程錦春，戴 璐，王麗紅，黃先成

基于非靶向代謝組學分析3種青藏高原藥用植物根際土壤代謝產(chǎn)物特征

程錦春1，戴 璐2，王麗紅3，黃先成4

1. 西北民族大學化工學院，甘肅 蘭州 730030 2. 乳山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村事務服務中心，山東 乳山 264511 3. 第三儲備資產(chǎn)管理局蘭州管理站，甘肅 蘭州 730020 4. 威海市文登區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村事務服務中心，山東 威海 264400

探究紅景天、珠芽蓼、瑞香狼毒3種青藏高原常見藥用植物根際土壤代謝物的組成、差異代謝物特性及主要代謝通路。以青藏高原高寒草地的紅景天、珠芽蓼、瑞香狼毒3種藥用植物的根際土壤為實驗材料，采用高分離度液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯(lián)用技術（UPLC-QTOF-MS）的非靶向代謝組學方法進行檢測分析。3種藥用植物的根際土壤樣本間均沒有重疊，組間差異較為明顯。根際土壤樣本顯著差異代謝物結果顯示，珠芽蓼與紅景天和瑞香狼毒的顯著差異代謝物均比較多，而紅景天和瑞香狼毒之間顯著差異代謝物相對較少。ATP結合盒轉運體（ABC transporters）、-谷氨酰胺（-glutamine）和-谷氨酸（-glutamate）代謝、嘌呤代謝（purine metabolism）等3種代謝通路在3種藥用植物根際土壤代謝通路富集中均表現(xiàn)出顯著性最高。3種藥用植物根際土壤樣本的標志代謝物與其主要藥效活性成分密切相關，珠芽蓼次生代謝產(chǎn)物的代謝合成途徑比瑞香狼毒和紅景天更多樣化。3種藥用植物根際土壤代謝途徑是生物合成活性次生代謝產(chǎn)物、適應高寒生態(tài)環(huán)境的重要基礎。

根際土壤；瑞香狼毒；珠芽蓼；紅景天；非靶向代謝組學

藥用植物可以預防、治療疾病，具有極高醫(yī)療和經(jīng)濟價值，中國勞動人民幾千年來在長期和疾病作斗爭的過程中，對藥用植物的使用積累了豐富的經(jīng)驗[1-2]。藥用植物的藥效活性成分主要為其次生代謝產(chǎn)物，研究藥用植物次生代謝物產(chǎn)生過程、代謝途徑、調控方式等是藥用植物研究的重要組成部分[3]。青藏高原是一個天然的藥用植物資源庫，據(jù)統(tǒng)計約有1 200種藥用植物，分布于青藏高原的藥用植物生命力極強，具有耐寒耐旱、有效成分積累高、生物活性強等特點[4]。紅景天Linn.、珠芽蓼Linn.和瑞香狼毒Linn.是青藏高原常見的3種藥用植物，在中藥和民族藥中具有重要的藥用和經(jīng)濟價值。

紅景天ea L.為景天科（Crassulaceae）紅景天屬L.多年生草本藥用植物，主要生長在青藏高原海拔3 000 m以上的高寒地區(qū)[5]。紅景天在我國具有悠久的藥用歷史，其主要活性成分有紅景天苷（salidroside）、酪醇（tyrosol）、紅景天素（rhodosin）、肉桂醇苷（rosavin）和草質素苷（rhodionin）等，具有抗缺氧、抗輻射、保護心腦血管、抗腫瘤與增強免疫力等多種功效[6]。珠芽蓼.L.為蓼科（Polygonaceae）蓼屬L.多年生草本藥用植物，主要分布于青藏高原高山草甸，全株具有廣泛的藥用價值和開發(fā)前景。珠芽蓼含有揮發(fā)油、黃酮、多糖、酚酸類成分，具有清熱解毒、消腫止血、抗腫瘤等功效，是常用的中藥材[7]。瑞香狼毒L.為瑞香科（Thymelaeaceae）狼毒屬L.多年生草本藥用植物，廣泛分布于青藏高原土壤退化的草地[8]。瑞香狼毒的根作為傳統(tǒng)中藥，主要活性成分有香豆素類、黃酮類、二萜類、木脂素類化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲、抗炎、調節(jié)免疫等生物功能[9]。

植物根系不斷分泌各種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物進入土壤，使得根際土壤的營養(yǎng)物質和微生物比較豐富，并且其理化性質和生物學特性與非根際土壤存在非常大的差別[10]。植物根系分泌物的主要成分為各種各樣的含碳代謝物、各種酶、離子和水等，在調控根際土壤環(huán)境的植物生長、營養(yǎng)平衡和生物化學循環(huán)等方面發(fā)揮著重要作用，而且根系分泌物中不同的化合物、酶或某些特異代謝產(chǎn)物對植物和根際微環(huán)境會產(chǎn)生特定影響[11]。因此，對植物根際土壤代謝產(chǎn)物的研究，有助于揭示植物種群與土壤環(huán)境之間的信息傳輸和物質互換，為研究植物對自然環(huán)境改變的響應和調控養(yǎng)分轉換等方面奠定基礎。

非靶向代謝組學可以全面、系統(tǒng)地對機體、組織器官等中所有相對分子質量在1 000以內(nèi)的小分子代謝同時進行定性和定量分析，能盡可能完整客觀地表征樣品中代謝物種類，關注生物學樣本之間的相似性、聚類情況及差異變化[12]。超高效液相色譜-質譜（UPLC-MS）聯(lián)用技術在檢測和量化植物根際土壤代謝產(chǎn)物方面被廣泛利用，該技術分離性好，靈敏度高，可以快速準確地分析樣本內(nèi)所含有的代謝物，結合多元統(tǒng)計方法篩選差異代謝物，并預測代謝物可能的代謝途徑和代謝機制[13]。近年來非靶向代謝組學技術已廣泛地應用于天然產(chǎn)物質量控制與評價、作物品質改良、資源鑒定、新生物標記物開發(fā)等[14-16]。然而，對于青藏高原高寒草地藥用植物根際土壤代謝組學方面的研究相對匱乏。

甘肅省武威市天祝藏族自治縣地處祁連山東端，屬青藏高原東北邊緣，天然草地資源豐富，主要分布在抓喜秀龍、松山、毛藏、西大灘等地。天?？h抓喜秀龍鄉(xiāng)天然草原土壤有機質含量高，祁連山脈的終年積雪提供了豐富的降水資源，在抓喜秀龍草原分布著多種耐寒藥用植物[17]。研究表明，大多數(shù)野生藥用植物受地理環(huán)境和氣候因素等的影響，其藥效品質高于栽培藥用植物[18]。紅景天、珠芽蓼和瑞香狼毒是重要的藏族藥用植物[17]，為高寒地區(qū)藏族人民的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展發(fā)揮了重要的作用，也是民族植物資源的重要組成部分。紅景天、珠芽蓼和瑞香狼毒在天?？h天然草地廣泛分布，且互為伴生植物，這些藥用植物資源在當?shù)夭刈逦幕蜕钪杏泻芨叩牡匚?。然而，目前當?shù)厮幱弥参锢寐实?，野生藥用植物資源沒有得到合理有效的開發(fā)利用。因此，對當?shù)貜V泛分布的野生藥用植物資源進行深入研究，既對藏族藥用植物的保護與開發(fā)具有積極推動作用，還能維護當?shù)孛褡逯参镔Y源的有效利用和可持續(xù)發(fā)展[17]。

為了比較天?？h抓喜秀龍鄉(xiāng)高寒草原廣泛分布的紅景天、珠芽蓼、瑞香狼毒3種藥用植物根際土壤代謝產(chǎn)物，揭示其適應高寒草原生態(tài)環(huán)境的物質基礎，本研究以這3種藥用植物的根際土壤為實驗材料，采用高分離度液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯(lián)用技術（UPLC-QTOF-MS）的非靶向代謝組學方法，分析研究3種藥用植物根際土壤代謝物的組成和特性；基于主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析、熱圖分析、通路分析等多元統(tǒng)計分析方法，篩選出3種藥用植物的差異代謝物，并分析其代謝通路，有助于揭示青藏高原高寒草地不同藥用植物的根際過程，為藥用植物適應高寒草地環(huán)境及根際養(yǎng)分轉化等提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

采樣地點設置在甘肅省武威市天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉(xiāng)（N37°09′39″，E102°48′22″），海拔高度為2 874 m，采集時間為2021年7月15～18日。3種藥用植物的標本由蘭州大學生命科學學院的潘健斌講師分別鑒定為瑞香狼毒Linn.、珠芽蓼Linn.和紅景天Linn.，保存在西北民族大學化工學院。選擇瑞香狼毒、紅景天和珠芽蓼生長蓋度較高的樣地，設置3個10 m×10 m的樣方，每個樣方間隔50 m以上。在每個樣方內(nèi)，分別采集8株大小、長勢一致的瑞香狼毒、紅景天以及珠芽蓼植株，抖落根部的土壤，將粘附在根部2 mm內(nèi)的土壤，用干凈毛刷將所有土壤收集到采樣袋內(nèi)，即為根際土壤。將每個樣方每種植物得到的8份根際土壤分別進行均勻混樣，即得到瑞香狼毒、紅景天和珠芽蓼的根際土壤各3份。分別取5 g左右的土壤放入10 mL離心管，并用封口膜封口，液氮速凍10～15 min，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器

高分辨質譜儀（賽默飛世爾科技公司）；Nexera 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；TYXH-I型漩渦振蕩器（上海汗諾儀器有限公司）；SB-5200DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）； TGL-16MS型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；JXFSTPRP-24/32型全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）

2 方法

2.1 代謝組樣品前處理

實驗前提取試劑甲醇、甲酸、水、乙腈以及-2-氯苯丙氨酸均在?20 ℃下預冷，化學藥品和溶劑均為色譜級。準確稱取瑞香狼毒、紅景天以及珠芽蓼根際土壤樣品各0.50 g，加入內(nèi)標（-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配制）10 μL和1 mL甲醇水溶液（1∶1）；依次加入2顆小鋼珠，在?20 ℃放置2 min預冷，加入研磨機研磨（60 Hz，2 min）；將勻漿后的樣品轉移至15 mL離心管中，用1 mL甲醇水溶液（1∶1）轉移管壁殘留，重復上述操作1次；離心10 min（4 ℃、7 700 r/min），取上清2.5 mL于5 mL離心管中，凍干；用400 μL甲醇水溶液（1∶4）復溶，渦旋震蕩60 s，超聲30 s；離心10 min（4 ℃、12 000 r/min），用注射器吸取150 μL的上清液，0.22 μm的有機相針孔過濾器濾過后，轉移到LC進樣小瓶，?80 ℃下保存，直到進行LC-MS分析。質控樣本（quality control，QC）由所有樣本的提取液等體積37.5 μL混合制備而成，QC的體積與樣本相同；重復3次，在儀器檢測的過程中，每6個檢測分析樣本中插入1個QC樣本，以考察整個分析過程的重復性。

2.2 色譜條件

采用Nexera UPLC超高效液相串聯(lián)QE高分辨質譜儀組成的液質聯(lián)用系統(tǒng)對樣品進行分離。分離條件：色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～2 min，95% A；2～4 min，95%～70% A；4～8 min，70%～50% A；8～10 min，50%～20% A；10～14 min，20%～0 A；14～16 min，0～95% A；柱溫25 ℃；體積流量0.35 mL/min；進樣量2 μL，整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。

2.3 質譜條件

樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式，質譜掃描的選擇范圍為125～1 000/，全掃描分辨率為70 000，高分辨高能量碰撞解離質譜（HCD MS/MS）掃描分辨率為17 500，毛細管溫度為320 V。ESI 源設置為：檢測模式ESI＋，噴霧電壓3.5 kV，鞘氣體流量40 arb，輔助氣體流量10 arb；檢測模式ESI?，噴霧電壓?3 kV，鞘氣體流量35 arb，輔助氣體流量8 arb。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2.4.1 代謝物鑒定 將得到的原始數(shù)據(jù)轉換成 mzXML格式，利用Waters公司的Progenesis QI v2.3軟件，對原始數(shù)據(jù)進行預處理，將采集得到的譜圖進行過濾噪音、解卷積、峰強度校正、峰定性和定量等分析，刪除組內(nèi)缺失值＞50%的離子峰，最后整理成二維數(shù)據(jù)矩陣形式，包含保留時間（retentiontime，R）、代謝物名稱（metabolites）、質荷比（/）、化合物分子式（formula）等信息，再基于The Human Metabolome Database（HMDB）、Lipidmaps（v2.3）和METLIN數(shù)據(jù)庫以及上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司自建庫，質量誤差設置為小于1×10?6，并結合二級質譜匹配得分，對代謝物進行鑒定。

2.4.2 數(shù)據(jù)處理 利用軟件SIMCA-P 14.1進行多元統(tǒng)計分析，包括PCA、偏最小二乘法分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘法分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。同時進行Student’s t-test和變異倍數(shù)分析，使用R 軟件繪制火山圖的單維統(tǒng)計分析方法。差異化合物篩選條件：＜0.05、VIP＞1。利用R軟件對VIP值前50差異代謝物的表達量進行層次聚類和繪制火山圖對值、VIP和Fold change值進行可視化，利于篩選差異代謝物。相關性分析使用Pearson相關系數(shù)衡量兩個代謝物之間的線性相關程度。利用差異代謝物的KEGG ID進行通路富集分析，通過超幾何檢驗，分析在顯著性差異表達代謝物中顯著富集的代謝通路（≤0.05）。

3 結果與分析

3.1 質量控制和PCA

QC樣本用于測定進樣前儀器狀態(tài)及平衡色譜-質譜系統(tǒng)，并用于評價整個實驗過程中系統(tǒng)穩(wěn)定性。采用XCMS軟件提取代謝物離子峰，將提取得到的所有實驗樣本和QC樣本的峰，標準化后經(jīng)Pareto-scaling處理后進行PCA分析（圖1-a）。經(jīng)7-fold cross-validation（7次循環(huán)交叉驗證）得到的總樣品PCA模型參數(shù)，觀察樣本之間的分布趨勢。QC樣本緊密聚集在一起，表明此實驗過程中儀器檢測穩(wěn)定性較好，本實驗的重復性好。因此，本實驗的質譜分析系統(tǒng)穩(wěn)定性較好，得到的實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，可為接下來的實驗結果提供有效參數(shù)。3種植物的所有根際土壤樣本能夠鑒定出的代謝物種類總有5 882種，其中正離子模式下有4 308種，負離子模式下有1 574種。對3種植物的根際土壤樣本兩兩組合，分別進行PCA分析（圖1-b～d）。從圖1可以看出，無論正、負離子模式下，2組樣本均處于各自的95%的置信區(qū)間內(nèi)，3種植物的根際土壤均能顯著區(qū)分。

圖1 3種植物根際土壤樣本代謝物的PCA

3.2 根際土壤樣本的OPLS-DA

建立瑞香狼毒、珠芽蓼、紅景天3種植物根際土壤樣本分組的OPLS-DA模型（表1、圖2）。由表1的模型評價參數(shù)可知，2等于1，2、2均接近1，說明建立的模型穩(wěn)定可靠。圖2顯示，3組樣本中，瑞香狼毒和珠芽蓼、珠芽蓼和紅景天、紅景天和瑞香狼毒中，樣本間均沒有重疊，說明3種植物的組間差異較為明顯。

表1 OPLS-DA模型的評價參數(shù)

圖2 3種植物根際土壤樣本代謝物的OPLS-DA分析

3.3 根際土壤樣本差異代謝物的火山圖分析

3種植物根際土壤樣本兩兩組合差異代謝物火山圖見圖3，可知不論是那2種植物根際土壤樣本，上調的差異代謝物比下調的代謝物都要高的多，尤其是珠芽蓼和紅景天的根際土壤中顯著上調的代謝物比下調代謝物高248種；瑞香狼毒和珠芽蓼根際土壤上調的差異代謝物比下調的代謝物高167種，瑞香狼毒和紅景天根際土壤上調的差異代謝物比下調的代謝物高69種。從表2可以看出，瑞香狼毒和紅景天根際土壤差異代謝物種類較少，上調的差異代謝物為185種，下調的代謝物為116種；珠芽蓼和紅景天根際土壤差異代謝物種類較多，上調的差異代謝物為320種，下調的代謝物為72種；珠芽蓼和瑞香狼毒根際土壤差異代謝物種類也相對較多，上調的差異代謝物為256種，下調的代謝物為89種。

3.4 根際土壤樣本差異代謝物聚類熱圖分析

為了更直觀的展示根際土壤樣本之間的關系及代謝物在不同樣本之間的表達差異，對各比較組顯著差異代謝物VIP值前50（top 50）差異代謝物進行統(tǒng)計，并對前50差異代謝物的表達量進行層次聚類，聚類圖見圖4。圖中紅色為高表達代謝物，藍色為低表達代謝物，顏色從藍到紅表示代謝物的表達豐度從低到高，即越紅表示差異代謝物的表達豐度越高。3種植物根際土壤樣本在兩兩比對時，代謝物均各自聚集在同一簇中，每個樣品組代謝物在豐度上均差異顯著，說明選擇的差異代謝物可作為標志物將3組樣品兩兩區(qū)分開來，其中有些代謝物聚集在一塊，可能它們具有相似的功能或參與同一條代謝通路（圖4）。

橫坐標為代謝物在不同分組中表達倍數(shù)的變化，縱坐標表示差異顯著性水平，火山圖中每個點代表一個代謝物，藍色圓點表示顯著下調的代謝物，紅色圓點表示顯著上調的代謝物，圓點的大小代表VIP值。設定log2FC閾值為＞1.5，且P＜0.05。

表2 代謝物差異顯著分析結果

雖然50種顯著差異代謝物在2種不同植物根際土壤上調或下調差異程度不同，但趨勢同步。珠芽蓼和紅景天根際土壤樣本比較組中，50種顯著差異代謝物可聚分為2大類：一類在珠芽蓼根際土壤高表達的，有24種；另一類為在紅景天根際土壤高表達的，有26種（圖4-a）。瑞香狼毒和紅景天根際土壤樣本比較組中，50種顯著差異代謝物也可聚分為2大類：一類在紅景天根際土壤高表達的，有24種；另一類為在瑞香狼毒根際土壤高表達的，有26種（圖4-b）。同樣地，瑞香狼毒和珠芽蓼根際土壤樣本比較組中，50種顯著差異代謝物聚分為2大類：一類在珠芽蓼根際土壤高表達的，有28種；另一類為在瑞香狼毒根際土壤高表達的，有22種（圖4-c）。

3.5 根際土壤樣本標志代謝物篩選

對瑞香狼毒、紅景天和珠芽蓼根際土壤樣本各比較組顯著差異代謝物VIP值前50且＜0.05的差異代謝物的豐度聚類圖進行比較，分別確定3個根際土壤樣本比較組表達量最高的差異代謝物（表3）。珠芽蓼根際土壤樣本中檢測到表達量高的16種差異性代謝物，均在正離子模式下，而且所有差異性代謝物均上調，這些代謝物多屬于烴、脂肪酸類、氨基酸類和糖苷類化合物（表3、圖5）。紅景天根際土壤樣本中檢測到表達量高的16種差異性代謝物（圖6），正離子模式下有11種，負離子模式下有5種，所有差異性代謝物均上調，這些代謝物它們多屬于碳水化合物及其結合物、氨基酸、肽類、糖苷類（圖6、表4）。瑞香狼毒根際土壤樣本中檢測到表達量高的18種差異性代謝物（表5、圖7），正離子模式下有10種（圖7-a），負離子模式下有8種（圖7-b），所有差異性代謝物均下調，這些代謝物多為雙黃酮類、植物磺肽素、呋喃類、狼毒素類以及苯甲酮類化合物。

圖4 3種植物根際土壤差異代謝物聚類熱圖

表3 珠芽蓼根際土壤樣本表達量最高的16種差異代謝物

1-(?)-11-hydroxy-9,10-dihydrojasmonic acid 11-β-D-glucoside; 2-tryptophyl-lysine; 3-(9Z,12Z)-3-hydroxyhexadecadienoylcarnitine; 4-BILA 2185BS; 5-blumenol C O-[apiosyl-(1→6)-glucoside]; 6-1-dimethylarsinoyl-(3Z,6Z,9Z,12Z,15Z,18Z)-2-docosahexaene; 7-glucosyl (2E,6E,10x)-10,11-dihydroxy-2,6-farnesadienoate; 8-blumenol C O-[rhamnosyl-(1→6)-glucoside]; 9-hydroxydestruxin B; 10-globomycin; 11-2,6-dimethyl-6-O-β-D-quinovopyranosyl-7-octadecenoic acid; 12-(3S,4S)-3-hydroxytetradecane-1,3,4-tricarboxylic acid; 13-LY255283; 14-erythronolide B; 15-hydroxyhomodestruxin B; 16-lyciumoside VIII.

3.6 根際土壤樣本代謝通路富集分析

通過對3種植物根際土壤樣本差異代謝物進行通路富集分析，可對各比較組樣本中代謝途徑的變化進行了解?；贙EGG數(shù)據(jù)庫，利用差異代謝物的KEGG ID獲得代謝通路富集結果，通過超幾何檢驗，在顯著性差異表達代謝物中顯著富集的pathway條目，以此對差異代謝物進行代謝通路富集分析。亞油酸代謝（linoleic acid metabolism），甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，-谷氨酰胺和-谷氨酸代謝（-glutamine and-glutamate metabolism），嘌呤代謝（purine metabolism）4條代謝通路是3個比較組中極顯著富集的代謝通路（＜0.01）。由代謝通路氣泡圖可知（圖8），各比較組中ATP結合盒轉運體（ABC transporters）、-谷氨酰胺和-谷氨酸代謝和嘌呤代謝3種代謝通路在圖中點均較高，說明其代謝物相對較多，顯著性較高，是三者重要的代謝通路。

4 討論

次生代謝物是藥用植物發(fā)揮藥效價值的活性物質基礎，藥用植物通過生物合成，產(chǎn)生千變?nèi)f化的分子結構以及多種多樣的活性作用的次生代謝產(chǎn)物，是藥物分子的重要實體來源。近年來代謝組學廣泛應用于藥用植物研究，為藥用植物開發(fā)利用和資源保護發(fā)揮了重要作用[19]。植物根際土壤作為植物根系與外界土壤物質交換和能量流動的重要媒介，所占的體積相對較小，但植物根系不斷地分泌各種代謝產(chǎn)物，以及根表組織持續(xù)凋亡脫落進入根際土壤，使得根際土壤的營養(yǎng)物質、微生物比較豐富，且其理化性質和生物學特性也有別于非根際土壤[20]。因此研究藥用植物根際土壤代謝物的組成、差異代謝物分析、標志代謝物篩選以及代謝通路富集分析對深入研究藥用植物次生代謝產(chǎn)物合成路徑，調控因子以及代謝網(wǎng)絡具有重要作用。

a: 1-1-methylguanosine; 2-moracin G; 3-threoninyl-glycine; 4-propionylcarnitine; 5-L-glutamate; 6-DL-2-aminooctanoic acid; 7-L-histidine trimethylbetaine; 8-meptazinol glucuronide; 9-N-acetylmannosamine; 10-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-2-one; 11-valyl-proline.

紅景天、珠芽蓼和瑞香狼毒是青藏高原常見藥用植物，也是民族藥的重要組成部分。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然3種藥用植物在青藏高原具有共同的自然生活環(huán)境，但其根際土壤代謝物組成存在顯著差異，PCA與OPLS-DA分析均表明，3種藥用植物根際土壤樣本間均沒有重疊，組間差異較為明顯。這可能與3種植物屬于不同的科，親緣關系較遠有關。在對3種藥用植物根際土壤樣本顯著差異代謝物分析中發(fā)現(xiàn)，珠芽蓼與紅景天和瑞香狼毒的顯著差異代謝物均比較多，而紅景天和瑞香狼毒之間顯著差異代謝物相對較少，這個結果在一定程度反映了珠芽蓼次生代謝產(chǎn)物的代謝合成途徑可能更多變。

表4 紅景天根際土壤樣本表達量最高的16種代謝物

表5 瑞香狼毒根際土壤樣本表達量最高的18種代謝物

a: 1-3-[5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-oxo-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-8-yl]-5,7-dihydroxy-2-phenyl-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-4-one; 2-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-8-[1-(2,4-dihydro- xyphenyl)-2-hydroxy-3-(3-hydroxyphenyl)propyl]-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-3,5,7-triol; 3-metho- xyphenyl)-4-oxo-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-8-yl]-5,7-dihydroxy-2-phenyl-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-4-one; 4-CDP-DG(a-13:0/a-13:0); 5-isochamaejasmin; 6-(2S,2''S,3S,3''R,4S)-3,4',5,7-tetrahydroxy-flavan(2→7,4→8)-3,4',5,7-tetrahydroxy-flavan; 7-(?)-epiafzelechin 3-gallate; 8-3,4,5-trihydroxy-6-([8-hydroxy-17-methoxy-10-oxo-2-oxatricycloicosa-1(17),3,5,7(20), 15, 18-hexaen-4-yl]oxy) oxane-2-carboxylic acid; 9-p-hydroxybenzophenone; 10-3-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-8-yl]-5,7-dihydroxy-2-phenyl-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-4-one.

本研究發(fā)現(xiàn)，3種藥用植物根際土壤樣本的標志代謝物與其主要活性成分密切相關紅景天根際土壤樣本中檢測到表達量最高的標志性代謝物多屬于碳水化合物及其結合物、氨基酸、肽類、糖苷類等，碳水化合物及其結合物、氨基酸和糖苷類物質等是合成紅景天苷、紅景天素（主要為黃酮類物質）及紅景天多糖的前體[6]。瑞香狼毒根際土壤樣本中檢測到表達量高的標志性代謝物多為雙黃酮類、植物磺肽素、呋喃類、狼毒素類以及苯甲酮類化合物，而瑞香狼毒根中的多種黃酮類、香豆素類及二萜類等活性成分都具有較強的抗腫瘤、抗病毒作用[9]，瑞香狼毒根部合成的活性化合物以根系分泌物的方式進入根際土壤，有利于瑞香狼毒種群的種間競爭和環(huán)境適應能力。珠芽蓼根際土壤樣本中檢測到的標志性代謝物多屬于烴、脂肪酸類、氨基酸類和糖苷類化合物，據(jù)報道，珠芽蓼根莖富含揮發(fā)油、黃酮苷、香豆精、有機酸和多糖等活性成分[7]，這些活性成分的生物合成前體和中間體中包括了其分泌到根際土壤中的標志性代謝物。由此可見，3種藥用植物的某些活性次生代謝產(chǎn)物在體內(nèi)合成之后，可通過根系分泌的方式進入根際土壤環(huán)境，影響藥用植物的根際微域環(huán)境[21]。

在3種藥用植物根際土壤樣本的3個比較組中，ATP結合盒轉運體（ATP transporters）、-谷氨酰胺和-谷氨酸代謝（-glutamine and-glutamate metabolism）、嘌呤代謝（purine metabolism）3種代謝通路的顯著性最高，其中-谷氨酰胺和-谷氨酸代謝的富集程度最大。在3個比較組中，氧戊二酸（oxoglutaric acid）、聚-g--谷氨酸（poly-g--glutamate）存在于-谷氨酰胺和-谷氨酸代謝通路且顯著上調，即植物體中-谷氨酰胺在谷氨酰胺酶以及天冬酰胺酶催化下，合成-谷氨酸，在谷氨酸脫氫酶催化下形成氧戊二酸，或直接轉化為聚-g--谷氨酸，增加植物對氮素的利用率[22-23]。ATP結合盒轉運體是植物體內(nèi)重要的轉運體家族，參與著多種代謝產(chǎn)物的分布，包括無機離子、單糖、聚糖、膽固醇、磷脂、氨基酸、肽、蛋白質、毒素、藥物、抗生素和異源物質等[24-25]。嘌呤代謝（purine metabolism）是核酸堿基腺嘌呤及鳥嘌呤等的嘌呤衍生物的活體合成及分解的主要代謝途徑[26-27]。這些代謝途徑可能是不同藥用植物在青藏高原高寒環(huán)境下，次生代謝產(chǎn)物生物合成、適應高寒草地生態(tài)環(huán)境、種間生態(tài)競爭及根際養(yǎng)分和能量循環(huán)的重要基礎。

縱坐標為代謝通路名稱；橫坐標為富集因子（富集因子＝顯著差異代謝物個數(shù)/該通路中的總代謝物個數(shù)），富集因子越大，則說明富集程度越大；顏色由綠到紅表示P值依次降低；點越大，說明富集到該通路上的代謝物數(shù)目越多。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis of metabolite characteristics of rhizosphere soils of three medicinal plants on Qinghai Tibet Plateau based on non-targeted metabolomics

CHENG Jinchun1, DAI Lu2, WANG Lihong3, HUANG Xiancheng4

1. Chemical Engineering College, Northwest Minzu University, Lanzhou 730030, China 2. Rushan Agricultural and Rural Affairs Service Center, Rushan 264511, China 3. Third Reserve Assets Administration, Lanzhou Administration Station, Lanzhou 730020, China 4. Wendeng Agriculture and Rural Affairs Service Center, Weihai 264400, China

To investigate the composition, differential metabolite characteristics, and main metabolic pathways of metabolites in the rhizosphere soil of three common medicinal plants, namely,and, on the Qinghai Tibet Plateau.The rhizosphere soil samples of these three medicinal plants in the alpine grassland of Qinghai Tibet Plateau were detected and analyzed by using the non-targeted metabonomics method of high resolution ultra performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS).The results showed that there was no overlap between the rhizosphere soil samples of the three medicinal plants, and there were significant differences between the each compare group. The results of significantly different metabolites in rhizosphere soil samples showed that there were more significantly different metabolites between,and, while relatively less significantly different metabolites betweenand. ATP binding cassette transporters (ABC transporters),-glutamine and-glutamate metabolism, and purine metabolism showed the highest concentration of metabolic pathways in the rhizosphere soil of the both three medicinal plants.The signature metabolites in the rhizosphere soil of three medicinal plants are closely related to their main active constituents. The metabolic pathways of the secondary metabolites ofare more diverse than those ofand. The rhizosphere soil metabolic pathways of three medicinal plants are important foundations for the biosynthesis of active secondary metabolites and adapting to alpine ecological environments.

rhizosphere soil;L.;L.;L.; non-targeted metabolomics

R286.2

A

0253 - 2670(2024)08 - 2734 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.022

2023-08-13

2020年中央高校基本科研業(yè)務費項目（31920200121）

程錦春，副教授，主要從事天然產(chǎn)物化感效應及藥學活性研究。E-mail: 122585523@qq.com

[責任編輯 時圣明]