸增多，說明高濃度苯甲酸對紫蘇種子萌發(fā)有抑制作用。

根際是植物進行營養(yǎng)攝取最主要的器官[22]，根部重量在一定程度上能夠反映植物的生長速度[23]。本研究結(jié)果表明，隨著苯甲酸濃度的升高，與對照組相比，紫蘇幼苗根重有明顯下降的趨勢(P<0.05)，對紫蘇幼苗的胚根長、胚軸長和植株鮮重均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，整體呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(P<0.05)，說明苯甲酸抑制紫蘇幼苗的生長，且濃度越高抑制作用越明顯。

H2O2、O2-、-OH等是植物生長代謝過程中產(chǎn)生的活性氧，植物通過自身的活性氧產(chǎn)生與消耗體系，使活性氧保持動態(tài)平衡[24]。有研究表明，環(huán)境脅迫條件下活性氧平衡失調(diào)，誘導(dǎo)生物膜過氧化，最終導(dǎo)致細胞膜的損傷乃至植株死亡[25]。酶促防御體系是膜保護系統(tǒng)較為重要的環(huán)節(jié)，SOD 酶在平衡體系中起到基礎(chǔ)的作用，將毒性較強的超氧物陰離子轉(zhuǎn)化成為次級毒性的過氧化氫[26]，在POD、CAT酶的配合下將過氧化氫催化分解，避免過氧化氫與超氧物陰離子相互作用形成更多的氧自由基，導(dǎo)致毒害植物本身[27]。當(dāng)植物處于輕度脅迫下，植物細胞通過自身酶的調(diào)節(jié)和釋放，避免嚴(yán)重的氧化損傷[28]。因此，SOD、POD、CAT 等酶活性可以客觀反映植株受損傷的程度。

許多研究表明，酚酸類化感物質(zhì)的積累會誘發(fā)活性氧平衡失調(diào)[29-31]，如低濃度苯甲酸處理的西瓜幼苗，根際POD 活性顯著升高，高濃度下則促進作用消失，表現(xiàn)為抑制作用[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著苯甲酸濃度的增加，SOD、POD和CAT活性均發(fā)生了變化，SOD活性先升高后降低，POD 和CAT 活性呈直線下降趨勢，說明低濃度苯甲酸激發(fā)了植物酶促防御系統(tǒng)，提高了SOD 活性，在苯甲酸濃度達到2.5 mmol/L 時，脅迫作用增強，SOD活性顯著降低，可能是由于POD、CAT等酶活性持續(xù)降低，無法清除SOD活性升高帶來的更多的過氧化氫，導(dǎo)致無法阻止過氧化氫與O2-相互作用形成的大量氧自由基，導(dǎo)致膜過氧化，破壞了細胞膜脂結(jié)構(gòu)，從而抑制了幼苗的生長。

在自然條件下，化感物質(zhì)在土壤中能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化和微生物降解，會改變其作用強度。由于本實驗在室內(nèi)進行，與田間情況存在一定的差異，因此，設(shè)計田間試驗進一步驗證苯甲酸作為化感物質(zhì)的實際臨界濃度具有更重要的實踐意義。

4 結(jié)論

本研究證明，外源添加苯甲酸對紫蘇種子發(fā)芽表現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制，對紫蘇幼苗的胚根長、胚軸長和植株鮮重均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。苯甲酸作為一種信號因子，在一定閾值內(nèi)能夠啟動植株的酶促保護系統(tǒng)，使植株做出適應(yīng)性調(diào)整，當(dāng)濃度超過防御系統(tǒng)保護閾值，活性氧平衡嚴(yán)重失調(diào)，最終導(dǎo)致紫蘇幼苗生長受到抑制。因此，筆者推測苯甲酸是紫蘇連作障礙的化感物質(zhì)之一，它破壞植物酶促防御系統(tǒng)，抑制紫蘇種子萌發(fā)和幼苗生長，在多年連作土壤中積累造成作物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降，這為采取有效措施緩解紫蘇連作障礙提供了理論依據(jù)。