梁朋朋，王雅樂，黃 海，李桂云，吳紅彥

·數(shù)據(jù)挖掘與循證醫(yī)學(xué)·

基于生信分析和動(dòng)力學(xué)模擬鑒定阿爾茨海默病免疫標(biāo)志物及靶向藥食同源中藥預(yù)測

梁朋朋，王雅樂，黃 海，李桂云，吳紅彥

上海中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518004

分析阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s，AD）免疫相關(guān)的生物標(biāo)志物、發(fā)病機(jī)制、免疫浸潤水平和潛在的靶向藥食同源中藥。從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE5281、GSE132903數(shù)據(jù)集的表達(dá)譜，獲得AD差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）。采用加權(quán)共表達(dá)算法鑒定出AD重要模塊基因，再從ImmPortPortal數(shù)據(jù)庫獲取免疫相關(guān)基因（immune-related genes，IRGs），將這些基因取交集得到免疫重要差異基因；隨后應(yīng)用最小絕對收縮和選擇算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）及機(jī)器學(xué)習(xí)-支持向量機(jī)遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）方法進(jìn)行分析，篩選出AD共同的免疫相關(guān)標(biāo)志物，并通過基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探索生物途徑。然后，通過受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線來評估其鑒別能力，并在GSE122063數(shù)據(jù)集中進(jìn)行驗(yàn)證。此外，建立臨床列線圖和曲線進(jìn)行臨床應(yīng)用評估?；谵D(zhuǎn)錄樣本中不同細(xì)胞類型相對豐度算法（cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts，Cibersort）和單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤分析。最后，運(yùn)用Coremine Medical、Herb數(shù)據(jù)庫進(jìn)行中藥和成分分析，并進(jìn)行分子對接和動(dòng)力學(xué)模擬。共篩選出1 360個(gè)DEGs和富半胱氨酸和甘氨酸的蛋白質(zhì)1（cysteine and glycine rich protein 1，）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，）、白細(xì)胞介素4受體（interleukin 4 receptor，）、生長抑素（somatostatin，）、人核因子-κB抑制蛋白α（nuclear factor-kappa B inhibitor alpha，）5個(gè)生物標(biāo)志物。GO分析顯示AD與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和細(xì)胞發(fā)育的正向調(diào)節(jié)高度相關(guān)；KEGG和GSEA富集結(jié)果顯示AD與B細(xì)胞受體信號(hào)通路、糖胺聚糖生物合成途徑等通路最為密切。免疫浸潤分析顯示AD腦組織內(nèi)巨噬細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、中心記憶CD8 T細(xì)胞等比例上升，初始CD4+T細(xì)胞、活化的CD8+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞比例下降，B2M、CD40等檢查位點(diǎn)有明顯差異。潛在靶向中藥有人參、當(dāng)歸、厚樸花等82種，四氣五味以溫、寒、平、辛、苦、甘為主，歸經(jīng)以肝、肺、脾、胃經(jīng)為主，功效以清熱、活血、補(bǔ)虛居多。分子對接和動(dòng)力學(xué)模擬顯示20()-原人參二醇與標(biāo)志物對接穩(wěn)定。通過多種方法篩選出了AD的生物標(biāo)志物，通過富集分析得到了AD相關(guān)的生物過程及信號(hào)通路，闡釋了免疫相關(guān)機(jī)制，人參、當(dāng)歸、厚樸花等藥食同源類中藥有望成為AD新藥開發(fā)的重要來源，為AD發(fā)病機(jī)制、臨床治療、藥物研發(fā)提供新的思路。

阿爾茨海默病；加權(quán)共表達(dá)分析；機(jī)器學(xué)習(xí)；免疫浸潤；生物標(biāo)志物；人參；當(dāng)歸；厚樸花；20()-原人參二醇

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又稱原發(fā)性變性癡呆，常發(fā)生于老年人，是一種具有不可逆性和致死性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，常伴有進(jìn)行性認(rèn)知障礙、記憶缺陷、人格和行為改變等癥狀表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。此外，臨床上缺乏特異性的診斷標(biāo)志物，許多AD患者在癡呆發(fā)病的前幾年一般沒有任何癥狀，無法準(zhǔn)確診斷或采取預(yù)防措施，延誤了診斷和治療的最佳時(shí)機(jī)[2-3]。相關(guān)研究報(bào)告指出，全世界約有5 000萬AD患者，到2050年，AD患者的數(shù)量將增加到1.52億，導(dǎo)致高達(dá)9億美元的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[4]。關(guān)于AD的確切病理機(jī)制尚不清楚，主要認(rèn)為與老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)細(xì)胞死亡有關(guān)[5]。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)免疫炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞作用顯著[6-7]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種特殊的固有免疫細(xì)胞，在腦炎癥反應(yīng)中起著主要作用。研究表明[8]，M1小膠質(zhì)細(xì)胞具有促炎作用，可分泌促炎因子來加重神經(jīng)元損傷，如白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。相反，M2小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過分泌抗炎因子和特定的神經(jīng)營養(yǎng)因子來調(diào)節(jié)腦微環(huán)境，促進(jìn)組織修復(fù)，進(jìn)而調(diào)節(jié)淀粉樣斑塊的靶向和清除。此外，大腦中淀粉樣蛋白的異常沉積可與免疫細(xì)胞表型結(jié)合，如CD36、Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）和TLR6，也可導(dǎo)致促炎因子和趨化因子產(chǎn)生，激活顱內(nèi)炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和AD進(jìn)展的惡化[9-10]。因此，臨床上在清除β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）和微管相關(guān)蛋白-tau（microtubule-associated protein-tau，MAPT）等病理蛋白的基礎(chǔ)上，同時(shí)多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)大腦免疫系統(tǒng)有望成為AD治療的潛在策略之一。當(dāng)前大量文獻(xiàn)證實(shí)機(jī)體免疫可調(diào)節(jié)AD，但在這些與AD相關(guān)的研究中系統(tǒng)分析核心基因、評估免疫細(xì)胞豐度差異、免疫基因和免疫細(xì)胞間相關(guān)性的研究相對較少。

臨床上治療AD的藥物如美金剛胺、多奈哌齊等只能短期改善認(rèn)知功能，治療時(shí)間久，合并用藥多，長期用藥會(huì)產(chǎn)生頭暈、惡心、腹瀉、肝腎毒性等不良反應(yīng)[11-12]。隨著國內(nèi)外治療AD藥物的研發(fā)遭遇瓶頸，中藥研究給科研工作者提供了全新的思路和研究價(jià)值。黃連解毒湯、開心散、黑逍遙散等諸多復(fù)方是臨床治療AD的經(jīng)典方劑，并且組成中藥多數(shù)以藥食同源類為主。研究證實(shí)，此類復(fù)方可以通過其有效成分改善膽堿能神經(jīng)功能、減輕氧自由基損傷、抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡等途徑改善AD患者學(xué)習(xí)和記憶，高效低毒，具有明顯的治療優(yōu)勢[13-15]。到目前為止，國家已經(jīng)公布了110種藥食同源中藥，然而對此類中藥及其成分調(diào)節(jié)免疫改善AD的機(jī)制尚不明析，且仍有中藥尚未發(fā)掘。因此，積極探索具有潛在治療作用的靶向中藥及化合物，歸納用藥規(guī)律，不僅可以為AD的臨床治療提供更多選擇，同時(shí)也可進(jìn)一步發(fā)掘此類中藥的藥食價(jià)值。

基于上述認(rèn)識(shí)，本研究利用生物信息學(xué)方法，從GEO數(shù)據(jù)庫獲取AD患者和正常人群的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）、機(jī)器學(xué)習(xí)篩選免疫相關(guān)標(biāo)志物，通過轉(zhuǎn)錄樣本中不同細(xì)胞類型相對豐度算法（cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts，Cibersort）和單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）算法對AD的免疫浸潤情況進(jìn)行評估，最后通過Coremine Medical、Herb數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶向中藥和化合物，并使用分子對接和動(dòng)力學(xué)模擬做進(jìn)一步驗(yàn)證，以期為AD的預(yù)防、治療及保健食品研發(fā)提供參考依據(jù)。研究流程見圖1。

圖1 研究流程圖

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)的下載和處理

從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中獲得了3個(gè)原始數(shù)據(jù)集（GSE132903[16]、GSE5281[17]和GSE122063[18]）。GSE132903基于GPL10558平臺(tái)，包括97個(gè)AD患者和98個(gè)正常人（對照）樣本；GSE122063基于GPL16699平臺(tái)，包括56個(gè)AD患者和44個(gè)對照樣本；GSE5281基于GPL570平臺(tái)，包括87個(gè)AD患者和74個(gè)對照樣本。隨后，對每個(gè)數(shù)據(jù)集中的探針進(jìn)行注釋，并根據(jù)相應(yīng)的平臺(tái)注釋文件轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名。將GSE5281和GSE132903數(shù)據(jù)集的表達(dá)譜合并為訓(xùn)練集，并利用sva包調(diào)整批效應(yīng)，用于后續(xù)的WGCNA和機(jī)器學(xué)習(xí)等分析。另外將GSE122063作為額外數(shù)據(jù)集用于驗(yàn)證。

1.2 免疫相關(guān)基因獲取

ImmPort是目前權(quán)威較高的人類免疫基因數(shù)據(jù)庫之一，可以下載數(shù)據(jù)進(jìn)行有效分析。從ImmPort數(shù)據(jù)庫（https://www.immport.org/home）下載人類免疫基因集，剔除重復(fù)基因后獲得1 793個(gè)免疫相關(guān)基因（immune-realated genes，IRGs）。

1.3 差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的分析

對數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化處理后，使用“l(fā)imma”R包分析AD和對照樣本之間的差異基因。以差異表達(dá)倍數(shù)的絕對值大于0.5且值小于0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。使用R軟件ggplot2軟件包和“復(fù)雜熱圖”分別繪制了火山圖和熱圖，以顯示顯著調(diào)控的重要基因。

1.4 WGCNA

WGCNA是一種常用模塊化分析技術(shù)，常用于識(shí)別和篩選復(fù)雜疾病生物標(biāo)志物或藥物靶點(diǎn)，鑒定高度協(xié)同變化基因表達(dá)矩陣，為研究疾病的潛在機(jī)制提供新方向。利用R軟件中的“WGCNA”包構(gòu)建了一個(gè)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[19]。使用合并數(shù)據(jù)集中方差前5 000個(gè)基因構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，模塊內(nèi)最小基因數(shù)設(shè)置為30。隨后將鄰接矩陣轉(zhuǎn)化為拓拓?fù)渲丿B矩陣（topological overlap matrix，TOM），構(gòu)建多個(gè)基因模塊及分層聚類樹。最后，評估了每個(gè)模塊與臨床特征之間的相關(guān)性，計(jì)算模塊基因顯著性（gene significance，GS）以及模塊顯著性（module membership，MM）用以衡量基因與生物模塊和臨床信息的相關(guān)性、顯著性，提取重要模塊和基因用于后續(xù)分析。

1.5 樞紐免疫相關(guān)DEGs的鑒定

為了準(zhǔn)確識(shí)別重要基因，將DEGs、WGCNA中的模塊基因和IRGs取交集，以鑒定免疫樞紐基因集，為確保在兩數(shù)據(jù)集中差異基因均含有樞紐基因，再次進(jìn)行了交集運(yùn)算，獲取最終免疫樞紐基因，采用Venn圖展示結(jié)果。隨后，對免疫樞紐基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，以分析相關(guān)生物功能和通路。

1.6 對診斷特征基因的機(jī)器學(xué)習(xí)

機(jī)器學(xué)習(xí)是處理高維復(fù)雜數(shù)據(jù)常用的工具之一。使用2種機(jī)器學(xué)習(xí)算法最小絕對收縮和選擇算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）及機(jī)器學(xué)習(xí)-支持向量機(jī)遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）進(jìn)行特征基因預(yù)測。LASSO可以提升正則化來提高預(yù)測準(zhǔn)確度的回歸分析算法。使用R4.2.0軟件的“glmnet”軟件包開展LASSO回歸分析。SVM是一是一種線性分類器，使用基于SVM的最大間隔原理訓(xùn)練樣本，不斷迭代，最后選出需要的特征數(shù)，使用“e1071”R包來識(shí)別具有最高鑒別能力的基因。

1.7 評估生物標(biāo)志物對AD的診斷價(jià)值

使用R軟件中的pROC包繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線圖，評估已確定的生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值。在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE122063中進(jìn)一步驗(yàn)證候選標(biāo)記物的表達(dá)水平及診斷效能。使用R軟件中的“rms”包建立列線圖進(jìn)行綜合風(fēng)險(xiǎn)分值評估，然后繪制校準(zhǔn)曲線用于評估列線圖模型的預(yù)測能力，最后使用R軟件中的“rmda”包繪制遺傳決策曲線和臨床影響曲線評估模型的臨床決策和效用價(jià)值。

1.8 基因集合富集分析

基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）是使用快速GSEA R包來闡明特征基因的生物學(xué)意義。為了實(shí)現(xiàn)每個(gè)分析的標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)，進(jìn)行1 000次的基因集排列。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05為顯著富集。

1.9 免疫細(xì)胞亞型的豐度及表達(dá)差異評價(jià)

使用Cibersort反卷積算法和ssGSEA分析免疫浸潤細(xì)胞的豐度和相關(guān)性。Cibersort方法主要依賴于LM22的免疫細(xì)胞亞型表達(dá)矩陣，使用Ciber Sort R腳本對其矩陣進(jìn)行定性和定量分析。ssGSEA算法基于TISIDB網(wǎng)站獲得28種免疫相關(guān)基因集進(jìn)行豐度計(jì)算。通過Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析組間免疫細(xì)胞的豐度差異及比較37個(gè)免疫檢查位點(diǎn)差異?；趕sGSEA的分析結(jié)果，分析特征基因與免疫細(xì)胞種類的相關(guān)性，以＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用corrplot包繪制圖形。

1.10 潛在靶向中藥預(yù)測分析與核心成分鑒定

將核心基因?qū)隒oremine Medical數(shù)據(jù)庫（http://www.coremine.com/medical/），以＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選具有潛在治療作用的中藥，統(tǒng)計(jì)潛在中藥的功效、四氣、五味、歸經(jīng)，供臨床用藥參考。以國家衛(wèi)生健康委員會(huì)頒布及后續(xù)補(bǔ)充的藥食同源中藥名單對中藥分類后，構(gòu)建“基因-中藥”靶向網(wǎng)絡(luò)，篩選度（degree）值排名前5的中藥作為核心中藥進(jìn)行后續(xù)分析。將核心中藥導(dǎo)入本草組鑒數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn）中查詢化學(xué)成分，使用Network Analyzer推算拓?fù)鋮?shù)分析，參考中心度（betweenness centrality）、緊密中心度（closeness centrality），以節(jié)點(diǎn)連接度值（degree）排序前15位成分初篩確定核心成分。導(dǎo)入Swiss ADME數(shù)據(jù)庫（http://www.swissadme.ch）進(jìn)行類藥性評估，以腸道通透性為“High”，類藥性五原則至少有2個(gè)“Yes”進(jìn)行再次篩選確定關(guān)鍵成分。

1.11 分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬

將篩選得到的關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，從PubChem下載關(guān)鍵成分的3D結(jié)構(gòu)。從PDB數(shù)據(jù)庫中獲取核心靶點(diǎn)的分子結(jié)構(gòu)，用PyMol軟件刪除水分子和原配體。對接過程采用AutoDock Tools1.5.6軟件對蛋白添加氫，計(jì)算電荷。隨后采用AutoDock Vina進(jìn)行分子對接，根據(jù)結(jié)合能≤?5.5 kJ/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對結(jié)果進(jìn)行排序，選擇最佳對接組合進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬。將對接結(jié)果的蛋白與小分子配體分離，通過Ambertools軟件中的antechamber工具生成小分子力場文件，通過acpype軟件工具將小分子力場文件轉(zhuǎn)換為gromacs力場文件。小分子采用GAFF力場，蛋白采用AMBER14SB力場和TIP3P水模型，合并蛋白和小分子配體的文件，構(gòu)建復(fù)合物的模擬體系。

采用Gromacs2022程序進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬，在恒溫、恒壓以及周期性邊界條件下進(jìn)行。在MD模擬過程中，所有涉及氫鍵采用線性約束求解器（linear constraint solver，LINCS）算法進(jìn)行約束，積分步長為2 fs。靜電相互作用采用PME（particle-mesh Ewald）方法計(jì)算，截?cái)嘀翟O(shè)為1.2 nm。非鍵相互作用截?cái)嘀翟O(shè)為10 ?（1 ?＝0.1 nm），每10步更新1次。采用V-rescale溫度耦合方法控制模擬溫度為298 K，采用Berendsen方法控制壓力為1 bar（1 bar＝100 kPa）。在298 K下，進(jìn)行100 ps的恒定原子數(shù)、體積、溫度（constant atoms，volume，temperature，NVT）系綜與恒定原子數(shù)、壓力、溫度（constant atoms，pressure，and temperature，NPT）系綜平衡模擬，并對復(fù)合物體系進(jìn)行100 ns的MD模擬，每10 ps保存1次構(gòu)象。模擬完成后，使用視覺分子動(dòng)力學(xué)（visual molecular dynamics，VMD）軟件和pymol對模擬軌跡進(jìn)行分析，使用g_mmpbsa程序采用分子力學(xué)泊松-玻爾茲曼表面積法對蛋白和小分子配體之間進(jìn)行結(jié)合自由能分析。

2 結(jié)果

2.1 阿爾茨海默病腦組織中DEGs的鑒定

GSE132903數(shù)據(jù)集基于GPL10558平臺(tái)，包含97個(gè)AD樣本和98個(gè)對照樣本；GSE5281數(shù)據(jù)集基于GPL570的平臺(tái)，包括87個(gè)AD樣本和74個(gè)對照樣本。經(jīng)過預(yù)處理并去除批處理效應(yīng)后，共獲得1 360個(gè)DEGs，其中AD樣本中有612個(gè)上調(diào)基因，748個(gè)下調(diào)基因，熱圖見圖2-A，火山圖見圖2-B。

2.2 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊鑒定

使用R包“WGCNA”構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。首先對樣本進(jìn)行聚類，以保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。為保證基因間相互作用最大限度符合無尺度分布，對數(shù)據(jù)進(jìn)行軟閾值的確定，如圖3-A所示，根據(jù)R軟件計(jì)算得到最佳軟閾值，確定為3，即此時(shí)的圖3-A（左）的縱坐標(biāo)2接近0.9?；谧顑?yōu)軟閾值，按照混合動(dòng)態(tài)剪切樹算法識(shí)別AD不同基因模塊（圖3-B），將變異排名前5 000個(gè)基因聚類并合并為9個(gè)共表達(dá)模塊（圖3-C），采用Pearson相關(guān)分析，探討模塊特征基因與臨床性狀的相關(guān)性。結(jié)果顯示，各模塊與臨床特征相關(guān)性一般，其中綠松石模塊相比于其他模塊相關(guān)性較高（cor＝0.49，＜0.01），見圖3-C。此外，綠松石模塊基因顯著性與模塊隸屬度分析顯示，兩者高度關(guān)聯(lián)（cor＝0.83，＜0.01），因此取該模塊為重要模塊，共2 552個(gè)基因用于后續(xù)分析（圖3-D）。

2.3 樞紐免疫相關(guān)基因的功能富集分析

將WGCNA鑒定的重要基因模塊綠松石、DEGs、IRGs取交集，共獲取72個(gè)基因（IRHUB），為了保證在2個(gè)數(shù)據(jù)集差異基因中均含有關(guān)鍵基因，再次進(jìn)行了交集運(yùn)算，共識(shí)別出24個(gè)樞紐基因用于后續(xù)分析，如圖4-A所示。生物功能富集顯示與神經(jīng)發(fā)生的正向調(diào)節(jié)（GO：0050769）、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的正向調(diào)節(jié)（GO：0051962）、細(xì)胞發(fā)育的正向調(diào)節(jié)（GO：0010720）、神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)（GO：0050767）有關(guān)；分子功能富集主要涉及激素結(jié)合（GO：0042562）、受體配體活性（GO：0048018）、信號(hào)受體激活物活性（GO：0030546）、激素活性（GO：0005179）、肽結(jié)合（GO：0042277）等功能；在細(xì)胞成分方面，鎂依賴蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶復(fù)合物（GO：0005963）、Z盤（GO：0030018）、肌膜（GO：0042383）、I帶（GO：0031674）、局灶黏附（GO：0005925）等在AD的免疫調(diào)控中發(fā)揮了重要作用（圖4-B）。在KEGG分析中（圖4-C），富集通路主要分布在B細(xì)胞受體信號(hào)通路（hsa04662）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路（hsa04010）、T細(xì)胞受體信號(hào)通路（hsa04660）等多條通路中，說明免疫調(diào)控在AD的發(fā)病機(jī)制發(fā)揮了重要作用，為未來AD的研究提供了潛在的靶點(diǎn)和通路。

A-熱圖；B-火山圖。

2.4 AD中免疫相關(guān)診斷特征生物標(biāo)志物的識(shí)別

采用2種機(jī)器學(xué)習(xí)方法LASSO回歸和SVM-RFE來探索AD的潛在標(biāo)志物。LASSO回歸方法分析出17個(gè)AD特征基因（圖5-A、B）；SVM-RFE算法分析得到5個(gè)AD的特征基因（圖5-C、D）。2種算法與24個(gè)樞紐基因進(jìn)行交集運(yùn)算，最終得到5個(gè)共同基因作為AD免疫特征相關(guān)的樞紐基因富半胱氨酸和甘氨酸的蛋白質(zhì)1（cysteine and glycine rich protein 1，）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，）、白細(xì)胞介素4受體（interleukin 4 receptor，）、生長抑素（somatostatin，）、人核因子-κB抑制蛋白α（nuclear factor-kappa B inhibitor alpha，）（圖5-E）。

2.5 診斷標(biāo)志物的表達(dá)水平和診斷意義

如圖6-A所示，通過ROC曲線分析，的曲線下面積（area under urve，AUC）為0.731［95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）＝0.678～0.782］，的AUC為0.813（95% CI＝0.767～0.856），的AUC為0.695（95% CI＝0.644～0.748），的AUC為0.853（95% CI＝0.812～0.892），的AUC為0.811（95% CI＝0.764～0.855），顯示了這5個(gè)基因作為AD潛在標(biāo)志物可靠的診斷效能。此外，與對照組相比，AD患者腦組織樣本中、、的表達(dá)水平上調(diào)，表達(dá)水平下調(diào)（圖6-B）。

2.6 AD潛在生物標(biāo)志物外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證

為了驗(yàn)證上述結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，使用外部數(shù)據(jù)集（GSE122063）對上述5個(gè)樞紐基因（、、、、）進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與對照組相比，AD患者的、、、、的表達(dá)水平與在訓(xùn)練集基因中觀察到的表達(dá)趨勢一致（圖7-A）。此外，診斷模型分析顯示（圖7-B），5個(gè)標(biāo)志物的AUC均大于0.6，表明具有可靠的診斷價(jià)值。

2.7 AD潛在標(biāo)志物列線圖模型預(yù)測結(jié)果

本研究構(gòu)建了診斷標(biāo)志物的列線圖模型來預(yù)測AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。校準(zhǔn)曲線、決策曲線和臨床效應(yīng)曲線如圖8所示。通過計(jì)算模型中特征的總分，可以得出患AD的風(fēng)險(xiǎn)，這為AD的診斷提供了一些新的策略（圖8-A）。校準(zhǔn)曲線顯示了列線圖模型預(yù)測與理想模型擬合較好，具有良好的可靠性（圖8-B）。臨床決策曲線中彩色曲線表示的診斷標(biāo)志物模型遠(yuǎn)離全部（all）和無（none）曲線，表明基于模型的決策對AD患者有較大的臨床益處（圖8-C）。此外，臨床效應(yīng)曲線顯示了列線圖模型具有顯著的預(yù)測能力（圖8-D）。

2.8 樞紐基因的通路分析結(jié)果

GSEA富集分析結(jié)果顯示，這些標(biāo)志物參與AD發(fā)生發(fā)展的多條通路，主要涉及免疫排斥反應(yīng)、氨基酰-tRNA合成酶合成、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、慢性髓系白血病、糖胺聚糖生物合成途徑、Hippo經(jīng)典信號(hào)通路、尼古丁成癮、Notch信號(hào)通路、逆行內(nèi)源性大麻素記憶信號(hào)通路、氧化應(yīng)激、鈣離子調(diào)節(jié)通路、病毒蛋白-細(xì)胞因子串?dāng)_、免疫缺陷等多條通路。其中糖胺聚糖生物合成途徑、Hippo經(jīng)典信號(hào)通路、尼古丁成癮等通路均在5個(gè)樞紐基因中顯著富集，可能在AD免疫調(diào)節(jié)密切關(guān)聯(lián)（圖9）。

2.9 免疫細(xì)胞浸潤分析

使用Cibersort、ssGSEA評估了AD患者和對照組的免疫豐度，如圖10-A、B所示。Cibersort結(jié)果顯示，AD患者組織中M1巨噬細(xì)胞、靜息態(tài)記憶CD4+T細(xì)胞具有較高的比例，而初始CD4+T細(xì)胞有所減少。ssGSEA結(jié)果顯示，AD患者組織中CD56明亮自然殺傷細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞、未成熟的樹突狀細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞1、輔助性T細(xì)胞17、記憶B細(xì)胞、中心記憶CD8+T細(xì)胞比例上升，活化的CD8+T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中心記憶CD4+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞比例下降。

基于Cibersort、ssGSEA 2種方法創(chuàng)建了相關(guān)性熱圖來探索多種免疫細(xì)胞之間的差異相關(guān)性。如圖10-C、D所示，橙色越深代表正相關(guān)性越高，藍(lán)色越深代表負(fù)相關(guān)性越高?；贑ibersort結(jié)果，負(fù)相關(guān)性較高的組合有M0巨噬細(xì)胞與M2巨噬細(xì)胞、記憶B細(xì)胞與初始B細(xì)胞、靜息自然殺傷細(xì)胞與活化自然殺傷細(xì)胞等，正相關(guān)性較高的組合有M0巨噬細(xì)胞與靜息肥大細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞與靜息記憶CD4+T細(xì)胞等?；趕sGSEA結(jié)果，負(fù)相關(guān)性較高的組合有自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、CD56昏暗自然殺傷細(xì)胞與效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞等?；趕sGSEA的分析結(jié)果進(jìn)一步探索了樞紐基因與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性（圖10-E），結(jié)果表明，樞紐基因與多種免疫細(xì)胞之間存在較強(qiáng)相關(guān)性，、、均與自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、記憶B細(xì)胞呈正相關(guān)。、、均與效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞、活化CD4+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。與自然殺傷細(xì)胞、骨髓來源的抑制性細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)，與效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。然而與效應(yīng)記憶CD4+、CD8+T細(xì)胞和活化CD4+T細(xì)胞呈正相關(guān)，與自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、記憶B細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。免疫檢查位點(diǎn)分析顯示（圖10-F），AD組腦組織中B2M、CD274、CD28、CD40、CD8A等18個(gè)免疫檢查位點(diǎn)與對照組具有明顯差異，故AD可能與免疫細(xì)胞檢查位點(diǎn)的激活進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)有關(guān)。

A-免疫基因的篩選；B-GO功能富集分析；C-KEGG通路富集分析。

A、B-LASSO回歸分析結(jié)果；C、D-SVM-RFE分析結(jié)果；E-樞紐基因、LASSO、SVM-RFE交集結(jié)果。

A-5種標(biāo)志物的受試者工作特征曲線；B-5種標(biāo)志物的表達(dá)水平；***P＜0.001。

A-GSE122063中5種標(biāo)志物的受試者工作特征曲線；B-GSE122063中5種標(biāo)志物的表達(dá)水平；*P＜0.05 ***P＜0.001。

A-基于5種標(biāo)志物的列線圖模型；B-列線圖模型的校正曲線；C-列線圖模型的臨床決策曲線；D-列線圖模型的臨床影響曲線。

圖9 5個(gè)潛在標(biāo)志物GSEA富集分析結(jié)果

2.10 對AD樞紐基因潛在靶向中藥的預(yù)測與分析

將、、、、5個(gè)樞紐基因?qū)隒oremine數(shù)據(jù)庫中，以＜0.05篩選潛在的靶向中藥（圖11），其中匹配到蓖麻子、娑羅子、血竭、石菖蒲、當(dāng)歸等25味中藥；匹配到石龍子、木鱉子2味中藥；匹配到玉米須、菊苣2味中藥；匹配到旋覆花、金沸草、石斛、甘草、澤蘭等59味中藥；未匹配到中藥，查閱Coremine Library中文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)人參、參蘆、參葉、參花對均有一定靶向調(diào)控作用，故作為潛在中藥納入分析。查閱《中華本草》及文獻(xiàn)對上述中藥的功效、四氣五味、歸經(jīng)進(jìn)行分析，潛在靶向中藥四氣以溫、寒、平為主，五味以辛、苦、甘比例較大，功效以清熱、活血、補(bǔ)虛為主，歸經(jīng)以肝、肺、脾、胃經(jīng)居多。參考國家藥食同源目錄進(jìn)行分類，藥食同源類中藥有菊苣、枸杞子、西紅花、白果、甘草、夏枯草等12味，保健食品產(chǎn)業(yè)可添加的有丹參、厚樸花、銀杏葉、川芎、遠(yuǎn)志、石斛等12味，兩者均符合的有當(dāng)歸、人參、玫瑰花3味中藥。選取度值（degree）排名前5的中藥作為關(guān)鍵中藥，最后篩選出人參、當(dāng)歸、厚樸花、遠(yuǎn)志、玫瑰花5味中藥（表1）。

A-基于Cibersort的22種免疫細(xì)胞的豐度差異；B-基于ssGSEA的28種免疫細(xì)胞的豐度差異；C-基于Cibersort的22種免疫細(xì)胞類型相關(guān)性分析，橙色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)；D-基于ssGSEA的28種免疫細(xì)胞類型相關(guān)性分析，橙色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)；E-基于ssGSEA的5種標(biāo)志物與28種免疫細(xì)胞相關(guān)性分析，紅色表示正相關(guān)，綠色表示負(fù)相關(guān)；F-對照組vs AD組37種免疫檢查位點(diǎn)分析，*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001。

2.11 分子對接與分子動(dòng)力學(xué)模擬

將核心中藥導(dǎo)入本草組鑒中查詢化學(xué)成分，初步獲取939個(gè)化合物，經(jīng)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)和Swiss ADME數(shù)據(jù)庫篩選后確定香茅醛（CID:7794）、香芹酚（CID:10364）、異丁香酚（CID:853433）、庚醛（CID:8130）、20()-原人參二醇（CID:11213350）5種成分進(jìn)行對接（表2）。由圖12-A可知，發(fā)現(xiàn)20()-原人參二醇、香芹酚、異丁香與樞紐靶點(diǎn)受體之間有較好的結(jié)合活性、對接穩(wěn)定，選擇最佳的-20()-原人參二醇進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬。由圖12-B可知，小分子的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）保持穩(wěn)定，復(fù)合物和蛋白的RMSD初期存在波動(dòng)，中期逐漸穩(wěn)定，后期存在較小的波動(dòng)。此外，小分子與蛋白的距離、小分子與初始結(jié)合位點(diǎn)的距離在模擬初期存在較大的波動(dòng)，然后逐漸保持穩(wěn)定，這表明復(fù)合物逐漸到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)（圖12-C）。由圖12-D可知復(fù)合物的回轉(zhuǎn)半徑（radius of gyration，Rg）逐漸穩(wěn)定，表明復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)逐漸緊密穩(wěn)健。均方根漲落（root mean square fluctuation，RMSF）分析顯示前期蛋白柔性穩(wěn)定，后期稍有波動(dòng)，可能與蛋白調(diào)整構(gòu)像有關(guān)（圖12-E）。將兩者的模擬構(gòu)象進(jìn)行疊合，復(fù)合物中的小分子的疊合構(gòu)象均在初始結(jié)合位點(diǎn)附近，疊合程度高，進(jìn)一步證明小分子與蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，見圖12-H。氫鍵結(jié)果顯示，小分子與蛋白之間的氫鍵數(shù)量較低，且較為穩(wěn)定，主要分布在0～2個(gè)（圖12-F）。復(fù)合物中范德華力與靜電相互作用在模擬過程中逐漸穩(wěn)定，這表明小分子與蛋白的穩(wěn)定結(jié)合。選取穩(wěn)定狀態(tài)下的復(fù)合物軌跡，使用MM-PBSA的方法計(jì)算，得到結(jié)合能相關(guān)能量項(xiàng)，其中ΔEele為小分子與蛋白之間的靜電相互作用，值為（?136.118±0.777）kJ/mol。ΔEvdw為范德華相互作用，值為（?11.928±1.906）kJ/mol。ΔEpol為極性溶劑化能，可表示靜電勢能，值為（74.884±1.690）kJ/mol。ΔEnonpol為非極性溶劑化能，可表示疏水相互作用，值為（?18.333±0.126）kJ/mol。結(jié)合能（ΔEMMPBSA）為ΔEele、ΔEvdw、ΔEpol、ΔEnonpol之和，值為（?91.495±0.531）kJ/mol。ΔGbind為ΔEMMPBSA與?TΔS之和，值為（17.914±4.285）kJ/mol。通過分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物的范德華力相互作用ΔEvdw遠(yuǎn)高于靜電相互作用能ΔEele和疏水相互作用ΔEnonpol，ΔEvdw為ΔEele的11.4倍，ΔEvdw為ΔEnonpol的7.4倍。范德華力ΔEvdw發(fā)揮主要作用，靜電相互作用ΔEele和疏水相互作用ΔEnonpol發(fā)揮補(bǔ)充作用。小分子與蛋白的結(jié)合能高，二者的親和力高。進(jìn)一步對ΔEMMPBSA進(jìn)行分解，獲取各氨基酸對整體結(jié)合能的貢獻(xiàn)，蛋白中對各自結(jié)合能貢獻(xiàn)較大的殘基如圖12-I、J所示，蛋白中結(jié)合小分子的關(guān)鍵氨基酸有16ILE、10VAL、18THR、62HIE、99ARG、12ASP、64LEU、96VAL、155SER、17SER等。

*ΔGbind=ΔEvdw＋ΔEele＋ΔEpol＋ΔEnonpol?TΔS

A-候選標(biāo)志物-靶向中藥網(wǎng)絡(luò)；B-中藥功效統(tǒng)計(jì)分析；C-中藥四氣統(tǒng)計(jì)分析；D-中藥五味統(tǒng)計(jì)分析；E-中藥歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析。

表1 核心中藥前5位拓?fù)鋮?shù)

表2 核心化合物ADME參數(shù)

A-分子對接；B-RMSD分析；C-質(zhì)心演變分析；D-Rg分析；E-RMSF分析；F-氫鍵數(shù)量分析；H-小分子結(jié)合位點(diǎn)分析；I-結(jié)構(gòu)分析；J-殘基貢獻(xiàn)分析。

3 討論

AD是一種以認(rèn)知功能下降和記憶能力減退為主要臨床表現(xiàn)的一種神經(jīng)退行性疾病，目前發(fā)病機(jī)制仍不清楚。免疫機(jī)制與AD的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。然而，當(dāng)前在AD研究領(lǐng)域中，關(guān)于免疫相關(guān)基因的潛在標(biāo)志物及對應(yīng)治療中藥方面的報(bào)道相對較少，故本研究采用生物信息學(xué)方法、機(jī)器學(xué)習(xí)、分子對接、動(dòng)力學(xué)模擬4種方法綜合分析了AD中免疫相關(guān)的診斷標(biāo)志物、浸潤模式、生物途徑、靶向中藥及核心成分預(yù)測。

3.1 CSRP1、GFAP、SST、IL4R及NFKBIA是AD免疫相關(guān)機(jī)制中的核心分子

本研究識(shí)別出AD患者5個(gè)與對照組具有表達(dá)差異的免疫標(biāo)志物CSRP1、GFAP、SST、IL4R及NFKBIA，與AD的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。因此對其功能與相關(guān)調(diào)控機(jī)制的深入探索有助于加強(qiáng)對AD免疫相關(guān)機(jī)制的理解，為AD的治療帶來新方向。

研究表明，CSRP1是半胱氨酸和甘氨酸富含蛋白質(zhì)家族的成員，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞黏附、增殖、運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮了重要作用[20]。目前關(guān)于CSRP1與AD發(fā)病機(jī)制的報(bào)道較少，郭晨旭等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CSRP1可以影響腫瘤患者的免疫浸潤進(jìn)而影響機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。因此靶向CSRP1進(jìn)而調(diào)控AD患者的免疫微環(huán)境改善病情有望成為潛在的治療策略。GFAP是一種主要存在于大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)蛋白，是膠質(zhì)細(xì)胞活化和腦損傷或疾病中的重要標(biāo)志物[22]。臨床研究顯示，患者血液中檢測到高水平GFAP，腦內(nèi)病理性Tau蛋白會(huì)經(jīng)歷更嚴(yán)重的發(fā)展，可以作為AD臨床確診前的判斷依據(jù)，這與本研究研究結(jié)果是一致的[23]。SST是一種廣泛分布于人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織的抑制性激素。Han等[24]發(fā)現(xiàn)生長抑素遇到銅、Aβ和金屬-Aβ復(fù)合物時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量聚集，以減弱金屬-Aβ復(fù)合物的毒性和聚集為主，進(jìn)而減輕大腦毒性損害。IL4R是是一種受體蛋白，能夠與IL4結(jié)合，激活信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)腦內(nèi)多種免疫細(xì)胞的功能。有研究報(bào)道IL4主要在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中響應(yīng)Aβ-42而被激活，并通過神經(jīng)干/祖細(xì)胞（neural stem/progenitor cell，NSPC）中的IL4受體進(jìn)而誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)-轉(zhuǎn)錄活化因子6（signal transducers and activators of transcription 6，STAT6）磷酸化增加NSPC可塑性，可作為AD的藥物治療的候選靶點(diǎn)進(jìn)一步研究[25]。NFKBIA是一種轉(zhuǎn)錄因子，可與核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）形成復(fù)合物，阻止NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而影響免疫反應(yīng)、凋亡、增殖等生物過程，介導(dǎo)AD的進(jìn)展。此外，NFKBIA接受沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的調(diào)控，進(jìn)而形成抗衰老的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，延緩AD等退行性疾病的進(jìn)展[25]。

3.2 免疫通路及炎癥反應(yīng)是AD發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)

根據(jù)Cibersort和ssGSEA 2種免疫浸潤結(jié)果及相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)AD患者組織中M1巨噬細(xì)胞、靜息態(tài)記憶CD4+T細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、未成熟的樹突狀細(xì)胞、活化的CD8+T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中心記憶CD4+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞等多種免疫類型細(xì)胞與AD生物過程密切相關(guān)，表明免疫細(xì)胞浸潤在AD的發(fā)展過程中具有重要作用。據(jù)以往研究[26-27]報(bào)道，上述免疫細(xì)胞大多在AD中處于異常狀態(tài)，可導(dǎo)致神經(jīng)元退行性病變和AD病理狀態(tài)的進(jìn)一步惡化。此外，Aβ也會(huì)激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子和毒性介質(zhì)，形成神經(jīng)炎癥，并參與Tau蛋白的聚集和擴(kuò)散[28]。本研究中的CD4+亞型Th1和Th17效應(yīng)T細(xì)胞被證實(shí)可通過下調(diào)周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)炎癥加劇導(dǎo)致AD的病理學(xué)發(fā)生改變，加重記憶障礙[29]。此外，Machhi等[30]發(fā)現(xiàn)相對于對照組，AD患者中初始B細(xì)胞比例下降，記憶B細(xì)胞增加，活化B細(xì)胞釋放的高水平腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）促進(jìn)AD腦內(nèi)斑塊的形成，與本研究免疫浸潤結(jié)果較為一致。查閱歸納目前文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)近年對AD免疫因素的研究主要集中在T細(xì)胞、B細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、炎性因子等[31-32]，這說明免疫浸潤分析結(jié)果的可靠性與一致性，提示未來靶向關(guān)鍵基因、調(diào)控機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而改善AD的策略值得深入探索。本研究還對AD患者的37個(gè)免疫檢查位點(diǎn)情況進(jìn)行了分析，B2M、CD40、CD8A等多個(gè)免疫檢查位點(diǎn)具有明顯差異。目前關(guān)于靶向免疫檢查位點(diǎn)治療AD的文獻(xiàn)相對較少，未來研究可進(jìn)一步挖掘潛在標(biāo)志物、顯著免疫細(xì)胞及檢查位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)價(jià)值。

富集分析發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞的生物功能在B細(xì)胞、T細(xì)胞及神經(jīng)發(fā)育等通路中顯著富集，也揭示了免疫細(xì)胞趨化激活對AD發(fā)病及腦內(nèi)神經(jīng)元產(chǎn)生了重要的影響。GSEA結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼古丁成癮等通路、糖胺聚糖生物合成途徑、Hippo經(jīng)典信號(hào)通路與這些標(biāo)志物密切關(guān)聯(lián)。尼古丁成癮通路被認(rèn)為是AD藥物的重要通路，通路中的乙酰膽堿受體可以控制乙酰膽堿的釋放，發(fā)揮調(diào)節(jié)大腦中認(rèn)知功能，拮抗Aβ毒性等作用[33]，可能是治療神經(jīng)退行性疾病的新策略。糖胺聚糖合成途徑產(chǎn)生的糖胺聚糖既可以與淀粉樣前體蛋白（amyloidprecursor protein，APP）結(jié)合，促進(jìn)APP的β分泌酶代謝途徑，增加Aβ的含量；又可促進(jìn)蛋白激酶對Tau蛋白的磷酸化修飾，從而誘導(dǎo)Aβ和Tau蛋白的累積與沉淀[34]。Hippo信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物中高度保守的通路，與組織和器官大小及細(xì)胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān)。Wang等[35]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)Hippo通路中巨噬細(xì)胞刺激蛋白1（macrophage stimulating 1，MST1）可以直接抵抗和改善AD病理特征和臨床癥狀，不需要依賴于清除Aβ。本研究發(fā)現(xiàn)5種標(biāo)志物均與Hippo通路有關(guān)，后續(xù)可深入研究這些標(biāo)志物與基因之間的調(diào)控關(guān)系，以期為AD防治提供新靶點(diǎn)。

3.3 預(yù)測的靶向中藥及化合物為調(diào)節(jié)免疫治療AD提供了參考依據(jù)

中醫(yī)將AD歸屬于“癡呆”“健忘”“呆病”等范疇。近幾年，由于中醫(yī)藥的臨床和基礎(chǔ)研究不斷深入，中醫(yī)藥受到了眾多科研工作者的關(guān)注。本研究對預(yù)測出的靶向中藥進(jìn)行藥性分析后發(fā)現(xiàn)，四氣以溫、寒、平為主，五味以辛、苦、甘比例較大，功效以清熱、活血、補(bǔ)虛為主，歸經(jīng)以肝、肺、脾、胃經(jīng)居多。表明這些中藥對關(guān)鍵基因的影響可能更為顯著，這不僅與中醫(yī)從扶正固本、調(diào)和臟腑出發(fā)，兼以化痰、祛瘀、補(bǔ)虛治療AD一致[36-37]，也與本研究團(tuán)隊(duì)前期基于肝脾論治AD相關(guān)研究吻合[38]。最終經(jīng)參數(shù)篩選出人參、當(dāng)歸、厚樸花、遠(yuǎn)志、玫瑰花5味核心中藥。

經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)上述中藥治療AD已經(jīng)得到了證實(shí)。研究報(bào)道指出，人參中已確定多種皂苷可以改善退行性疾病的學(xué)習(xí)和記憶，其中人參皂苷Rg1可能通過抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1，NLRP1）炎癥體和自噬功能障礙來緩解Aβ沉積和AD進(jìn)展[39]。葉長青等[40]研究表明，當(dāng)歸主要活性成分西托糖苷、β-谷甾醇、豆甾醇可能與蛋白激酶B1（protein kinase B1，Akt1）、前列腺素內(nèi)-過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）等關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮抗AD的作用。厚樸花中的主要成分是厚樸酚、和厚樸酚[41]，可以抑制活性氧生成、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高和半胱天冬酶活性，對抗β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞死亡，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[42]。遠(yuǎn)志中的皂苷能夠通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/Akt信號(hào)通路顯著提高和延長轉(zhuǎn)Tau基因果蠅AD模型的生存時(shí)間[43]。玫瑰花總黃酮能明顯調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[44]。從諸多藥理研究中不難發(fā)現(xiàn)這些中藥均有靶向治療AD的作用，因此臨床上此類中藥既可組方配伍，又可作為“援藥”進(jìn)行化裁，提高臨床療效[45]。企業(yè)及科研機(jī)構(gòu)還可以基于“治未病”與“精準(zhǔn)營養(yǎng)”[46]的思想，大力挖掘其中的藥食價(jià)值，加強(qiáng)成果轉(zhuǎn)化，開發(fā)多種形式產(chǎn)品，保障人民健康，發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢。分子對接顯示，(20)-原人參二醇與5個(gè)生物標(biāo)志物對接穩(wěn)定，具有良好的結(jié)合能力。將最佳對接結(jié)果IL4R-(20)-原人參二醇進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在模擬過程中，小分子與蛋白形成的氫鍵數(shù)量少而穩(wěn)定，親和力好，關(guān)鍵氨基酸有16ILE、10VAL、18THR、62HIE、99ARG、12ASP、64LEU、96VAL、155SER、17SER等，對接結(jié)合能高，范德華力相互作用遠(yuǎn)高于靜電相互作用和疏水相互作用，范德華力發(fā)揮主要作用，靜電相互作用和疏水相互作用發(fā)揮補(bǔ)充作用。相關(guān)研究[47-48]證實(shí)(20)-原人參二醇可以通過刺激分泌性糖蛋白（wingless/integrated，Wnt）/糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路，促進(jìn)增強(qiáng)海馬神經(jīng)再生，抑制氧化應(yīng)激，上調(diào)海馬中早期生長反應(yīng)因子（early growth responsive gene-1，Egr-1）、FBJ骨肉瘤癌基因（c-Fos）和Jun原癌基因（Jun proto-oncogene，c-Jun）等多種途徑來改善AD模型小鼠的記憶障礙。上述模擬結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道說明(20)-原人參二醇與標(biāo)志物相互作用良好，且具有較強(qiáng)的藥效作用，可作為AD免疫標(biāo)志物的靶向藥物進(jìn)一步研究，為AD的免疫治療提供了新證據(jù)。

4 結(jié)論

本研究利用多種技術(shù)分析了AD免疫相關(guān)的標(biāo)志物和浸潤模式，通過關(guān)鍵基因富集分析得到了AD相關(guān)的生物過程及信號(hào)通路，為免疫調(diào)控AD提供了一定的依據(jù)，進(jìn)一步明確了AD的發(fā)病機(jī)制。最后通過潛在標(biāo)志物和藥食同源目錄，預(yù)測得到了藥食同源中藥及核心成分，對其藥性功效進(jìn)行了分析，豐富了中醫(yī)藥從微觀機(jī)制治療AD的理論內(nèi)涵，為臨床工作者及相關(guān)藥企進(jìn)一步研究AD的分子機(jī)制、藥物設(shè)計(jì)、保健食品研發(fā)提供一定的參考依據(jù)。但本研究仍然存在以下不足：（1）初步合并了AD芯片對AD免疫相關(guān)基因進(jìn)行了探索，后續(xù)工作應(yīng)注重AD患者腦區(qū)分類，以期篩選更精確的標(biāo)志物；（2）中藥化合物數(shù)據(jù)庫使用單一，后續(xù)可擴(kuò)大數(shù)據(jù)庫種類，以獲得更為豐富的化合物數(shù)量進(jìn)行預(yù)測篩選；（3）本研究基于生物數(shù)據(jù)庫和模擬計(jì)算，故結(jié)果仍需實(shí)驗(yàn)及臨床觀察進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification of immune-related biomarkers of Alzheimer’s disease and prediction of medicine-food homology traditional Chinese medicines based on bioinformatics analysis and dynamic simulation

LIANG Pengpeng, WANG Yale, HUANG Hai, LI Guiyun, WU Hongyan

Shenzhen Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518004, China

To analyze the immune-related biomarkers, pathogenesis, levels of immune infiltration and potential homology herbs in Alzheimer’s disease (AD).The expression profiles of GSE5281 and GSE132903 were downloaded from GEO database to obtain AD differentially expressed genes (DEGs). The relevant module genes of AD were identified using a weighted co-expression algorithm, and the immune-related genes were subsequently obtained from the ImmPortal database. The intersection of the above mentioned genes was used to obtained to obtain the set of essential immune differential genes. The analysis was then performed using least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and support vector machine - recursive feature elimination (SVM-RFE) methods to screen for common immune biomarkers of AD. Biological pathways were explored through gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG), and gene set enrichment analysis (GSEA). The receiver operator characteristic (ROC) curve was used to evaluate the diagnostic capability of these candidate markers, and validated them in GSE122063 dataset. Besides, we established clinical nomograms and curves for clinical application evaluation. The cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts(Cibersort) and single-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA) were used to analyze immune cell infiltration in the samples. Finally, Coremine Medical and Herb databases were used to analyze traditional Chinese medicines (TCMs) and components, and molecular docking and kinetic simulation were carried out.A total of 1 360 differential genes and five biomarkers including cysteine and glycine rich protein 1 (), glial fibrillary acidic protein (), interleukin 4 receptor (), somatostatin (), and nuclear factor-kappa B inhibitor alpha () were screened. GO analysis shows that AD is strongly correlated with positive regulation of neural development and cell development. The KEGG and GSEA enrichment results indicated that AD is most closely related to the B-cell receptor signaling pathway and the glycosaminoglycan biosynthesis pathway. Immune infiltration analysis showed that the proportion of macrophages, memory B cells and central memory CD8+T cells in AD brain tissue was increased, while the proportion of initial CD4+T cells, activated CD8+T cells and effector memory CD8+T cells decreased, and there were significant differences in B2M, CD40 and other examination sites. There were 82 potential TCMs, including Renshen (et), Danggui () and Houpohua (). Moreover, their four properties and five flavors are mainly warm, cold, flat, bitter, and sweet, and belong to the liver, lung, spleen, and stomach passages, with the effect of clearing heat, promoting blood, and tonifying deficiency. Molecular docking and kinetic simulation showed that 20()-protopanaxadiol was stable in docking with markers.The biomarkers and immune-related mechanisms of AD were screened and explained through various methods. Medicine-food homologous TCMs such aset,andare expected to be a significant source for AD drug development. This study sheds new light on the pathogenesis, clinical treatment, and novel drugs for AD.

Alzheimer’s disease; weighted coexpression analysis; machine learning; immune infiltration; biomarkers;et;;; 20()-protopanaxadiol

R285

A

0253 - 2670(2024)08 - 2667 - 17

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.017

2023-11-20

深圳市“醫(yī)療衛(wèi)生三名工程”項(xiàng)目（SZZYSM202201007）；羅湖區(qū)軟科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（LX20210101）；羅湖區(qū)軟科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（LX202302101）

梁朋朋（1996—），男，博士研究生，研究方向中醫(yī)藥治療心腦血管疾病研究。E-mail: l17864190755@163.com

通信作者：吳紅彥（1963—），男，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)老年病研究。E-mail: wu.hy@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]