林麗婷，王繼森，高天慧，朱宗萍，羅益蓉，卿 瑩，郭亭君，陳元惠，廖 婉*

蓬莪術(shù)醋制前后改善斑馬魚(yú)急性肝損傷的作用機(jī)制研究

林麗婷1，王繼森2#，高天慧1，朱宗萍1，羅益蓉1，卿 瑩1，郭亭君1，陳元惠1，廖 婉1*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 2. 成都市藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610045

基于核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad3信號(hào)通路探討醋制前后蓬莪術(shù)改善硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）誘導(dǎo)斑馬魚(yú)急性肝損傷的作用機(jī)制。以醋制前后的蓬莪術(shù)為研究對(duì)象，建立TAA誘導(dǎo)斑馬魚(yú)急性肝損傷模型，將醋制前后蓬莪術(shù)水煎液分別設(shè)置高、中、低劑量（8、4、2 mg/mL）組，以異甘草酸鎂為陽(yáng)性對(duì)照藥物組，斑馬魚(yú)培養(yǎng)水為對(duì)照組，給藥72 h后觀察斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟形態(tài)，通過(guò)蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理變化；采用試劑盒檢測(cè)斑馬魚(yú)幼魚(yú)中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；利用qRT-PCR檢測(cè)斑馬魚(yú)幼魚(yú)、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，）、和基因表達(dá)；Western blotting測(cè)定斑馬魚(yú)幼魚(yú)Nrf2/HO-1和TGF-β/Smad3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。醋制前后蓬莪術(shù)對(duì)TAA導(dǎo)致的肝組織細(xì)胞形態(tài)損傷具有保護(hù)作用。生化結(jié)果表明，與模型組比較，醋制前后蓬莪術(shù)水煎液組ALT、AST活性及GSH水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），MDA水平均顯著降低（＜0.001）。qRT-PCR結(jié)果表明，與模型組比較，醋制前后蓬莪術(shù)水煎液組、、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），醋蓬莪術(shù)水煎液高劑量組mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.001）；其中，與等劑量蓬莪術(shù)組相比，醋蓬莪術(shù)高劑量組顯著抑制、的mRNA表達(dá)（＜0.05、0.001），且醋蓬莪術(shù)具有促進(jìn)和mRNA表達(dá)的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異。Western blotting結(jié)果表明，與模型組比較，蓬莪術(shù)水煎液高、中劑量組和醋蓬莪術(shù)水煎液各劑量組Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001），蓬莪術(shù)高劑量組和醋蓬莪術(shù)各劑量組Smad3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），蓬莪術(shù)水煎液高劑量組和醋蓬莪術(shù)水煎液高、中劑量組TGF-β蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）；其中，與等劑量蓬莪術(shù)組相比，醋蓬莪術(shù)各劑量組Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001），且醋蓬莪術(shù)具有抑制Smad3和TGF-β蛋白表達(dá)的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異。醋制前后的蓬莪術(shù)可以不同程度地改善TAA誘發(fā)的急性肝損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)控Nrf2/HO-1和TGF-β/Smad3信號(hào)通路有關(guān)。

蓬莪術(shù)；急性肝損傷；核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1通路；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/Smad3信號(hào)通路；姜黃素；呋喃二烯

蓬莪術(shù)是《中國(guó)藥典》2020年版中莪術(shù)的主要來(lái)源之一，為姜科植物Val.的干燥根莖[1]。蓬莪術(shù)性溫，味辛、苦，歸肝、脾經(jīng)，具有行氣破血、消積止痛的功效，被譽(yù)為“破血消癥要藥”。中醫(yī)臨床上常用于治療癥痕痞塊、瘀血經(jīng)閉?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蓬莪術(shù)具有抗肝炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[2]。蓬莪術(shù)醋制品也為中醫(yī)臨床的常用藥物，清《本經(jīng)逢原》載：“莪術(shù)，入肝經(jīng)藥醋炒”[3-4]。醋制后蓬莪術(shù)主入肝經(jīng)血分，能增強(qiáng)散瘀止痛的作用。課題組前期發(fā)現(xiàn)蓬莪術(shù)能通過(guò)影響肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smads通路延緩肝病進(jìn)程，醋制后對(duì)刀豆球蛋白A所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用比生品強(qiáng)[5]。醋制后蓬莪術(shù)能夠更好地調(diào)控Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而改善肝損傷癥狀[6]。

急性肝損傷（acute liver injury，ALI）是指短時(shí)間內(nèi)由多種原因如自身免疫、酒精、病毒及化學(xué)物質(zhì)等原因引發(fā)肝細(xì)胞受損的一種疾病，以細(xì)胞壞死、炎癥和氧化損傷為特征，嚴(yán)重情況下可迅速發(fā)展成危及生命的急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）[7]。硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）是一種經(jīng)典的肝臟有毒化合物，可通過(guò)引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致器官受損，被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建肝損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚8]。研究表明，TAA可導(dǎo)致斑馬魚(yú)的ALI，具有與哺乳動(dòng)物模型相似的病理特征，存在著脂肪變性-纖維化-凋亡的過(guò)程[9]。因此，本研究采用模式生物斑馬魚(yú)，建立TAA誘導(dǎo)的ALI模型，探究醋制前后蓬莪術(shù)水煎液對(duì)肝損傷的保護(hù)作用，基于核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信號(hào)通路和TGF-β/Smad3信號(hào)通路探討醋制前后蓬莪術(shù)水煎液對(duì)肝損傷的改善作用機(jī)制，為蓬莪術(shù)在臨床上防治ALI提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

AB系野生型斑馬魚(yú)，購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心，于成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)飼養(yǎng)。在28 ℃、光照14 h/黑暗10 h的環(huán)境下，將成熟的健康雌性和雄性AB系野生型斑馬魚(yú)分別放養(yǎng)，每天喂2次豐年蝦。實(shí)驗(yàn)前1晚，將健康的AB斑馬魚(yú)成魚(yú)，按雌雄1∶2的比例放入底部有篩網(wǎng)的交配缸內(nèi)，用透明隔板隔開(kāi)，次日清晨移除隔板，產(chǎn)卵1 h內(nèi)觀察產(chǎn)卵量并收集魚(yú)卵。

1.2 藥材

蓬莪術(shù)飲片（批號(hào)1903041）購(gòu)自四川成都荷花池中藥材專業(yè)市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)裴瑾教授鑒定為姜科植物蓬莪術(shù)Val.的干燥根莖。醋蓬莪術(shù)飲片采用課題組前期專利方法進(jìn)行炮制（專利號(hào)ZL201310400255.2）：取蓬莪術(shù)飲片，按10︰3的比例加入9°米醋，攪拌均勻后悶潤(rùn)2 h，煮干醋液后，于120 ℃干燥30 min，取出放涼，干燥即得。

1.3 藥品與試劑

二甲苯（批號(hào)2022051901）、無(wú)水乙醇（批號(hào)2022070501）購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液套裝（批號(hào)DH0020）購(gòu)自Leagene公司；中性樹(shù)膠（批號(hào)10004160）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號(hào)140122005）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號(hào)140222005）購(gòu)自Mindray公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（批號(hào)AK06HXZ06586）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)AK038P4L0488）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Animal Total RNA Isolation Kit（批號(hào)RE-03014）購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號(hào)G2003-50T）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；β-actin抗體（批號(hào)AF7018）購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；Nrf2抗體（批號(hào)YT3189）購(gòu)自美國(guó)ImmunoWay公司；Smad3抗體（批號(hào)ET1607-41）、TGF-β抗體（批號(hào)HA721143）購(gòu)自成都華江生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)70-GAR0072）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（批號(hào)70-GAM0072）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；異甘草酸鎂注射液（批號(hào)20211101204）購(gòu)自南京正大天晴制藥有限公司。

1.4 儀器

HM325型切片機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Stepone plus型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；SLAN-96S型全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）；D3024型臺(tái)式高速微量離心機(jī)、D3024R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽洛捷克SCILOGEX公司）；ChemiScope 6100型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 醋制前后蓬莪術(shù)水煎液的制備

取蓬莪術(shù)、醋蓬莪術(shù)飲片，分別加15倍量去離子水，浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，趁熱濾過(guò)，合并2次水煎液，50 ℃減壓濃縮，即得醋制前后蓬莪術(shù)水煎液。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版含量測(cè)定的方法，經(jīng)高效液相色譜儀分別測(cè)定，蓬莪術(shù)水煎液中姜黃素的質(zhì)量濃度為1.366 mg/mL，呋喃二烯的質(zhì)量濃度為0.024 mg/mL；醋蓬莪術(shù)水煎液中姜黃素的質(zhì)量濃度為11.907 mg/mL，呋喃二烯的質(zhì)量濃度為0.018 mg/mL。

2.2 動(dòng)物分組、造模與給藥

在斑馬魚(yú)發(fā)育至受精后72 h（72 h post fertilization，72 hpf），挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、異甘草酸鎂（5 mg/mL）組及蓬莪術(shù)水煎液高、中、低劑量（8、4、2 mg/mL）組和醋蓬莪術(shù)水煎液高、中、低劑量（8、4、2 mg/mL）組。移入12孔板的樣孔中，每孔10條幼魚(yú)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入2 mL斑馬魚(yú)培養(yǎng)水，模型組加入2 mL TAA（8 mmol/L），各給藥組加入1 mL TAA（8 mmol/L）和1 mL相應(yīng)藥物，連續(xù)3 d于同一時(shí)刻給藥，初次給藥體積為2 mL，此后每天換液一半，以保持藥量和水質(zhì)的新鮮。

2.3 斑馬魚(yú)肝臟表型觀察

給藥后72 h（72 h post exposure，72 hpe），收集各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)，首先使用三卡因麻醉3 min，然后固定于羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）中。調(diào)整斑馬魚(yú)姿勢(shì)為側(cè)臥位，在體式顯微鏡下采集圖像，觀察斑馬魚(yú)肝臟表型。

2.4 HE染色法觀察肝臟病理情況

斑馬魚(yú)幼魚(yú)的新鮮組織經(jīng)多聚甲醛固定24 h后，進(jìn)行脫水、包埋，制作3 μm石蠟切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)，隨機(jī)選取視野進(jìn)行拍照記錄。

2.5 斑馬魚(yú)幼魚(yú)中ALT、AST活性及GSH、MDA水平的測(cè)定

取斑馬魚(yú)幼魚(yú)，提取蛋白，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定ALT、AST活性及GSH、MDA水平。

2.6 qRT-PCR法測(cè)定斑馬魚(yú)幼魚(yú)中Nrf2、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、Smad3、Smad7mRNA表達(dá)

取斑馬魚(yú)幼魚(yú)，提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，將反應(yīng)得到的cDNA作為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，循環(huán)1次，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，循環(huán)40次。使用PCR儀自帶軟件進(jìn)行熒光定量分析，依據(jù)t值計(jì)算2???Ct，以β-actin為內(nèi)參基因計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.7 Western blotting測(cè)定斑馬魚(yú)幼魚(yú)中Nrf2、Smad3和TGF-β蛋白表達(dá)

取斑馬魚(yú)幼魚(yú)，提取總蛋白，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜3次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜3次，每次5 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，用凝膠成像儀自帶分析軟件分析條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 斑馬魚(yú)肝臟表型觀察結(jié)果

如圖1所示，異甘草酸鎂組斑馬魚(yú)肝臟形狀均勻，顏色為淺黃褐色；模型組斑馬魚(yú)肝臟外觀呈褐色，外觀粗糙。醋制前后蓬莪術(shù)水煎液治療可緩解上述病理特征。視覺(jué)觀察結(jié)果顯示，醋制前后蓬莪術(shù)水煎液各給藥組之間沒(méi)有顯著的差異。

3.2 斑馬魚(yú)肝組織HE染色結(jié)果

如圖2所示，對(duì)照組斑馬魚(yú)整體結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，肝臟肝細(xì)胞核清晰，胞質(zhì)較豐富，排列較規(guī)則。模型組斑馬魚(yú)肝臟出現(xiàn)少量的空泡變性，細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)大小不一的圓形空泡，大量肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松。與模型組比較，醋制前后蓬莪術(shù)水煎液治療后上述病理?yè)p傷均明顯減輕。說(shuō)明醋制前后蓬莪術(shù)水煎液對(duì)TAA導(dǎo)致的肝組織細(xì)胞形態(tài)損傷具有保護(hù)作用。

圖1 斑馬魚(yú)肝臟表型圖 (×100)

3.3 蓬莪術(shù)醋制前后對(duì)TAA誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)中ALT、AST活性及GSH、MDA水平的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚(yú)幼魚(yú)中ALT、AST活性及GSH水平顯著降低（＜0.001），MDA水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，醋制前后蓬莪術(shù)水煎液組ALT、AST活性及GSH水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），MDA水平顯著降低（＜0.001）。其中，與等劑量蓬莪術(shù)水煎液組相比，醋蓬莪術(shù)水煎液高劑量組ALT活性顯著降低（＜0.001），醋蓬莪術(shù)水煎液各劑量組AST活性顯著降低（＜0.001），醋蓬莪術(shù)水煎液高、中劑量組GSH水平顯著升高（＜0.01、0.001），醋蓬莪術(shù)水煎液中、低劑量組MDA水平顯著降低（＜0.01、0.001）。表明蓬莪術(shù)醋制后能更好地通過(guò)緩解氧化應(yīng)激達(dá)到改善TAA誘導(dǎo)肝損傷的目的。

圖2 斑馬魚(yú)肝組織HE染色結(jié)果(×400)

3.4 蓬莪術(shù)醋制前后對(duì)TAA誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)中Nrf2、IL-10、Smad3、Smad7mRNA表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚(yú)幼魚(yú)中、、mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.001），mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，醋制前后蓬莪術(shù)水煎液高、中劑量組、mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），蓬莪術(shù)水煎液高、中劑量組和醋蓬莪術(shù)水煎液高劑量組mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），醋蓬莪術(shù)水煎液高劑量組mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.001）。其中，與等劑量蓬莪術(shù)組相比，醋蓬莪術(shù)水煎液高劑量組顯著抑制、的mRNA表達(dá)（＜0.05、0.001），且醋蓬莪術(shù)水煎液具有促進(jìn)和mRNA表達(dá)的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異。

陽(yáng)性-異甘草酸鎂；與對(duì)照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與蓬莪術(shù)相同劑量組比較：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01 ▲▲▲P＜0.001，下圖同。

3.5 蓬莪術(shù)醋制前后對(duì)TAA誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)中Nrf2、Smad3、TGF-β蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚(yú)幼魚(yú)中Smad3和TGF-β蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001），Nrf2蛋白水平顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，蓬莪術(shù)水煎液高、中劑量組和醋蓬莪術(shù)水煎液各劑量組Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001），蓬莪術(shù)水煎液高劑量組和醋蓬莪術(shù)水煎液各劑量組Smad3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），蓬莪術(shù)水煎液高劑量組和醋蓬莪術(shù)水煎液高、中劑量組TGF-β蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。其中，與等劑量蓬莪術(shù)水煎液組相比，醋蓬莪術(shù)各劑量組Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001），且醋蓬莪術(shù)具有抑制Smad3和TGF-β蛋白表達(dá)的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異。結(jié)果表明，醋制前后蓬莪術(shù)水煎液可通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/ HO-1信號(hào)通路和TGF-β/Smad3信號(hào)通路對(duì)TAA誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)急性肝損傷發(fā)揮潛在的保護(hù)作用。

圖4 蓬莪術(shù)醋制前后對(duì)TAA誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)中Nrf2、IL-10、Smad3、Smad7mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

圖5 蓬莪術(shù)醋制前后對(duì)TAA誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)中Nrf2、Smad3、TGF-β蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

斑馬魚(yú)作為一種新興模式生物，具有多種獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在藥理學(xué)和毒理學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。斑馬魚(yú)具有發(fā)育周期短、繁殖能力強(qiáng)、高通量化和快速篩選等特點(diǎn)，遺傳學(xué)分析表明斑馬魚(yú)的基因組與人類(lèi)超過(guò)87%的同源性，其基因信號(hào)傳導(dǎo)通路和代謝通路也與人類(lèi)高度保守性[10]。此外，斑馬魚(yú)肝臟有許多和哺乳動(dòng)物類(lèi)似的反應(yīng)，如對(duì)外源化學(xué)物質(zhì)的防御機(jī)制相當(dāng)，以及脂類(lèi)和糖原儲(chǔ)存。斑馬魚(yú)幼魚(yú)通體透明，可以直接活體觀察其器官的發(fā)育和功能。因此相對(duì)于其他模式動(dòng)物，斑馬魚(yú)在建立肝損傷模型方面具備較為顯著的優(yōu)勢(shì)[9]。周楚瑩等[11]采用二乙基亞硝胺構(gòu)建斑馬魚(yú)藥物性肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)牛大力水提物對(duì)藥物性肝纖維化損傷的保護(hù)作用是通過(guò)抑制肝細(xì)胞凋亡、減少膠原纖維沉積實(shí)現(xiàn)的。崔佳琦等[12]通過(guò)構(gòu)建斑馬魚(yú)興奮期醉酒模型、醉酒模型及酒精性肝損傷模型，結(jié)果表明各劑量茯苓-葛根-枳椇子混合藥粉均有不同程度的預(yù)防醉酒作用、解酒作用及肝損傷保護(hù)作用。孟瑞媛等[10]通過(guò)構(gòu)建黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)肝損傷模型，結(jié)果表明姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)與脂肪合成、抗氧化和能量代謝相關(guān)的通路，起到了修復(fù)肝損傷的作用。課題組前期采用flk1-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)研究姜黃抗血管生成的作用[13]。因此，本研究采用了新型模式斑馬魚(yú)探究蓬莪術(shù)醋制前后對(duì)肝損傷的緩解作用。

ALT和AST是反映肝損傷的標(biāo)志性酶，ALT主要位于肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，AST在肝細(xì)胞線粒體中含量最高，常用于肝臟疾病的診斷[14]。本研究中，TAA誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝損傷后，模型組ALT和AST活性均顯著低于對(duì)照組。在TAA引起肝損傷后，肝細(xì)胞合成ALT和AST的能力降低[15]。從整個(gè)動(dòng)物模型的角度來(lái)看，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的ALT和AST活性也降低了，因此組織勻漿中ALT和AST的總活性可能會(huì)降低。GSH是平衡氧化與抗氧化中重要的抗氧化酶，可以清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，反映機(jī)體抗氧化能力；MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，可以提示機(jī)體內(nèi)過(guò)量產(chǎn)生活性氧的程度[16]。本研究中，醋制前后的蓬莪術(shù)治療后，GSH水平均不同程度的升高，MDA水平均不同程度的降低，呈劑量相關(guān)性。表明抑制氧化應(yīng)激可能是醋制前后蓬莪術(shù)改善斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝損傷的途徑之一。

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在介導(dǎo)急性肝損傷的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有至關(guān)重要的作用，抑制氧化應(yīng)激和炎癥被認(rèn)為是治療肝損傷的重要策略[17]。Nrf2是一種內(nèi)源性調(diào)控因子，被活性氧和抗氧化劑等多種元素激活后進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（antioxident response element，ARE）結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)多種抗氧化酶的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化功能。HO-1是Nrf2信號(hào)的下游靶基因，能夠通過(guò)降解亞鐵血紅素生成一氧化氮等產(chǎn)物參與氧化應(yīng)激損傷等病理生理過(guò)程，Nrf2/HO-1通路對(duì)機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激損傷具有積極的正向作用[18]。qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組mRNA和蛋白表達(dá)量減少可能是由于在TAA誘導(dǎo)氧化損傷情況下，肝細(xì)胞需要持續(xù)地合成足夠的Nrf2去應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，而肝臟的損傷使Nrf2合成不足，從而出現(xiàn)了mRNA和蛋白表達(dá)量減少的情況。與模型組比較，醋制前后蓬莪術(shù)水煎液組mRNA和蛋白表達(dá)量升高，表明醋制前后蓬莪術(shù)水煎液組可能通過(guò)促進(jìn)Nrf2的合成來(lái)提高其基礎(chǔ)水平，從而減輕TAA誘導(dǎo)的肝臟損傷，并逐漸降低機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，使其恢復(fù)正常。

TGF-β具有特定的自分泌和旁分泌作用，能介導(dǎo)白細(xì)胞群體內(nèi)炎癥細(xì)胞的活化、遷移和增殖的調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)組織炎癥和修復(fù)的重要細(xì)胞因子[19]。Smad3是一種膜受體激活的Smad，參與TGF-β/活化素信號(hào)途徑。許多研究已經(jīng)證實(shí)，TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)途徑是TGF-β發(fā)揮生物學(xué)作用的主要機(jī)制。TGF-β的異常表達(dá)不僅促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移，而且與病毒性肝炎、肝功能衰竭以及其他慢性肝病等多種肝臟疾病相關(guān)[20]。qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，與模型組比較，醋制前后蓬莪術(shù)水煎液能顯著下調(diào)mRNA表達(dá)水平，降低Smad3和TGF-β的蛋白表達(dá)量，提示醋制前后蓬莪術(shù)水煎液可抑制TGF-β表達(dá)，降低激活的Smad的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞內(nèi)TGF-β/Smads信號(hào)通路，從而發(fā)揮對(duì)ALI的保護(hù)作用。

課題組前期采用質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)蓬莪術(shù)醋制前后的主要差異成分是沒(méi)食子酸、阿魏酸、莪術(shù)醇、常春藤素[21]。研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸對(duì)于肝臟損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)抗氧化損傷能力、降低炎癥因子水平有關(guān)[22]。阿魏酸糖酯能夠激活Nrf2抗氧化信號(hào)通路，促進(jìn)Nrf2/Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）-ARE抗氧化信號(hào)通路下游相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)，從而有效保護(hù)大鼠免受AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷[23]。莪術(shù)醇可以下調(diào)TGF-β1和Smad2/3蛋白和基因的表達(dá)，從而阻止TGF-β1/Smad信號(hào)通路的活動(dòng)達(dá)到抗肝纖維化的作用[24]。常春藤素對(duì)肝臟損傷有顯著的抑制效果，還能減少肝臟氧化應(yīng)激，同時(shí)對(duì)小鼠的體質(zhì)量也有明顯的抑制作用[25]。這些差異性的成分可能是蓬莪術(shù)醋制前后藥效變化的物質(zhì)基礎(chǔ)，將進(jìn)一步研究這些單體成分對(duì)斑馬魚(yú)肝損傷的保護(hù)作用。

本研究基于Nrf2/HO-1信號(hào)通路和TGF-β/ Smad3信號(hào)通路探究醋制前后蓬莪術(shù)水煎液對(duì)TAA誘導(dǎo)ALI斑馬魚(yú)的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果表明，醋制前后蓬莪術(shù)水煎液均可改善TAA誘導(dǎo)的ALI斑馬魚(yú)幼魚(yú)的一般生理狀態(tài)及肝臟損傷程度，調(diào)控Nrf2/HO-1信號(hào)通路和TGF-β/Smad3信號(hào)通路，改善肝臟氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)與蓬莪術(shù)相比，醋蓬莪術(shù)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad3信號(hào)通路水平更具有降低的趨勢(shì)，說(shuō)明蓬莪術(shù)醋制后抗炎的效果更好。本研究初步闡明蓬莪術(shù)“醋制入肝”的炮制機(jī)制，為蓬莪術(shù)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為蓬莪術(shù)防治ALI提供了理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of raw and vinegar-processedon improving acute liver injury in zebrafish

LIN Liting1, WANG Jisen2, GAO Tianhui1, ZHU Zongping1, LUO Yirong1, QING Ying1, GUO Tingjun1, CHEN Yuanhui1, LIAO Wan1

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Key Laboratory of Quality Monitoring and Evaluation of Chinese Medicinal Materials, National Medical Products Administration, Chengdu Institute for Drug Control, Chengdu 610045, China

To investigate the mechanism of raw and vinegar-processedon improving thioacetamide (TAA)-induced acute liver injury in zebrafish based on nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)/heme oxygenase-1 (HO-1) and transforming growth factor-β (TGF-β)/Smad3 signaling pathway.The raw and vinegar-processedwere studied and the TAA-induced acute liver injury model of zebrafish was established. High-, medium- and low-doses (8, 4, 2 mg/mL) of raw and vinegar-processedwater decoctionwere set. Magnesium isoglycyrrhizinate was used as positive control group, and zebrafish culture water was used as normal control group. The liver morphology of zebrafish larvae was observed 72 h after administration, and the pathological changes of liver tissue were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. Alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) activities and glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA) levels in zebrafish larvae were detected by kit; qRT-PCR was used to detect, interleukin-10 (),andgene expressions in zebrafish larvae; Western blotting was used to determine the expressions of Nrf2/HO-1 and TGF-β/Smad3 signaling pathway related proteins in zebrafish larvae.Raw and vinegar-processedwater decoction had protective effect on the morphological injury of liver cells caused by TAA. Biochemical results showed that compared with model group, ALT, AST activities and GSH level in raw and vinegar-processedwater decoction group were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), MDA level was significantly decreased (< 0.001). The results of qRT-PCR showed that compared with model group, the mRNA expression levels of,andin raw and vinegar-processedgroup water decoction were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), while the mRNA expression levels ofin vinegar-processedgroup were significantly decreased (< 0.001). Compared with the same dose ofgroup, vinegar-processedhigh-dose group significantly inhibited the mRNA expression ofand(< 0.05, 0.001), and the vinegar-processedshowed a tendency to promoteandmRNA expression, but there was no significant difference. Western blotting results showed that compared with model group, the expression level of Nrf2 protein in the high-dose and medium-dose groups ofand the dosage groups of vinegar-processedwere significantly increased (< 0.001). The expression level of Smad3 protein in high-doseand the dosage groups of vinegar-processedwas significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001). The expression level of TGF-β protein in high-doseand high-, medium-dose groups of vinegar-processedwas significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001). Among them, the Nrf2 protein level of the dosage groups of vinegar-processedwas significantly higher than that of the same dose ofgroup (< 0.001), and vinegar-processedshowed a tendency to inhibit the expression of Smad3 and TGF-β, but there was no significant difference.The raw and vinegar-processedcan improve TAA-induced acute liver injury to varying degrees, and the mechanism of action may be related to the regulation of Nrf2/HO-1 and TGF-β/Smad3 signaling pathways.

Val.;acute liver injury; nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/ heme oxygenase-1 pathway; transforming growth factor-β/Smad3 signaling pathway;curcumin; furanodiene

R285.5

A

0253 - 2670(2024)08 - 2611 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.012

2023-11-26

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82274099）；四川省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（24NSFSC1101）；成都市科技局國(guó)合項(xiàng)目（2022-GH02-00033-HZ）

林麗婷，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿┬录夹g(shù)、新劑型和炮制研究。Tel: 15928086785 E-mail: 1069590640@qq.com

王繼森，男，副主任中藥師，碩士，從事藥品檢驗(yàn)研究工作。E-mail: 93230623@qq.com

通信作者：廖 婉，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制工藝與機(jī)制、中藥藥劑研究。E-mail: liaowan@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]