曹皇亮，劉春蓮，陳高源，姚 丁，肖揚(yáng)鑫，劉艷菊*

體外共孵育法研究腸道菌群對蒼術(shù)炒焦前后醇提物及增量成分蒼術(shù)苷A的代謝規(guī)律

曹皇亮1, 2, 3，劉春蓮1, 2, 3，陳高源1, 2, 3，姚 丁1, 2, 3，肖揚(yáng)鑫1, 2, 3，劉艷菊1, 2, 3*

1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065 2. 湖北省中藥炮制技術(shù)工程中心，湖北 武漢 430065 3. 湖北時珍實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430065

明確生、焦蒼術(shù)醇提物在腸道菌群作用下成分的代謝差異，以及關(guān)鍵增量成分蒼術(shù)苷A的代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律。采用體外共孵育方法，將生蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物以及炒焦增量成分蒼術(shù)苷A與小鼠腸道菌液共孵育，運(yùn)用UHPLC-LTQ-Qrbitrap技術(shù)，分析生蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物共孵育后的轉(zhuǎn)化情況，并對蒼術(shù)苷A的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析。生蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物與小鼠腸道菌群共孵育后原型成分蒼術(shù)苷A、5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)素、白術(shù)內(nèi)酰胺、2-(聯(lián)苯基-4-基)乙醛、二乙酰蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯II、羥甲香豆素、乙酰蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯I、β-石竹烯、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、蒼術(shù)酮13種成分峰面積均降低，其中，蒼術(shù)素、二乙酰蒼術(shù)素醇、羥甲香豆素、蒼術(shù)酮4個成分在焦蒼術(shù)中降低尤為明顯；3β-乙酰氧基-白術(shù)內(nèi)酯I、β-香根草烯、白術(shù)內(nèi)酯III、愈創(chuàng)木烯、芹烷二烯酮5個成分峰面積在生、焦蒼術(shù)醇提物與菌群共孵育后均增加，其中，3β-乙酰氧基-白術(shù)內(nèi)酯I、愈創(chuàng)木烯、芹烷二烯酮在焦蒼術(shù)中增加尤為明顯；蒼術(shù)苷A經(jīng)腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了新成分，根據(jù)數(shù)據(jù)分析，推測出其中與其羥化、羰基化、乙酰化相關(guān)的4種代謝物。腸道菌群對生蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物成分有轉(zhuǎn)化作用，且對2種飲片成分代謝轉(zhuǎn)化程度存在差異，大多成分在焦蒼術(shù)中轉(zhuǎn)化（或生成）率更高，這可能是焦蒼術(shù)增強(qiáng)固腸止瀉作用關(guān)鍵原因；蒼術(shù)苷A的代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了腸道菌群對成分影響的關(guān)鍵作用。

蒼術(shù)；焦蒼術(shù)；蒼術(shù)苷A；腸道菌群；成分轉(zhuǎn)化；體外共孵育法；UHPLC-LTQ-Qrbitrap技術(shù)；蒼術(shù)素；二乙酰蒼術(shù)素醇；羥甲香豆素；蒼術(shù)酮；3β-乙酰氧基-白術(shù)內(nèi)酯I；β-香根草烯；白術(shù)內(nèi)酯III；愈創(chuàng)木烯；芹烷二烯酮

蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)(Thunb.) DC.或北蒼術(shù)(DC.) Koidz.的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，是臨床常用中藥，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目之功效[1]。臨床上常用蒼術(shù)炮制品有麩炒蒼術(shù)和焦蒼術(shù)。蒼術(shù)苷A為愈創(chuàng)木烷型倍半萜苷類化合物，課題組前期以茅蒼術(shù)為對象，研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)炒焦前后化學(xué)成分的種類變化不明顯，但部分成分含量差異顯著，其中蒼術(shù)苷A的含量增加50%以上[2-4]。蒼術(shù)炒焦后固腸止瀉作用增強(qiáng)，課題組已證明，腸道菌群在焦蒼術(shù)增強(qiáng)藥效作用上發(fā)揮了關(guān)鍵作用，焦蒼術(shù)可調(diào)整模型動物腸道菌群結(jié)構(gòu)和豐度，增加有益菌的豐度、降低有害菌的豐度，并影響腸道菌群的代謝物短鏈脂肪酸[5]，且蒼術(shù)苷A具有與焦蒼術(shù)類似作用[6]。腸道菌群作為一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，在保障和調(diào)節(jié)機(jī)體功能上發(fā)揮重要作用[7-8]。大多數(shù)中藥經(jīng)口服給藥后，其成分不可避免地與腸道菌群發(fā)生相互作用。研究表明，腸道菌群能產(chǎn)生各種代謝酶，特異性地參與中藥有效成分的代謝與結(jié)構(gòu)重塑，使中藥有效成分表現(xiàn)出不同的藥理與毒理活性[9-10]。課題組前期研究表明，蒼術(shù)炒焦后增量成分蒼術(shù)苷A具有促進(jìn)胃腸動力和保護(hù)胃黏膜，對抗消化道炎癥的作用，但其口服生物利用度較低[11-12]。因此推測蒼術(shù)苷A可能在腸道菌群的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐孜盏某煞?，從而發(fā)揮藥物療效。

基于上述研究基礎(chǔ)，為進(jìn)一步探討腸道菌群對生、焦蒼術(shù)成分轉(zhuǎn)化的影響及其差異比較，初步闡明焦蒼術(shù)發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)采用體外共孵育法，運(yùn)用UHPLC-LTQ-Orbitrap技術(shù)研究腸道菌群對生、焦蒼術(shù)醇提物及炮制增量成分蒼術(shù)苷A轉(zhuǎn)化的影響，并深入分析蒼術(shù)苷A的代謝產(chǎn)物，以期從腸道菌群對成分影響角度，揭示蒼術(shù)炒焦增強(qiáng)“固腸止瀉”的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究蒼術(shù)醇提物的體內(nèi)菌群代謝以及蒼術(shù)苷A的關(guān)鍵代謝菌種分析提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

THZ-98AB型恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ES 225SM-MR電子天平，瑞士Precisa公司；1580R型離心機(jī)，中國基因有限公司；Thermo U3000液相色譜儀、Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL組合式高分辨質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司；Xcalibur軟件用于數(shù)據(jù)采集和處理。

1.2 藥材與試劑

蒼術(shù)藥材采自湖北省英山縣，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊紅兵教授鑒定為菊科蒼術(shù)屬植物茅蒼術(shù)(Thunb.) DC.的干燥根莖。

蒼術(shù)苷A，批號PS011500，購自成都普思生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98.0%，適用于UPLC-LTQ-Orbitrap分析。HPLC級乙腈和甲醇，色譜純，德國Merck公司；甲酸，色譜純，阿拉丁公司；純凈水自制，艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)，成都艾柯水處理設(shè)備有限公司；通用厭氧培養(yǎng)液購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物

體質(zhì)量（20±2）g，雄性ICR小鼠10只，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證書：SCXK（遼）2020-0001。動物研究按照湖北中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會（中國武漢）批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進(jìn)行（批準(zhǔn)代碼：00273286，2021年12月10日）。

2 方法與結(jié)果

2.1 腸道菌群對生蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物化學(xué)成分體外代謝轉(zhuǎn)化研究

2.1.1 生蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物的制備

（1）生蒼術(shù)、焦蒼術(shù)飲片的制備：按《中國藥典》2020年版制備生蒼術(shù)飲片，按《湖北省中藥飲片炮制規(guī)范》2018年版制備焦蒼術(shù)飲片。

（2）生蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物的制備：取生蒼術(shù)、焦蒼術(shù)飲片，粉碎，過三號篩，分別用8倍量80%乙醇浸泡過夜，超聲提取3次，每次2 h，合并提取液并濾過，濃縮后冷凍干燥成凍干粉，置于?20 ℃保存，備用[5]。

2.1.2 厭氧培養(yǎng)基（GAM）的制備 稱取厭氧培養(yǎng)粉9.5 g，加熱攪拌溶解于1 000 mL蒸餾水中，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，備用[13]。

2.1.3 小鼠腸道細(xì)菌混懸液的制備 收集10只正常ICR小鼠新鮮糞便混勻，稱定質(zhì)量并以每g小鼠新鮮糞便用4 mL滅菌PBS（含0.01%半胱氨酸）的比例進(jìn)行勻漿，2 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min，獲得上清液作為小鼠腸道菌群混合物。

2.1.4 共孵育樣品的制備 取適量生、焦蒼術(shù)提取液凍干粉，分別用厭氧培養(yǎng)基配制成質(zhì)量濃度為500 mg/mL的生、焦蒼術(shù)醇提物溶液，取1 mL接種到9 mL厭氧培養(yǎng)液中作為對照組，再取1 mL 500 mg/mL的生、焦蒼術(shù)醇提物溶液分別接種到含有1 mL小鼠腸道菌群混懸液和8 mL厭氧培養(yǎng)液中作為實(shí)驗(yàn)組，平行操作2次。厭氧條件下于恒溫振蕩器37 ℃、150 r/min孵育72 h，然后向孵育的溶液中按1∶1加入乙腈以終止反應(yīng)，12 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min，上清液氮吹至干，殘?jiān)?.3 mL甲醇溶解，于UHPLC-LTQ-Orbitrap分析。

2.1.5 色譜與質(zhì)譜條件

（1）色譜條件：采用Welch Xtimate?UHPLC C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱；采用含0.1%甲酸水溶液-乙腈流動相體系，梯度洗脫：0～15 min，20%～50%乙腈；15～30 min，50%～60%乙腈；30～35 min，60%～95%乙腈；35～45 min，95%乙腈；45～46 min，95%～20%乙腈；46～56 min，20%乙腈。體積流量為0.3 mL/min；注射量5 μL。

（2）質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）正離子模式，鞘氣（N2）和輔助氣（Ar）體積流量分別為40 arb和10 arb；毛細(xì)管溫度為300 ℃；離子源電壓2.5 kV，電流100 μA；一級質(zhì)譜采集范圍/100～1 000，分辨率為60 000。多級質(zhì)譜采用高能碰撞誘導(dǎo)解離（HCD）模式，依賴一級質(zhì)譜掃描中的第1到第4強(qiáng)峰，分辨率設(shè)為15 000；HCD裂解能量為歸一化能量50%。

2.1.6 體外代謝轉(zhuǎn)化分析結(jié)果 運(yùn)用UHPLC-LTQ-Orbitrap技術(shù)，在正離子模式下分析蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物與小鼠腸道菌群共孵育后成分轉(zhuǎn)化情況，圖譜見圖1。根據(jù)HMDB數(shù)據(jù)庫，結(jié)合與對照品比對，共鑒定了18個成分，計(jì)算在菌群條件下上述18種成分峰面積變化率，計(jì)算公式為成分變化率＝(共孵育對照組成分峰面積－共孵育實(shí)驗(yàn)組成峰面積)/對照組成分峰面積，結(jié)果見表1、2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物與小鼠腸道菌群共孵育后成分變化規(guī)律一致，蒼術(shù)苷A、蒼術(shù)素等13個成分峰面積均降低，其中蒼術(shù)苷A、5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)素、白術(shù)內(nèi)酰胺、2-(聯(lián)苯基-4-基)乙醛、二乙酰蒼術(shù)素醇、羥甲香豆素、乙酰蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯I、β-石竹烯、蒼術(shù)酮11種成分，在焦蒼術(shù)醇提物菌群共孵育組的峰面積下降率高于生蒼術(shù)菌群共孵育組；而3β-乙酰氧基-白術(shù)內(nèi)酯I、β香根草烯、白術(shù)內(nèi)酯III、愈創(chuàng)木烯、芹烷二烯酮5個成分峰面積在生、焦蒼術(shù)醇提物與菌群共孵育后均增加，其中3β-乙酰氧基-白術(shù)內(nèi)酯I，愈創(chuàng)木烯和芹烷二烯酮在焦蒼術(shù)醇提物與菌群共孵育組峰面積增加率高于生蒼術(shù)菌群共孵育，可見生、焦蒼術(shù)醇提物中同一成分共孵育后變化趨勢一致，但變化率存在差異，對該差異進(jìn)行比較，計(jì)算公式為Δ變化率＝焦蒼術(shù)共孵育實(shí)驗(yàn)組變化率－生蒼術(shù)共孵育實(shí)驗(yàn)組變化率，結(jié)果見表3。上述結(jié)果表明，生、焦蒼術(shù)醇提物中的成分能夠在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化。其中蒼術(shù)苷A、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮4種共有成分均被轉(zhuǎn)化而使成分峰面積顯著降低，但它們在生、焦蒼術(shù)2種醇提物中成分轉(zhuǎn)化率相差較小，即Δ變化率均在±5%以內(nèi)；蒼術(shù)素、二乙酰蒼術(shù)素醇、羥甲香豆素、蒼術(shù)酮等雖也是被轉(zhuǎn)化而降低的成分，但它們在焦蒼術(shù)中成分降低的更為明顯，Δ變化率在15%以上。同時，因轉(zhuǎn)化生成而增加的成分中，3β-乙酰氧基-白術(shù)內(nèi)酯I、愈創(chuàng)木烯、芹烷二烯酮3種成分在焦蒼術(shù)中增加的更為明顯，而白術(shù)內(nèi)酯III在生蒼術(shù)中增加的更明顯。綜合分析認(rèn)為，在復(fù)雜的物質(zhì)環(huán)境下，腸道微生態(tài)對2種飲片中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化趨勢一致，較多成分表現(xiàn)出在焦蒼術(shù)中更有利于被轉(zhuǎn)化或被生成。

A-生蒼術(shù)對照組；B-生蒼術(shù)實(shí)驗(yàn)組；C-焦蒼術(shù)對照組；D-焦蒼術(shù)實(shí)驗(yàn)組。

表1 生蒼術(shù)醇提物與腸道菌群共孵育的UPLC-LTQ/Orbitrap-MS/MS定性分析結(jié)果

“↑”表示實(shí)驗(yàn)組中成分峰面積增加；“↓”表示實(shí)驗(yàn)組中成分峰面積降低；表2同。

“↑” indicates an increase in peak area of components in experimental group; “↓” indicates a decrease in peak area of components in experimental group, same as table 2.

表2 焦蒼術(shù)醇提物與腸道菌群共孵育的UPLC-LTQ/Orbitrap-MS/MS定性分析結(jié)果

表3 生蒼術(shù)醇提物和焦蒼術(shù)醇提物與腸道菌群共孵育的峰面積變化率比較

“↑”表示共孵育后該成分增加，“↓”表示共孵育后該成分降低；“+”表示焦蒼術(shù)變化率高于生蒼術(shù)，“?”表示焦蒼術(shù)變化率低于生蒼術(shù)。

“↑” indicates that the component increases after co-incubation, and “↓” indicates that the component decreases after co-incubation; “+” means that the change rate of deep-friedis higher than that of, and “?” means that the change rate of deep-friedis lower than that of

2.2 腸道菌群對蒼術(shù)苷A的體外代謝轉(zhuǎn)化研究

2.2.1 厭氧培養(yǎng)基和腸道細(xì)菌混懸液的制備 按“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)的方法制備厭氧培養(yǎng)基及小鼠腸道細(xì)菌混懸液。

2.2.2 樣品制備 精密稱取蒼術(shù)苷A適量，溶解在純水中，制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蒼術(shù)苷A溶液[14]。將1 mL蒼術(shù)苷A溶液接種到1 mL厭氧培養(yǎng)基中作為對照組，再將1 mL蒼術(shù)苷A溶液接種到含有0.2 mL小鼠腸道菌群混懸液和0.8 mL厭氧培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組。將對照組和實(shí)驗(yàn)組樣品于厭氧環(huán)境下37 ℃培養(yǎng)72 h。經(jīng)過孵育后，向培養(yǎng)的溶液中加入1∶1乙腈以終止反應(yīng)。12 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min，上清液氮吹至干，殘?jiān)?.3 mL甲醇溶解，進(jìn)樣分析。

2.2.3 色譜與質(zhì)譜條件 同“2.1.5”項(xiàng)。

2.2.4 代謝產(chǎn)物的鑒定 采用所建立的UPLC-LTQ-Orbitrap方法對蒼術(shù)苷A及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析，蒼術(shù)苷A與腸道菌群共孵育對照及實(shí)驗(yàn)組TIC圖見圖2。由蒼術(shù)苷A與腸道菌群共孵育前后TIC圖可見，蒼術(shù)苷A經(jīng)腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了新的成分，從峰面積看，與對照組比較，菌群共孵育組蒼術(shù)苷A轉(zhuǎn)化率為99.5%，同時出現(xiàn)許多新增峰。蒼術(shù)苷A為愈創(chuàng)木烷型倍半萜糖苷類化合物，倍半萜糖苷類化合物生物轉(zhuǎn)化途徑主要為脫葡萄糖、氧化，倍半萜的生物轉(zhuǎn)化主要有羥化、羰基化、乙酰化等[15-16]，經(jīng)提取離子流圖，結(jié)合倍半萜主要轉(zhuǎn)化途徑，推測出4種蒼術(shù)苷A（a）可能的代謝產(chǎn)物（b～e），蒼術(shù)苷A與代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化關(guān)系見圖3，蒼術(shù)苷A及其代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果見表4，蒼術(shù)苷A與代謝產(chǎn)物的提取離子流圖見圖4～8，根據(jù)峰面積計(jì)算在菌群條件下蒼術(shù)苷A成分變化率，計(jì)算公式為峰面積變化率＝(對照組蒼術(shù)苷A峰面積－實(shí)驗(yàn)組蒼術(shù)苷A峰面積)/對照組蒼術(shù)苷A峰面積。

圖2 蒼術(shù)苷A與菌共孵育前后TIC圖

通過分析蒼術(shù)苷A對照品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，首先對供試品蒼術(shù)苷A（a）進(jìn)行了鑒定。蒼術(shù)苷A在/447.223 9（C21H36O10，質(zhì)量偏差＝3.13×10?6）具有[M－H]?離子，保留時間為1.30 min，主要碎片離子為/285.173 7、267.163 2、101.025 8、89.025 7、59.014 9，蒼術(shù)苷A提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖見圖4。

代謝產(chǎn)物b，保留時間和母離子分別為1.98 min和/285.173 7。通過從蒼術(shù)苷A脫去1分子葡萄糖（/162）得到/285.173 7，進(jìn)一步分子內(nèi)脫水產(chǎn)生/267.163 5的碎片離子，代謝產(chǎn)物b提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖見圖5。

代謝產(chǎn)物c的保留時間和母離子分別為4.95 min和/461.201 7。通過從蒼術(shù)苷A羰基化產(chǎn)生/461.201 7，進(jìn)一步分子內(nèi)脫水產(chǎn)生/443.162 0的碎片離子，代謝產(chǎn)物c提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖見圖6。

圖3 蒼術(shù)苷A與代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化關(guān)系推導(dǎo)

“?”表示未檢出，“↑”表示共孵育后該成分增加，“↓”表示共孵育后該成分降低。

“?” indicates that the component is not detected, “↑” indicates that the component is increased after co-incubation, and “↓” indicates that the component is decreased after co-incubation.

代謝產(chǎn)物d，保留時間和母離子分別為13.08 min和/405.248 8。通過從蒼術(shù)苷A脫甲基化和脫羰基產(chǎn)生/405.248 8，進(jìn)一步脫葡萄糖產(chǎn)生/243.314 1的碎片離子，代謝產(chǎn)物d提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖見圖7。

代謝產(chǎn)物e，保留時間和母離子分別為14.74 min和/489.328 0。通過蒼術(shù)苷A乙?；a(chǎn)生/489.328 0，進(jìn)一步脫葡萄糖產(chǎn)生/327.221 9的碎片離子，代謝產(chǎn)物e提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖見圖8。

根據(jù)精確相對分子質(zhì)量和多級質(zhì)譜碎片等相關(guān)信息，初步分析并鑒定了蒼術(shù)苷A經(jīng)腸道菌群代謝的4種產(chǎn)物。結(jié)果顯示，蒼術(shù)苷A的可能的代謝途徑包括脫葡萄糖、氧化、去甲基化、脫水和乙?；?。比較蒼術(shù)苷A與腸道菌群共孵育前后各成分峰面積，蒼術(shù)苷A與腸道菌群共孵育后實(shí)驗(yàn)組峰面積較對照組降低99.5%，說明轉(zhuǎn)化較完全。在實(shí)驗(yàn)組中檢測到蒼術(shù)苷A的代謝產(chǎn)物b～e的峰面積較高，而這些成分在對照組中極低甚至未檢測到，表明蒼術(shù)苷A能夠被腸道菌群幾乎完全轉(zhuǎn)化代謝。

圖5 代謝產(chǎn)物b提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖

圖6 代謝產(chǎn)物c提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)是復(fù)雜中藥化學(xué)成分快速鑒定的最主要技術(shù)之一，可以在缺少對照品的情況下對中藥化學(xué)成分進(jìn)行快速篩查與確認(rèn)。該技術(shù)較傳統(tǒng)LC-MS，可實(shí)現(xiàn)多級質(zhì)譜碎裂和母離子的高分辨采集，是復(fù)雜物質(zhì)體系中化學(xué)成分快速分析的有效手段。

圖7 代謝產(chǎn)物d提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖

圖8 代謝產(chǎn)物e提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖

目前腸道代謝的研究方法主要包括體內(nèi)法、在體法以及體外法[17]。其中，體外法是研究藥物在腸內(nèi)代謝的主要方法，具有簡單易行、重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)，能夠排除體內(nèi)的干擾因素，從而更好地控制代謝條件[18]。在腸道菌群實(shí)驗(yàn)中，糞便溫孵法是體外研究腸道菌群對藥物代謝較認(rèn)可并被普遍使用的方法，是指將含有細(xì)菌的人、小鼠或其他動物的新鮮糞便與藥物混勻，37 ℃厭氧培養(yǎng)，應(yīng)用LC-MS、GC-MS等現(xiàn)代儀器分析技術(shù)檢測藥物原型及其代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量[19]。通過檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)共孵育方法較常用，所用的腸道菌群多采自正常動物[20-23]，因此，本實(shí)驗(yàn)采用正常小鼠的腸道菌群體外共孵育，糞便隨時可取，方法操作方便，結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)。

課題組前期對蒼術(shù)、焦蒼術(shù)的體外化學(xué)成分已進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明生、焦蒼術(shù)醇提物二者成分種類相同，但含量相差較大[2-4]，初步明確二者發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)有所不同，其中蒼術(shù)苷A為炮制后增量明顯成分；實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證腸道菌群是焦蒼術(shù)醇提物和蒼術(shù)苷A發(fā)揮固腸止瀉作用的關(guān)鍵因素[5]，但是蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物進(jìn)入體內(nèi)后，在腸道微生態(tài)環(huán)境下，相關(guān)成分如何轉(zhuǎn)化尚不清楚；有研究表明，蒼術(shù)炒焦后增量成分蒼術(shù)苷A具有促進(jìn)胃腸動力和保護(hù)胃黏膜，對抗消化道炎癥的作用，但其口服生物利用度較低[11-12]，而目前尚未見關(guān)于蒼術(shù)苷A的藥效是否與腸道菌群的代謝有關(guān)報(bào)道。為此，作者為全面分析蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物在腸道菌群作用下的代謝情況，為獲得豐富的成分轉(zhuǎn)化信息，運(yùn)用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)，采用體外共孵育法，較好模擬體內(nèi)轉(zhuǎn)化環(huán)境，且成分分析相對簡單。由于中藥成分復(fù)雜性以及體內(nèi)代謝的復(fù)雜和未知性，研究蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物體內(nèi)代謝難度較大，因此本實(shí)驗(yàn)首先選擇體外共孵育法初步研究分析。將蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物與小鼠腸道菌液進(jìn)行體外共孵育，考察腸道菌群對蒼術(shù)、焦蒼術(shù)醇提物化學(xué)成分以及增量成分蒼術(shù)苷A的代謝轉(zhuǎn)化作用。結(jié)果原型成分蒼術(shù)苷A、5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)素等11種成分在焦蒼術(shù)醇提物與菌共孵育后的峰面積下降率高于生蒼術(shù)共孵育，而3β-乙酰氧基-白術(shù)內(nèi)酯I，愈創(chuàng)木烯和芹烷二烯酮在焦蒼術(shù)醇提物與菌共孵育后的峰面積增加率高于生蒼術(shù)共孵育。推測菌群共孵育前后化學(xué)成分的變化是焦蒼術(shù)藥效優(yōu)勢的關(guān)鍵所在，代謝差異的原因可能與2種提取物的整體化學(xué)環(huán)境、生物環(huán)境有關(guān)。

進(jìn)一步分析了腸道菌群對蒼術(shù)苷A的轉(zhuǎn)化規(guī)律，根據(jù)精確分子量和多級質(zhì)譜碎片等相關(guān)信息，初步分析并鑒定了蒼術(shù)苷A的4個腸道菌群代謝產(chǎn)物。結(jié)果顯示，蒼術(shù)苷A的可能代謝途徑包括脫葡萄糖、氧化、去甲基化、脫水和乙?；?。比較蒼術(shù)苷A與菌共培養(yǎng)前后各成分峰面積，蒼術(shù)苷A與腸道菌群共培養(yǎng)后實(shí)驗(yàn)組峰面積較對照組降低99.5%，在實(shí)驗(yàn)組中檢測到蒼術(shù)苷A的代謝產(chǎn)物b～e的峰面積較高，而這些成分在對照組中極低甚至未檢測到。表明蒼術(shù)苷A能夠被腸道菌群幾乎完全轉(zhuǎn)化代謝。關(guān)于代謝產(chǎn)物b～e 4種成分的進(jìn)一步鑒定，課題組試圖購買對照品比對驗(yàn)證，但均未如愿買到對照品，故本結(jié)果主要以數(shù)據(jù)庫比對和分析推導(dǎo)確定；也由于本實(shí)驗(yàn)儀器所限無法對更多的代謝物進(jìn)行鑒定，這些問題將是后期需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。本研究結(jié)果為初步明確焦蒼術(shù)及蒼術(shù)苷A發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于體外共孵育與體內(nèi)環(huán)境相比，會存在溫度、pH值、養(yǎng)分供應(yīng)、宿主因素、菌群動態(tài)變化等方面的不同可能會影響腸道菌群與藥物之間的相互作用，需要進(jìn)一步的體內(nèi)驗(yàn)證。本研究通過體外共孵育研究獲得的結(jié)果為復(fù)雜的體內(nèi)代謝研究提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Metabolic regularity of intestinal flora on alcohol extracts ofbefore and after stir-frying and incremental component atractyloside A byco-incubation method

CAO Huangliang1, 2, 3, LIU Chunlian1, 2, 3, CHEN Gaoyuan1, 2, 3, YAO Ding1, 2, 3, XIAO Yangxin1, 2, 3, LIU Yanju1, 2, 3

1. College ofPharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 2. Hubei Engineering Research Center of Chinese Material Medica Processing Technology, Wuhan 430065, China 3. Hubei Shizhen Laboratory, Wuhan 430065, China

To clarify the metabolic differences of ethanol extract of Cangzhu () and ethanol extract of deep-friedunder the action of intestinal flora, as well as the metabolic transformation rules of the key component atractyloside A.This study adopted furtherco-incubation method to co-incubate ethanol extract of, ethanol extract of deep-fried, and atractylodes A, the incremental component of stir-coke, with mouse intestinal bacterial solution. UHPLC-LTQ-Orbitrap technology was used to analyze the transformation of ethanol extract ofand ethanol extract of deep-friedafter co-incubation and the metabolites of atractyloside A were identified and analyzed.The peak area of 13 components of atractyloside A, 5-hydroxymethylfurfural, atractylodin, atractylenolactam, 2-(bipheny-4-yl)acetaldehyde, diacetylatractylodinol, atractylenolide II, hymecromone, acetylatractylodinol, atractylenolide I, β-caryophyllene, 3β-acetoxyatractyloketone, atractylodes ketone were all decreased after co-breeding with the intestinal flora of mice. Atractylodin, diacetylatractyloside alcohol, hymecromone, atractylon were particularly decreased in deep-fried. The peak area of 3β-acetoxy-atractylenolide Ⅰ, β-vetiverene, atractylenolide III, guaiene and 7(11)-dien-8-one increased after co-culture of ethanol extract ofand ethanol extract of deep-friedwith bacterial community, and the increase of 3β-acetoxy-atractylenolide Ⅰ, guaiene and selina-4(14),7(11)-dien-8-one was particularly obvious in deep-fried. Atractyloside A was metabolized by intestinal flora to produce new components. According to the data analysis, four metabolites related to hydroxylation, carbonylation and acetylation were deduced.The intestinal flora had a transformation effect on ethanol extracts ofand deep-fried, and there were differences in the metabolic transformation degree of two components, and most components had a higher transformation (or formation) rate in ethanol extract of deep-fried, which may be the key reason for the enhancement of intestinal strengthening and anti-diarrhea effect of ethanol extract of deep-fried. The metabolic product identification results of atractyloside A further verified the key role of intestinal flora in the influence of components.

; deep-fried; atractylodes A; gut microbiota; component transformation;co-incubation method; UHPLC-LTQ-Orbitrap technology; diatractylodin; diacetylatractylodinol; hymecromone; atractylodes ketone; 3β-acetoxy-atractylenolide I; β-vetiverene; atractylenolide III; guaiene; selina-4(14),7(11)-dien-8-one

R283.6

A

0253 - 2670(2024)08 - 2641 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.015

2023-09-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074018）；湖北省中央引導(dǎo)地方發(fā)展項(xiàng)目（2020ZYYD030）

曹皇亮，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庯嬈谥乒に?、質(zhì)量控制及原理。E-mail: 1160349122@qq.com

通信作者：劉艷菊，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)橹兴庯嬈谥乒に嚒①|(zhì)量控制及原理。Tel: (027)68890101 E-mail: lyj1965954@sohu.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]