賈金浩，陳小菲，李寒冰，李偉霞，王曉艷，張 輝，張明亮，汪 彬，韓 冰，紀(jì)秋如，肖小河，唐進(jìn)法, *

基于抗炎效應(yīng)成分指數(shù)的金銀花配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

賈金浩1，陳小菲2, 3，李寒冰2，李偉霞2，王曉艷2，張 輝2，張明亮2，汪 彬1，韓 冰1，紀(jì)秋如1，肖小河3*，唐進(jìn)法1, 2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南省中藥臨床應(yīng)用、評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化工程研究中心，河南省中藥臨床藥學(xué)中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000 3. 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心，北京 100039

以抗炎為例，建立基于效應(yīng)成分指數(shù)（effect-constituents index，ECI）的金銀花配方顆粒質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)方法。采用超高效液相色譜法測(cè)定22批次不同標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)標(biāo)/企標(biāo)）的金銀花配方顆粒樣品中9種具有抗炎活性的單體成分（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、斷馬錢子酸、斷氧化馬錢子苷、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）含量，采用環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）試劑盒測(cè)定上述樣品的抗炎效價(jià)和相關(guān)單體成分的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50），進(jìn)而整合分析獲取上述各個(gè)成分的抗炎效價(jià)權(quán)重系數(shù)，通過(guò)權(quán)重系數(shù)和效價(jià)整合計(jì)算得到ECI，最后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所構(gòu)建的ECI的可行性。抗炎成分含量測(cè)定結(jié)果顯示，9種單體成分含量存在較大的差異，其中國(guó)標(biāo)批次（S1～S11）和企標(biāo)批次（S12～S22）在單體成分的含量高低也存在顯著差異，如國(guó)標(biāo)批次（S8）中綠原酸的含量是企標(biāo)批次（S16）中該成分含量的3.3倍（43.0612.98 mg/g）。國(guó)標(biāo)（S1～S11）樣品的整體穩(wěn)定性與企標(biāo)（S12～S22）樣品相差不大（RSD國(guó)標(biāo)＝211.55，RSD企標(biāo)＝215.71）。生物效價(jià)測(cè)定方法通過(guò)了方法學(xué)考察，結(jié)果顯示國(guó)標(biāo)樣品的抗炎效價(jià)和穩(wěn)定性比企標(biāo)更好（效價(jià)國(guó)標(biāo)＝100.28～106.35 U/mL，效價(jià)企標(biāo)＝88.06～95.49 U/mL；RSD國(guó)標(biāo)＝1.98，RSD企標(biāo)＝2.56）。ECI理論計(jì)算結(jié)果顯示該方法結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，能夠反映金銀花配方顆粒樣品的藥效關(guān)系（ECI國(guó)標(biāo)＝10.82～14.11，ECI企標(biāo)＝9.32～12.58；RSD國(guó)標(biāo)＝9.51，RSD企標(biāo)＝10.02）。相關(guān)性分析顯示單一指標(biāo)性成分的含量與抗炎效價(jià)之間正相關(guān)性較好的是綠原酸（＝0.644），其次是木犀草苷（＝0.581），說(shuō)明這2個(gè)成分在抗炎活性中起主要作用。以抗炎為例，建立基于效應(yīng)成分指數(shù)的金銀花配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)方法?？蓱?yīng)用于多批次不同標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)標(biāo)/企標(biāo)）的金銀花配方顆粒的質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)，為其他具有類似抗炎作用的中藥配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究及應(yīng)用提供科學(xué)參考。

質(zhì)量評(píng)價(jià)；效應(yīng)成分指數(shù)；抗炎；金銀花；配方顆粒；新綠原酸；綠原酸；隱綠原酸；斷馬錢子酸；斷氧化馬錢子苷；木犀草苷；異綠原酸B；異綠原酸A；異綠原酸C

符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式是中藥質(zhì)量研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，同時(shí)也是限制中藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一[1]。目前中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究有了全方位的進(jìn)步，從整體上對(duì)中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)水平進(jìn)行了提升[2]?，F(xiàn)行中藥質(zhì)量控制的基本模式參照國(guó)外植物藥的質(zhì)量控制方法，借鑒化學(xué)藥質(zhì)量控制的模式所建立，化學(xué)定性鑒別與指標(biāo)成分檢測(cè)是其主要內(nèi)容[3]。然而，僅基于化學(xué)基準(zhǔn)的中藥質(zhì)量控制模式存在指標(biāo)性成分難以全面地反映整體質(zhì)量、與臨床有效性及安全性關(guān)聯(lián)不夠緊密、不能充分體現(xiàn)中醫(yī)藥特色等問(wèn)題，仍存在較大的局限性[4]。生物效價(jià)是可以評(píng)估藥物對(duì)生物體的活性和效果，評(píng)價(jià)藥物有效性或毒性的方法，推動(dòng)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)走進(jìn)臨床、關(guān)聯(lián)療效的關(guān)鍵舉措[5]。將多組分化學(xué)表征和生物效價(jià)檢測(cè)聯(lián)用模式，以效應(yīng)成分指數(shù)（effect-constituents index，ECI）為指標(biāo)作為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法越來(lái)越受到專家的共識(shí)，同時(shí)也為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種新的參考研究模式和分析方法。

ECI是一種質(zhì)量控制綜合量化的評(píng)價(jià)指標(biāo)，可以解決質(zhì)量差異對(duì)臨床療效穩(wěn)定性的影響[6]。該方法融合了化學(xué)評(píng)價(jià)的精準(zhǔn)性和可行性的優(yōu)勢(shì)與生物評(píng)價(jià)關(guān)聯(lián)功效和安全性的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)化學(xué)成分檢測(cè)即可評(píng)價(jià)中藥的藥效品質(zhì)。ECI方法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定一定的效應(yīng)成分的量同時(shí)測(cè)定這些成分的效應(yīng)值后，建立數(shù)學(xué)模型對(duì)效應(yīng)成分賦予一定的權(quán)重進(jìn)行評(píng)價(jià)，即可實(shí)現(xiàn)通過(guò)測(cè)定成分的量而體現(xiàn)中藥之“效”，更有集成性和綜合性的特點(diǎn)[7]。ECI還可以為中藥質(zhì)控指標(biāo)的選擇提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，效應(yīng)權(quán)重大小直接說(shuō)明了成分的活性大小或效應(yīng)指標(biāo)的貢獻(xiàn)度大小[8]。ECI方法的主要限制和挑戰(zhàn)是如何確證藥材中與臨床活性相關(guān)聯(lián)的活性成分以及這些活性成分之間的協(xié)同或拮抗作用如何表征[9]。

中藥配方顆粒是飲片的一種新的形式，是將單味中藥飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥等工藝制成的單味中藥產(chǎn)品，具有使用方便、療效確切等優(yōu)點(diǎn)[10]，發(fā)展中藥配方顆粒行業(yè)是推動(dòng)我國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要舉措[11]。金銀花為忍冬科植物忍冬Thunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效，在中藥處方中具有悠久的使用歷史。金銀花是最常用于清熱解毒的傳統(tǒng)中藥之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明金銀花具有抗炎的作用，可以認(rèn)為抗炎是金銀花清熱解毒的藥理學(xué)基礎(chǔ)[12-14]。因此本研究以金銀花抗炎活性表征其清熱解毒活性，建立基于抗炎ECI的金銀花配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，并應(yīng)用于多批次不同標(biāo)準(zhǔn)的金銀花配方顆粒的質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)，以期為中藥配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究及應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

金銀花配方顆粒共收集到3個(gè)廠家生產(chǎn)的22批樣品，編號(hào)為S1～S22，見(jiàn)表1；對(duì)照品新綠原酸（批號(hào)906-33-2）、綠原酸（批號(hào)327-97-9）、木犀草苷（批號(hào)5373-11-5）、異綠原酸A（批號(hào)89919-62-0）、異綠原酸B（批號(hào)14534-61-3）、異綠原酸C（批號(hào)57378-72-0）、斷氧化馬錢子苷（批號(hào)58822-47-2）、隱綠原酸（批號(hào)905-99-7）、斷馬錢子酸（批號(hào)60077-46-5）購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；純凈水購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；磷酸（批號(hào)4821551）、甲醇（批號(hào)11092007019）、乙腈（批號(hào)JA100630）均為色譜純，購(gòu)自默克股份兩合公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)20230907）、胎牛血清（批號(hào)FA35213）、胰酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PBS（批號(hào)20230902）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；CCK-8試劑（批號(hào)K10182633EF5E）購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號(hào)KL01NPJH0657）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（批號(hào)AK02TDPB4866）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）試劑盒（批號(hào)AK04D28J2524）均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，批號(hào)0000114326）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；COX-2抑制劑篩選試劑盒（批號(hào)S0168）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

表1 22批次金銀花配方顆粒信息

1.3 儀器

Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀（PDA檢測(cè)器，Empower 2色譜工作站）；Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；VARIOSKAN FLASH酶標(biāo)儀、Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；XS105型十萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-100DE型數(shù)顯超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；BS2000型生物統(tǒng)計(jì)軟件（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

2 方法

2.1 基于超高相液相色譜（UPLC）的金銀花配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.1.1 色譜條件 Waters symmetry C18Analytical色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，4%～5% B；1～9 min，5%～6% B；9～13 min，6%～10% B；13～15 min，10%～14% B；15～30 min，14%～17% B；30～33 min，17%～100% B；33～35 min，100% B；35～38 min，100%～4% B。柱溫30 ℃；體積流量0.30 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為238、326、352 nm。

2.1.2 溶液的制備

（1）混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱取新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸對(duì)照品適量，加1 mL 70%甲醇渦旋振蕩1 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。分別吸取以上9個(gè)對(duì)照品母液適量，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，并按照2、5、10、20、50、100倍數(shù)加入70%甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1 000、500、200、100、50、20、10 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，取200 μL上清液待測(cè)。

（2）供試品溶液的制備：取適量22批次金銀花配方顆粒研細(xì)，精密稱定10 mg置EP管中，精密加入70%甲醇2.5 mL，稱定質(zhì)量，500 W、40 kHz超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，取200 μL上清液待測(cè)。

（3）抗炎活性成分溶液的制備：精密稱取9種抗炎生物活性成分（新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸）對(duì)照品適量，配制成1 280、320、80、20、5 μg/mL的對(duì)照品溶液，渦旋振蕩1 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系考察：分別取200 μL質(zhì)量濃度為1 000、500、200、100、50、20、10 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，注入U(xiǎn)PLC進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（），各樣品實(shí)際質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為新綠原酸＝19 408 606.67，綠原酸＝20 252 920.63，木犀草苷＝15 328 284.49－252.73，異綠原酸A＝25 368 359.55，異綠原酸B＝20 116 208.37，異綠原酸C＝22 615 751.77，斷氧化馬錢子苷＝10 931 506.74－8 461.64，隱綠原酸＝15 980 107－4 328.69，斷馬錢子酸＝5 784 352.17。結(jié)果表明新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，值均大于0.999。

（2）精密度試驗(yàn)：取200 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣8次，記錄目標(biāo)化合物的色譜峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，金銀花配方顆粒中新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸峰面積的RSD分別為0.44%、3.05%、0.22%、0.21%、0.32%、0.29%、0.29%、0.37%、0.94%，表明儀器的精密度良好。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)：取S4批號(hào)的金銀花配方顆粒樣品適量，平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，記錄目標(biāo)化合物的色譜峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，金銀花配方顆粒中新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為0.32%、0.62%、0.58%、0.62%、0.53%、0.56%、0.57%、0.57%、0.82%，表明該方法重復(fù)性較好。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S4批號(hào)的金銀花配方顆粒樣品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件于1、3、6、12、24 h進(jìn)樣，記錄目標(biāo)化合物的色譜峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，金銀花配方顆粒中新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸在24 h內(nèi)峰面積的RSD分別為0.79%、1.04%、0.78%、0.62%、0.86%，0.90%、1.12%、1.79%、1.14%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

（5）加樣回收率試驗(yàn)：取S4批號(hào)的金銀花配方顆粒樣品粉末，置于5 mL EP管中，分別加入相等質(zhì)量的對(duì)照品（以各化合物的對(duì)照品溶液形式加入），最后加入一定量甲醇溶液至總體積為2.5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果顯示，金銀花配方顆粒中新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸的回收率為95.0%～104.9%，RSD分別為0.79%、0.68%、0.78%、0.56%、0.67%、0.91%、1.17%、0.70%、0.59%，表明方法的準(zhǔn)確性較好。

2.2 基于抗炎活性生物效價(jià)的測(cè)定

2.2.1 基于抗炎活性生物效價(jià)的方法測(cè)定

（1）供試品溶液的制備：取適量22批金銀花配方顆粒樣品于研缽中均勻混合后，制備成混樣，稱取1 mg混樣，加入1 mL COX-2 Assay Buffer制備成1 mg/mL的混樣母液，制備成640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 μg/mL的溶液。

（2）工作參照液的制備：以試劑盒中的塞來(lái)昔布為工作參照品，20 μL塞來(lái)昔布溶液中加入980 μL COX-2 Assay Buffer，再加入640 μg β-環(huán)糊精惰性物質(zhì)，將塞來(lái)昔布配制成640 μg/mL的母液，制備成640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 μg/mL的溶液。

（3）樣品檢測(cè)：取96孔黑板，空白對(duì)照孔加入80 μL COX-2 Assay Buffer、5 μL COX-2 Cofactor工作液、5 μL樣品溶劑，100%酶活性對(duì)照孔加入75 μL COX-2 Assay Buffer、5 μL COX-2 Cofactor工作液、5 μL COX-2工作液、5 μL樣品溶劑，陽(yáng)性抑制劑對(duì)照孔加入75 μL COX-2 Assay Buffer、5 μL COX-2 Cofactor工作液、5 μL COX-2工作液、5 μL塞來(lái)昔布，樣品孔加入75 μL COX-2 Assay Buffer、5 μL COX-2 Cofactor工作液、5 μL COX-2工作液、5 μL待測(cè)樣品?；靹?，37 ℃孵育10 min。激發(fā)波長(zhǎng)為560 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm，進(jìn)行熒光測(cè)定。記錄每個(gè)樣品孔和空白對(duì)照孔的平均熒光值（RFU），計(jì)算每個(gè)樣品的抑制率。

抑制率＝(RFU100%酶活性對(duì)照－RFU樣品)/(RFU100%酶活性對(duì)照－RFU空白對(duì)照)

2.2.2 基于抗炎活性生物效價(jià)方法的建立

（1）工作對(duì)照品的賦值：選用試劑盒中的塞來(lái)昔布為工作對(duì)照品，約定其效價(jià)為100 U/mL作為金銀花供試品溶液的參照效價(jià)，通過(guò)與工作對(duì)照品約定的效價(jià)對(duì)比來(lái)評(píng)價(jià)各批次金銀花供試品的品質(zhì)。

（2）線性關(guān)系考察：供試品溶液、工作參照液質(zhì)量濃度為640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 μg/mL，按照生物效價(jià)測(cè)定方法測(cè)定每個(gè)質(zhì)量濃度的吸光度（）值，計(jì)算COX-2酶抑制率，考察抑制率與對(duì)數(shù)劑量之間是否呈良好的對(duì)稱“S”形曲線，來(lái)確定選取質(zhì)量濃度在2.5～640.0 μg/mL與抑制率是否具有良好的線性關(guān)系。

（3）可靠性檢驗(yàn)：經(jīng)量效關(guān)系考察，條件優(yōu)化后，選取劑間比為1∶0.125的低、中、高濃度作為金銀花配方顆?？寡咨镄r(jià)測(cè)定濃度，通過(guò)BS2000生物統(tǒng)計(jì)軟件，選用量反應(yīng)平行線（3.3）法，輸入T估計(jì)效價(jià)為100 U/mL，T最大劑量為320 μg/mL，S最大劑量為320 μg/mL，劑間比為1∶0.125，并輸入低、中、高濃度供試品溶液、工作參照液樣品的抑制率，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到可靠性檢驗(yàn)結(jié)果。

（4）方法學(xué)考察：方法學(xué)考察分為精密度考察、重復(fù)性考察和穩(wěn)定性考察，主要對(duì)儀器的精密度是否良好、方法的重復(fù)性是否良好、供試品溶液的配置時(shí)間等因素進(jìn)行考察。

精密度考察：選取低、中、高質(zhì)量濃度分別為5、40、320 μg/mL的供試品溶液、工作參照液測(cè)定濃度，以工作參照液為S組，供試品溶液為T(mén)組，通過(guò)BS2000生物統(tǒng)計(jì)軟件，選用量反應(yīng)平行線3.3法，輸入T估計(jì)效價(jià)為100 U/mL，T最大劑量為320 μg/mL，S最大劑量為320 μg/mL，劑間比為1∶0.125，并輸入低、中、高質(zhì)量濃度供試品溶液、工作參照液的抑制率，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到效價(jià)值（Pt），連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果顯示，連續(xù)6次測(cè)定均能夠通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，求得效價(jià)的RSD值為2.51%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

重復(fù)性考察：選取低、中、高質(zhì)量濃度分別為5、40、320 μg/mL的供試品溶液、工作參照液測(cè)定濃度，平行制備6份，同精密度考察方法連續(xù)進(jìn)行6次測(cè)定。結(jié)果顯示，供試品溶液均通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，效價(jià)的RSD值為1.64%，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性考察：選取低、中、高質(zhì)量濃度分別為5、40、320 μg/mL的供試品溶液、工作參照液測(cè)定濃度，平行制備4份，分別于制備好后的0、1、2、3、4 h，同精密度考察方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，5次測(cè)定的效價(jià)的RSD值為1.19%。表明為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，供試品最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

（5）樣品的測(cè)定：分別制備供試品溶液、工作參照液，以工作參照液為S組，供試品溶液為T(mén)組，通過(guò)BS2000生物統(tǒng)計(jì)軟件，選用量反應(yīng)平行線（3.3）法，輸入T估計(jì)效價(jià)為100 U/mL，T最大劑量為10 mg/mL，S最大劑量為10 mg/mL，劑間比為1∶0.125，并輸入低、中、高質(zhì)量濃度供試品溶液、工作參照液的抑制率，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到Pt和可信限率（FL）[15]。

2.2.3 COX-2試劑盒測(cè)定抗炎活性成分的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50） 按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備9種抗炎活性成分溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定抑制率，通過(guò)GraphPad Prism 9.0軟件，輸入各成分的濃度和抑制率，計(jì)算得到IC50。

2.2.4 抗炎生物效價(jià)權(quán)重系數(shù)（ECF）和ECI的建立 根據(jù)COX-2試劑盒選用不同質(zhì)量濃度對(duì)照品來(lái)測(cè)定金銀花各個(gè)抗炎成分的IC50，計(jì)算各個(gè)抗炎成分的ECF。

通過(guò)整合ECF和含量測(cè)定結(jié)果計(jì)算抗炎ECI，以表征金銀花中9種具有抗炎生物活性成分對(duì)本實(shí)驗(yàn)中抗炎作用的貢獻(xiàn)總和。

ECF代表成分的抗炎活性生物效價(jià)權(quán)重系數(shù)，C代表金銀花中單體成分的實(shí)際含量

2.2.5 相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 9.0軟件上進(jìn)行相關(guān)性分析。根據(jù)相關(guān)系數(shù)（）評(píng)估每種單體成分與實(shí)際測(cè)得的抗炎生物效價(jià)之間的相關(guān)性。

2.2.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

（1）細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以5 000個(gè)/孔接種到96孔板上，于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜。接種24 h后，用純水配制S9批次金銀花配方顆粒藥液使其質(zhì)量濃度為0、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000 μg/mL，棄去孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入200 μL對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液。加藥結(jié)束后，繼續(xù)置于孵箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，取出孔板，每孔加入CCK-8溶液后繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。取出孔板，避光，于搖床上輕輕搖晃3～5 min后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的值。

（2）上清液中TNF-α、IL-1β、COX-2水平的檢測(cè)：RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以5 000個(gè)/孔接種到96孔板上，于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜。接種12 h后，設(shè)置對(duì)照組、模型組和給藥組，棄去孔板中的培養(yǎng)基，模型組和給藥組加入2 ng/mL LPS，給藥組加入0.5 mg/mL藥液，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，于孵箱培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出孔板，收集細(xì)胞上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、IL-1β、COX-2水平。

3 結(jié)果

3.1 基于UPLC的金銀花配方顆粒含量測(cè)定

混合對(duì)照品溶液和不同批次樣品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1，采用UPLC法測(cè)定金銀花中9種具有抗炎活性成分的含量測(cè)定，如表2所示，9種單體成分含量存在較大的差異，其中國(guó)標(biāo)批次（S1～S11）和企標(biāo)批次（S12～S22）之間在單體成分的含量高低也存在顯著差異，如S8批次中綠原酸的含量比S16批次中該成分含量高3.3倍（43.0612.98 mg/g）。在9個(gè)抗炎活性成分中，成分2（綠原酸）和成分4（斷馬錢子酸）的含量顯著高于其他成分的含量，并且國(guó)標(biāo)的成分含量平均值要普遍高于企標(biāo)，國(guó)標(biāo)的成分2、成分4及總體的RSD要小于企標(biāo)，從含量測(cè)定結(jié)果中初步說(shuō)明國(guó)標(biāo)的質(zhì)量一致性和穩(wěn)定性比企標(biāo)的更好。

3.2 金銀花配方顆粒效價(jià)結(jié)果

3.2.1 線性關(guān)系考察結(jié)果 金銀花配方顆粒和陽(yáng)性藥塞來(lái)昔布均能通過(guò)可靠檢驗(yàn)，樣品量效曲線形狀與工作參照物相同，且線性回歸方程（＝31.983＋5.659）與對(duì)照藥塞來(lái)昔布（＝31.983＋7.789）較為一致，提示兩者作用趨勢(shì)和規(guī)律相同，抑制率與對(duì)數(shù)劑量之間呈良好的對(duì)稱“S”形曲線，說(shuō)明質(zhì)量濃度在2.5～640 μg/mL與抑制率的線性關(guān)系良好，最終確定低、中、高質(zhì)量濃度分別為5、40、320 μg/mL。

1-新綠原酸；2-綠原酸；3-隱綠原酸；4-斷馬錢子酸；5-斷氧化馬錢子苷；6-木犀草苷；7-異綠原酸B；8-異綠原酸A；9-異綠原酸C。

表2 22批次金銀花配方顆粒樣品中9種具有抗炎活性的單體成分的含量

3.2.2 可靠性檢驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版四部中量反應(yīng)平行線法可靠性檢驗(yàn)結(jié)果成立的判別要求，量反應(yīng)平行線（3.3）法可靠性測(cè)驗(yàn)的結(jié)果，回歸項(xiàng)應(yīng)非常顯著（＜0.01），偏離平行、二次曲線、反向二次曲線各項(xiàng)均應(yīng)不顯著（＞0.05）。可靠性檢驗(yàn)中回歸項(xiàng)和二次曲線項(xiàng)用來(lái)檢驗(yàn)S和T是直線還是二次曲線關(guān)系，結(jié)果中回歸項(xiàng)極顯著（＜0.01），說(shuō)明隨著工作參照物S和T的給藥劑量的增加。偏離平行項(xiàng)和反向二次曲線用來(lái)檢驗(yàn)S和T的平行性，回歸項(xiàng)極顯著，偏離平行以下各項(xiàng)都不顯著，則S和T為平行直線。如表3所示，結(jié)果中偏離平行、二次曲線、反向二次曲線均不顯著（＞0.05），說(shuō)明S和T 2條直線是平行關(guān)系。表明本方法能通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，可認(rèn)為S和T具有同質(zhì)性，所以T的生物效價(jià)可看作為稀釋或濃縮一定倍數(shù)的S的生物效價(jià)。

表3 金銀花配方顆粒樣品效價(jià)可靠性檢驗(yàn)

3.2.3 金銀花配方顆?？寡咨镄r(jià)測(cè)定和抗炎活性成分IC50測(cè)定 如表4所示，國(guó)標(biāo)批次（S1～S11）的生物效價(jià)在100.28～106.35 U/mL，企標(biāo)批次（S12～S22）的生物效價(jià)在88.06～95.49 U/mL。如表5所示，9種指標(biāo)性成分的IC50在6.84～210.40 μg/mL，成分之間的IC50差異較大。

表4 22批次金銀花配方顆粒樣品的效價(jià)

表5 金銀花配方顆粒9個(gè)成分的IC50

3.3 ECI的理論計(jì)算

如表6所示，國(guó)標(biāo)批次（S1～S11）的金銀花配方顆粒ECI為10.82～14.11，企標(biāo)批次（S12～S22）的金銀花配方顆粒ECI為9.32～12.58，表明國(guó)標(biāo)金銀花配方顆粒樣品的ECI相對(duì)較高，而企標(biāo)金銀花配方顆粒樣品的ECI相對(duì)較低，說(shuō)明金銀花國(guó)標(biāo)批次配方顆粒整體質(zhì)量、穩(wěn)定性和抗炎藥效要高于企標(biāo)批次。

表6 22批次金銀花配方顆粒樣品的ECI和效價(jià)

3.4 ECI和單體成分含量與實(shí)際測(cè)得抗炎效價(jià)之間的相關(guān)性分析

根據(jù)比較構(gòu)建的ECI與實(shí)際測(cè)得金銀花樣品抗炎作用效價(jià)和9個(gè)指標(biāo)性單體成分的含量與抗炎效價(jià)之間的相關(guān)性[以相關(guān)系數(shù)（）表示]，來(lái)分析ECI和抗炎作用單體成分含量來(lái)表征金銀花配方顆粒實(shí)際測(cè)得抗炎效價(jià)的準(zhǔn)確性。結(jié)果分析顯示，與9個(gè)指標(biāo)性單體成分含量的相關(guān)性相比較，ECI與金銀花實(shí)測(cè)抗炎生物效價(jià)之間有較好的相關(guān)性，＝0.673（圖2-A），提示ECI可作為評(píng)價(jià)金銀花配方顆粒各樣品是否具有強(qiáng)抗炎作用的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。估計(jì)值與金銀花生物效能的實(shí)際測(cè)量值之間的差異，即統(tǒng)計(jì)殘差，可用于評(píng)估ECI的準(zhǔn)確性。殘差分布圖顯示ECI的離散度非常窄（圖2-B），提示當(dāng)評(píng)價(jià)不同來(lái)源的抗炎效果時(shí)，ECI是一個(gè)更準(zhǔn)確評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用殘差平方和作為量化指標(biāo)反映出ECI（＝10）作為一張金銀花質(zhì)量控制指標(biāo)的準(zhǔn)確度優(yōu)于其余評(píng)價(jià)指標(biāo)（圖2-C）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，ECI作為金銀花抗炎活性的一種評(píng)價(jià)指標(biāo)的準(zhǔn)確性是相對(duì)比較可靠的。

圖3結(jié)果表明單一指標(biāo)性成分的含量高低與配方顆粒實(shí)際測(cè)得抗炎生物效價(jià)之間相關(guān)性最好的是綠原酸（＝0.644），其次是木犀草苷（＝0.581）。新綠原酸、隱綠原酸、斷氧化馬錢子苷的含量與金銀花樣品實(shí)際測(cè)得的生物效價(jià)之間的相關(guān)性普遍較差間的相關(guān)性普遍較差，為?1.44～?0.194。

3.5 細(xì)胞驗(yàn)證結(jié)果

3.5.1 金銀花配方顆粒對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 如圖4所示，0.062 5～0.500 0 mg/mL的金銀花配方顆粒對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響。以質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的金銀花配方顆粒用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

A-金銀花配方顆粒樣品的ECI與實(shí)際測(cè)得的生物活性之間的相關(guān)性分析，藍(lán)線代表線性擬合，紅線代表置信帶，黑線代表預(yù)測(cè)帶，＝0.673；B-ECI的標(biāo)準(zhǔn)化殘差分布圖；C-殘差的平方和。

A-correlation analysis between ECI and actual measured bioactivities ofdispensing granules samples, blue line represents the linear fit, red line represents the confidence band, and black line represents the prediction band,= 0.673; B-standardized residual distribution map of ECI; C-sum of squares of residuals.

圖2 相關(guān)性分析結(jié)果

Fig. 2 Results of correlation analysis

圖3 金銀花配方顆粒樣品中各生物活性成分含量與實(shí)際測(cè)得的抗炎作用之間的相關(guān)性分析

3.5.2 金銀花配方顆粒對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、COX-2水平的影響 如圖5所示，與模型組比較，22批次金銀花配方顆粒均可顯著抑制上清液中TNF-α、IL-1β、COX-2水平（＜0.05）。從國(guó)標(biāo)組和企標(biāo)組的對(duì)比結(jié)果（圖6）可以看出，國(guó)標(biāo)組降低炎癥因子水平的效果比企標(biāo)組好，提示該結(jié)果與金銀花配方顆粒的效價(jià)結(jié)果和ECI結(jié)果相符合。

4 討論

生物效應(yīng)評(píng)價(jià)的方法是實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化的有效途徑，是連接臨床療效與中藥質(zhì)量的橋梁[16]。中藥ECI是基于單體成分分析和生物效價(jià)檢測(cè)共同加權(quán)的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，其可通過(guò)中藥中活性成分的“量-效”關(guān)系方程來(lái)建立。肖小河教授提出構(gòu)建“中藥品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)控力金字塔”，在基于化學(xué)基準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加效應(yīng)基準(zhǔn)，逐步建立以生物評(píng)價(jià)為核心手段和指標(biāo)之一的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，這將是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)的重要發(fā)展方向[17]。

與對(duì)照組（0 mg?mL?1）比較：**P＜0.01。

本研究通過(guò)在單體成分含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，增加了金銀花抗炎的生物效價(jià)測(cè)定方法，并構(gòu)建了一種基于生物效價(jià)權(quán)重系數(shù)加權(quán)的多組分化學(xué)定量分析的中藥質(zhì)量評(píng)控方法，并且通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平驗(yàn)證了該方法的結(jié)果，說(shuō)明方法可行、可靠。本研究的含量測(cè)定結(jié)果顯示，綠原酸的含量最高，其次是斷馬錢子酸，其他7種成分含量較低，該結(jié)果與魏悅等[18]的含量測(cè)定結(jié)果一致，說(shuō)明建立的含量測(cè)定分析方法準(zhǔn)確、可行、重復(fù)性良好。本研究在譚鵬等[19]研究金銀花配方顆粒方法的基礎(chǔ)上，對(duì)22批不同標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)標(biāo)/企標(biāo)）的金銀花配方顆粒樣品進(jìn)行質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明國(guó)標(biāo)樣品抗炎活性和穩(wěn)定性要優(yōu)于企標(biāo)，國(guó)標(biāo)樣品的質(zhì)量一致性較好，說(shuō)明國(guó)標(biāo)的出臺(tái)，一定程度地結(jié)束了“異地異標(biāo)準(zhǔn)，各廠各規(guī)范”現(xiàn)象，成為中藥配方顆粒生產(chǎn)質(zhì)量的“指南針”，更能保障中藥配方顆粒整體質(zhì)量穩(wěn)定和均一。從相關(guān)性結(jié)果分析顯示，綠原酸、木犀草苷的含量與金銀花發(fā)揮抗炎作用的關(guān)聯(lián)度較大，這與Zhang等[20]、施春燕[21]、熊樂(lè)文等[22]的研究相似，這2個(gè)成分同樣也是作為《中國(guó)藥典》2020年版[18]和金銀花配方顆粒國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分，說(shuō)明該相關(guān)性分析結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、具有參考意義。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

圖6 國(guó)標(biāo)組和企標(biāo)組TNF-α、IL-1β、COX-2水平的對(duì)比

綜上，本研究建立了基于抗炎活性檢測(cè)的ECI測(cè)定方法，用于金銀花配方顆粒的質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠，適應(yīng)性強(qiáng)，本研究可以為其他具有類似抗炎作用的中藥配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究及應(yīng)用提供科學(xué)參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation ofFlos dispensing granules based on anti-inflammatory effect component index

JIA Jinhao1, CHEN Xiaofei2, 3, LI Hanbing2, LI Weixia2, WANG Xiaoyan2, ZHANG Hui2, ZHANG Mingliang2, WANG Bin1, HAN Bing1, JI Qiuru1, XIAO Xiaohe3, TANG Jinfa1, 2

1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Key Laboratory of Clinical Pharmacy of Traditional Chinese Medicine, Henan Engineering Research Centre for Clinical Application, Evaluation and Translation of Traditional Chinese Medicine, Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 3. The Fifth Medical Center, Chinese People’s Liberation Army General Hospital, Beijing 100039, China

To establish a method for quality consistency evaluation of Jinyinhua () dispensing granules based on effect-constituents index (ECI) by taking anti-inflammation as an example.Ultra performance liquid chromatography (UPLC) was used to determine the contents of nine monomer components (neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, secologanic acid, secoxyloganin, cymaroside, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C) with anti-inflammatory activity in 22 batches ofdispensing granules of different standards (national standard/enterprise standard, NS/ES), and the anti-inflammatory potency of the above samples and half inhibitory concentration (IC50) of the relevant monomer components were determined by using the cyclooxygenase-2 (COX-2) kit, and then the weight coefficient of anti-inflammatory potency of the above components was obtained by integrative analysis, and ECI was calculated through the integration of weight coefficients and effectors, and finally, the feasibility of the constructed ECI was verified by cellular experiments.The results of anti-inflammatory component content determination showed that there were large differences in the contents of nine individual components, of which there were also significant differences in the content of individual components between the NS batch (S1—S11) and the ES batch (S12—S22), for example, the content of chlorogenic acid in the NS batch (S8) was 3.3 times more than the content of this component in the ES batch (S16) (43.0612.98 mg/g). The overall stability of NS (S1—S11) samples was not much different from that of ES (S12—S22) samples (RSDNS= 211.55, RSDES= 215.71). The bioefficacy assay passed the methodological examination, and the results showed that the anti-inflammatory potency and stability of the NS samples were better than those of the ES samples (potencyNS= 100.28—106.35 U/mL, potencyES= 88.06—95.49 U/mL; RSDNS= 1.98, RSDES= 2.56). The theoretical calculations of ECI showed that the results of the method were consistent with the experimental results, which could reflect the pharmacodynamic relationship of thedispensing granules samples (ECINS= 10.82—14.11, ECIES= 9.32—12.58; RSDNS= 9.51, RSDES= 10.02). Correlation analysis showed that the better positive correlation between the content of single indicator components and anti-inflammatory potency was chlorogenic acid (= 0.644), followed by cymaroside (= 0.581), suggesting that these two components played a major role in anti-inflammatory activity.This study establishes the quality evaluation method ofdispensing granules based on ECI by taking anti-inflammation as an example. It can be applied to the quality consistency evaluation of multiple batches ofdispensing granules with different standards (NS/ES), and provide scientific reference for the quality evaluation research and application of other Chinese medicine dispensing granules with similar anti-inflammatory effects.

quality evaluation; effect-constituents index; anti-inflammation;; dispensing granules; neochlorogenic acid; chlorogenic acid; cryptochlorogenic acid; secologanic acid; secoxyloganin; cynaroside; isochlorogenic acid B; isochlorogenic acid A; isochlorogenic acid C

R285

A

0253 - 2670(2024)08 - 2630 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.014

2023-11-22

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)（23IRTSTHN026）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82173993）；國(guó)家中醫(yī)管理局中醫(yī)藥高質(zhì)量發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新轉(zhuǎn)化工程自主立項(xiàng)項(xiàng)目（CXZH03）

賈金浩，研究方向?yàn)橹兴幣谥茩C(jī)制及飲片標(biāo)準(zhǔn)化研究。Tel: (0371)66245342 E-mail: jjh970423@163.com

通信作者：肖小河，男，博士生導(dǎo)師，研究員，主要從事臨床中藥學(xué)與安全用藥研究。E-mail: pharmacy302@126.com

唐進(jìn)法，男，博士，主任藥師，主要從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與合理用藥研究。E-mail: a0519@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]