廖嘉穗，付 娟，張日美，柳芊如，胡軍華，王振中，肖 偉, 3*

基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)及多成分定量測(cè)定的腰痹通膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

廖嘉穗1, 2，付 娟2, 3，張日美1, 2，柳芊如2, 3，胡軍華2, 3，王振中2, 3，肖 偉1, 2, 3*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000 2. 中藥制藥過程控制與智能制造技術(shù)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001 3. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

建立腰痹通膠囊（Yaobitong Capsules，YC）的HPLC指紋圖譜及多成分定量測(cè)定方法，并結(jié)合相關(guān)化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)多批次制劑的質(zhì)量。建立YC的指紋圖譜，采用層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）評(píng)價(jià)多批次制劑質(zhì)量，同時(shí)采用Hotelling’s2和DMod方法對(duì)不同批次制劑的質(zhì)量設(shè)定控制范圍；HPLC法測(cè)定多批次YC中綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸4種有效成分的含量，并結(jié)合聚類熱圖分析進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。YC指紋圖譜方法學(xué)考察結(jié)果符合測(cè)定要求，標(biāo)記17個(gè)共有峰，并對(duì)共有峰進(jìn)行歸屬，通過對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)出8個(gè)色譜峰，14批樣品相似度大于0.90；HCA和PCA中未見異常批次，表明批間一致性較好，Hotelling’s2和DMod控制上限為15.077和1.653；14批YC樣品中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、綠原酸、阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.733～2.853、4.674～8.127、1.128～2.417、0.586～1.232 mg/g，線性關(guān)系良好（≥0.999 3）；聚類熱圖分析結(jié)果表明，14批樣品可聚為3類。建立的HPLC指紋圖譜方法和多成分含量測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，可用于YC的質(zhì)量評(píng)價(jià)。多批次制劑數(shù)據(jù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)方法，表明YC多批次制劑之間一致性較好。

腰痹通膠囊；HPLC；指紋圖譜；化學(xué)計(jì)量學(xué)；質(zhì)量評(píng)價(jià)；層次聚類分析；主成分分析；綠原酸；芍藥內(nèi)酯苷；芍藥苷；阿魏酸；聚類熱圖分析

腰痹通膠囊（Yaobitong Capsules，YC）由三七、川芎、白芍、延胡索、獨(dú)活、狗脊、熟大黃、牛膝組成，活血化瘀、祛風(fēng)除濕、行氣止痛[1]，是一種臨床中常用于治療腰椎間盤突出癥的中成藥，療效良好[2-5]。YC組方藥味多，成分復(fù)雜，主要含有三萜皂苷、單萜苷、苯酞、香豆素、生物堿、有機(jī)酸等多種化學(xué)成分[6-8]，多個(gè)體內(nèi)外代謝研究表明[6,9-11]，YC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能來(lái)自多個(gè)藥味中的多種活性成分。而YC現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及現(xiàn)有研究?jī)H對(duì)膠囊中個(gè)別成分的含量進(jìn)行測(cè)定[12-15]，缺少對(duì)YC整體質(zhì)量的有效評(píng)價(jià)方法，有必要探索一種控制YC整體質(zhì)量的研究方法。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展，“安全、穩(wěn)定、可控”作為中藥可持續(xù)發(fā)展和國(guó)際化的關(guān)鍵要求[16]，建立中藥復(fù)方制劑整體質(zhì)量控制方法是大勢(shì)所趨。中藥指紋圖譜具有信息量大，特征性強(qiáng)，整體性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠直觀地展現(xiàn)制劑中各藥味的化學(xué)組成與分布，對(duì)全面控制質(zhì)量和深入藥效研究提供了重要依據(jù)[17-18]。化學(xué)計(jì)量學(xué)利用數(shù)學(xué)方法或統(tǒng)計(jì)方法處理化學(xué)體系中的定性或定量數(shù)據(jù)，成為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中不可缺少的判斷工具。統(tǒng)計(jì)方法主要包括層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法（partial least squares method，PLS）等，通過分析大量數(shù)據(jù)、挖掘其內(nèi)在關(guān)聯(lián)，已廣泛應(yīng)用于中藥指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，客觀反映中藥制劑的整體質(zhì)量，確保其內(nèi)在的質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性[19-23]。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)YC化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上[7-8]，首先采用高效液相指紋圖譜技術(shù)對(duì)14批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步結(jié)合無(wú)監(jiān)督的HCA、PCA等相關(guān)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析不同批次的YC產(chǎn)品質(zhì)量，在此基礎(chǔ)上設(shè)定了Hotelling’s2和DMod2種統(tǒng)計(jì)量的控制限和警戒限。然后，通過高效液相色譜技術(shù)測(cè)定其中4種有效成分的含量，采用聚類熱圖分析方法直觀觀察其變化情況，為4種成分的含量設(shè)定合適的質(zhì)量控制范圍。本研究建立了較全面的YC質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為該品種后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制與提升提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity H class高效液相色譜儀、Waters Arc HPLC高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Milli-Q型超純水制備儀，美國(guó)Millipore公司；KB-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Mettler Toledo XP6型百萬(wàn)分之一電子分析天平、Mettler Toledo XSR105型十萬(wàn)分之一電子分析天平、Mettler Toledo AL204型萬(wàn)分之一電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；TG16MW型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 材料

乙腈，色譜純，批號(hào)023636，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；甲醇（批號(hào)230330892D）、磷酸（批號(hào)200818593E），分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；超純水，由Milli-Q型超純水制備儀自制。

對(duì)照品三七皂苷R1（批號(hào)110745-201921，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.4%）、人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-202235，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）、蛇床子素（批號(hào)110822-202111，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、藁本內(nèi)酯（批號(hào)111737-201910，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、芍藥苷（批號(hào)110736-202246，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.7%）、人參皂苷Rd（批號(hào)111818-202104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.3%）、綠原酸（批號(hào)110753-202119，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%）、阿魏酸（批號(hào)110773-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)wkq22021403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%），購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司。

YC樣品共14批，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，具體信息見表1。實(shí)驗(yàn)所用藥材及飲片購(gòu)自中藥材市場(chǎng)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室中藥資源與栽培技術(shù)中心主任谷巍教授鑒定，三七（批號(hào)Y2208001）為五加科人參屬植物三七(Burk.) F. H. Chen的干燥根和根莖、川芎（批號(hào)Y2212201）為傘形科藁本屬植物川芎Hort.的干燥根莖、獨(dú)活（批號(hào)Y2302165）為傘形科獨(dú)活屬植物獨(dú)活Maxim. f.Shan et Yuan的干燥根、延胡索（批號(hào)Y2302020）為罌粟科紫堇屬植物延胡索W. T. Wang的干燥塊莖、白芍（批號(hào)Y2302001）為毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根、狗脊（批號(hào)Y2302121）為蚌殼蕨科金毛狗屬樹形蕨類植物金毛狗脊(L.) J. Sm.的干燥根莖、牛膝（批號(hào)Y2209147）為莧科牛膝屬植物牛膝Bl.的干燥根、熟大黃（批號(hào)YP2306037）為蓼科大黃屬植物掌葉大黃L.的干燥根和根莖的炮制品，各藥材和飲片均符合《中國(guó)藥典》2020年版相關(guān)規(guī)定。

表1 14批YC樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、藁本內(nèi)酯、蛇床子素對(duì)照品適量，加50%甲醇溶液制得質(zhì)量濃度分別為26.10、48.41、122.91、109.66、381.39、101.48、25.25、38.48 μg/mL混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取YC內(nèi)容物，研成細(xì)粉，精密稱定0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲40 min，放冷至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，于12 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 單味藥材樣品溶液的制備 取各味藥材細(xì)粉，其余操作同“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備。

2.1.4 色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～13 min，12%～20%乙腈；13～33 min，20%～23%乙腈；33～43 min，23%～30%乙腈；43～53 min，30%乙腈；53～83 min，30%～60%乙腈；83～93 min，60%～90%乙腈；93～100 min，90%乙腈；100～105 min，90%～12%乙腈；105～115 min，12%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.5 精密度考察 取同一份供試品溶液（S7），按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，以人參皂苷Rg1峰為參照峰，測(cè)得17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.033%～0.120%，相對(duì)峰面積的RSD為0.125%～2.524%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液（S7），按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件下分別于室溫下放置0、2、6、16、20、24、30 h后進(jìn)樣測(cè)定，以人參皂苷Rg1色譜峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.068%～0.270%，相對(duì)峰面積的RSD為0.706%～3.823%，表明供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性考察 取同一批樣品（S7），按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以人參皂苷Rg1為參照峰，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.062%～0.336%，相對(duì)峰面積的RSD為0.384%～2.554%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 建立指紋圖譜及相似度評(píng)價(jià) 將14批供試品溶液（S1～S14），按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖并導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）》軟件中，以S7為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度0.1 s，設(shè)置中位數(shù)法，目標(biāo)峰匹配，生成對(duì)照指紋圖譜（R），14批YC樣品指紋圖譜疊加圖及其對(duì)照指紋圖譜見圖1。以相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算，得到14批樣品（S1～S14）與R的相似度結(jié)果分別為0.965、0.982、0.982、0.981、0.978、0.965、0.973、0.984、0.981、0.986、0.970、0.991、0.982、0.986，相似度均較高，表明YC各批次間制備工藝較穩(wěn)定，質(zhì)量一致性較好。

對(duì)14批樣品指紋圖譜進(jìn)行色譜峰歸屬，標(biāo)定17個(gè)共有峰（圖2），1號(hào)峰來(lái)自川芎和獨(dú)活，2、3號(hào)峰來(lái)自白芍，4、7～9、11、15、16號(hào)峰來(lái)自獨(dú)活，5、6、10號(hào)峰來(lái)自三七，12～14號(hào)峰來(lái)自川芎，17號(hào)峰來(lái)源于三七、獨(dú)活、川芎、牛膝、熟大黃等多味藥材。其中，6號(hào)峰在圖譜中峰形與分離度良好，且保留時(shí)間與峰面積較穩(wěn)定，故將其選擇為參照峰（S）。取供試品溶液（S7）和混合對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣比對(duì)，1號(hào)峰為綠原酸，2號(hào)峰為芍藥內(nèi)酯苷，3號(hào)峰為芍藥苷，5號(hào)峰為三七皂苷R1，6號(hào)峰為人參皂苷Rg1，10號(hào)峰為人參皂苷Rd，14號(hào)峰為藁本內(nèi)酯，15號(hào)峰為蛇床子素，色譜圖見圖3。

圖1 14批YC樣品的HPLC指紋圖譜(A) 和對(duì)照指紋圖譜(R)

圖2 YC和處方各藥味的HPLC圖

1-綠原酸；2-芍藥內(nèi)酯苷；3-芍藥苷；5-三七皂苷R1；6-人參皂苷Rg1；10-人參皂苷Rd；14-藁本內(nèi)酯；15-蛇床子素。

2.2 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.2.1 HCA HCA是一種可使復(fù)雜的多維數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法，通過使用適當(dāng)?shù)亩攘亢瓦B接準(zhǔn)則，計(jì)算相異度，實(shí)現(xiàn)對(duì)象的歸類[24]。運(yùn)用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 26.0，選擇組間連接法，以歐氏距離為測(cè)度，以14批YC樣品的17個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為變量進(jìn)行HCA，結(jié)果如圖4所示。由圖可知，14批YC樣品整體可分為2類，S1～S4、S6、S7、S11～S14聚為第1類，S5、S8～S10聚為第2類。

圖4 14批YC樣品的HCA結(jié)果

2.2.2 PCA PCA是一種應(yīng)用廣泛的數(shù)據(jù)降維處理方法，能將多個(gè)相關(guān)變量通過矩陣變換成幾個(gè)不相干的綜合指標(biāo)來(lái)反映數(shù)據(jù)的主要特征，提取結(jié)果準(zhǔn)確，可解釋性強(qiáng)[25]。以6號(hào)峰人參皂苷Rg1為參照峰，將14批YC樣品的17個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中進(jìn)行PCA。PCA特征值與方差貢獻(xiàn)率見表2，主成分1、2的特征值均大于1，兩者累積貢獻(xiàn)率達(dá)96%，可反映指紋圖譜的共有峰信息。PCA得分圖將14批YC樣品分為2類（圖5），與HCA結(jié)果基本一致，其中2為0.915（＞0.5），表明模型預(yù)測(cè)能力良好。由圖6可知，3、8、9、12、14～16號(hào)峰距離載荷圖原點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，表示對(duì)樣品整體質(zhì)量起主要作用。

2.2.3 Hotelliing’s2和DMod控制限的建立 Hotelliing’s2和DMod控制圖用于監(jiān)控不同批次的產(chǎn)品一致性，是2個(gè)互補(bǔ)的多變量分析手段。Hotelling’s2表示的是每個(gè)選定觀察點(diǎn)與模型平面中原點(diǎn)的距離，為模型的內(nèi)部變化度量，代表樣品中信息與主成分模型中其他樣品差異；DMod表示數(shù)據(jù)在變量空間到主成分模型的距離，為模型外部的數(shù)據(jù)變化度量，代表樣品中未被模型解釋的變化。通常認(rèn)為在控制限度以下的產(chǎn)品為正常批次產(chǎn)品，超出控制限的為異常批次樣品。Hotelling’s2和DMod統(tǒng)計(jì)量作為批間差異性評(píng)價(jià)指標(biāo)，兩者具有不同的監(jiān)控作用，互為補(bǔ)充，當(dāng)發(fā)現(xiàn)某個(gè)超出或控制限的異常批次時(shí)，在貢獻(xiàn)圖上可以分析批次過程的異常波動(dòng)受哪些變量的影響[26]。Hotelliing’s2和DMod控制圖見圖7、8，圖中2Crit（99%）和Crit（0.05）為控制限，其上限分別為15.077和1.653；2Crit（95%）為警戒限，上限為8.418?？刂茍D顯示，14批YC樣品均在Hotelliing’s2和DMod的控制限內(nèi)，為正常批次產(chǎn)品，表明批間一致性良好，所建立的PCA模型能較好地表征樣品的正常波動(dòng)。

表2 主成分特征值與方差貢獻(xiàn)率

圖5 14批YC樣品的PCA得分圖

1～5、7～17為峰號(hào)。

圖7 14批YC樣品的Hotelliing’s T2控制圖

圖8 14批YC樣品DModX控制圖

2.3 多成分含量測(cè)定

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、綠原酸、阿魏酸對(duì)照品適量，置于同一25 mL棕色量瓶中，用50%甲醇溶解，搖勻，制成含芍藥內(nèi)酯苷196.27 μg/mL、芍藥苷401.46 μg/mL、綠原酸127.46 μg/mL、阿魏酸93.08 μg/mL的混合對(duì)照品母液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取YC內(nèi)容物，研成細(xì)粉，精密稱定0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲40 min，放冷至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，于12 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。按YC制備工藝分別制備缺白芍、缺川芎、缺獨(dú)活、缺川芎和獨(dú)活的陰性樣品，再按前述供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為Angilent 5TC-C18(2)柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，12%乙腈；15～35 min，12%～20%乙腈；35～45 min，20%～90%乙腈；45～50 min，90%乙腈；50～51 min，90%～12%乙腈；51～60 min，12%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230、330 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.4 系統(tǒng)適用性及專屬性考察 分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液及空白溶劑，在“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖（圖9）。結(jié)果表明，供試品溶液中各色譜峰分離度良好（分離度＞1.5），陰性樣品溶液及空白溶劑對(duì)YC中4種成分測(cè)定無(wú)干擾，方法專屬性良好。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，用50%甲醇稀釋至10 mL，配制成6種不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)（），以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為芍藥內(nèi)酯苷＝10 327－6 563，＝0.999 7，線性范圍1.96～196.27 μg/mL；芍藥苷＝15 273－77 045，＝0.999 3，線性范圍4.01～401.46 μg/mL；綠原酸＝31 829－10 841，＝0.999 7，線性范圍1.27～127.46 μg/mL；阿魏酸＝51 537－12 483，＝0.999 7，線性范圍0.93～93.08 μg/mL；結(jié)果表明4種成分在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1-綠原酸；2-芍藥內(nèi)酯苷；3-芍藥苷；4-阿魏酸。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取“2.5.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，分別計(jì)算芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、綠原酸、阿魏酸4種成分的峰面積RSD值，結(jié)果依次為0.37%、1.14%、0.23%、0.32%，均在2%內(nèi)，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取YC樣品（S7），按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備同一份供試品溶液，分別于室溫下0、3、6、9、16、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、綠原酸、阿魏酸4個(gè)定量成分的峰面積RSD，結(jié)果依次為1.26%、1.35%、1.39%、2.06%，峰面積的RSD均＜3%，表明24 h內(nèi)供試品溶液在室溫條件下穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批YC樣品（S7），按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6份，進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算YC中所含芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、綠原酸、阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其RSD值，結(jié)果測(cè)得上述成分含量的RSD分別為0.80%、0.71%、0.79%、1.44%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 將9份已知待測(cè)成分含量的樣品（S7）分為低、中、高3組，每份0.25 g，精密稱定，3種水平組分別加入混合對(duì)照品溶液（含芍藥內(nèi)酯苷17.127 μg/mL、芍藥苷44.059 μg/mL、綠原酸13.304 μg/mL、阿魏酸6.569 μg/mL）0.5、1.0、1.5 mL，再按“2.3.2”項(xiàng)下供試品制備方法制得加樣供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率，得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、綠原酸、阿魏酸的平均加樣回收率分別為103.53%、100.35%、105.11%、105.25%，RSD分別為1.77%、1.93%、1.71%、1.49%，表明該方法加樣回收率良好。

2.3.10 樣品含量測(cè)定及評(píng)價(jià) 取14批YC樣品（S1～S14）制備供試品溶液，按照“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件精密吸取10 μL進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算樣品中各成分的含量。14批YC樣品中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、綠原酸、阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.733～2.853 mg/g、4.674～8.127 mg/g、1.128～2.417 mg/g、0.586～1.232 mg/g，提示不同批次產(chǎn)品中各成分的含量有所差異。為更直觀體現(xiàn)多批次樣品間定量成分含量的差異，將14批YC樣品含量測(cè)定數(shù)據(jù)導(dǎo)入科研繪圖平臺(tái)Hiplot（https://hiplot.com.cn/），選擇ward法，以歐氏距離為量度，繪制含量聚類熱圖。14批樣品可聚為3類，S1～S4、S6和S11聚為一類，這6批樣品中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷含量相對(duì)較高，綠原酸、阿魏酸含量相對(duì)較低；S5、S8～S10聚為一類，這4批樣品中阿魏酸含量相對(duì)較高；S7和S12～14聚為一類，S12～S14這3批樣品中綠原酸含量相對(duì)較高，其他成分含量相對(duì)較低，結(jié)果見圖10。批次間成分含量的差異是由于原料藥材的批次不同引起。

3 討論

3.1 指紋圖譜及化學(xué)模式識(shí)別分析

本實(shí)驗(yàn)建立了YC樣品的HPLC指紋圖譜，14批YC樣品確定了17個(gè)共有峰，指認(rèn)了8個(gè)成分，14批YC樣品的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度≥0.90，表明各批樣品一致性良好。指紋圖譜實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)供試品制備方法進(jìn)行考察，包括提取方式（超聲提取和加熱回流提?。?，提取溶劑（水、不同濃度的甲醇溶液和不同濃度的乙醇溶液）和提取時(shí)間（20、30、40、50 min），根據(jù)峰數(shù)、峰形、分離度等確定最優(yōu)條件為甲醇超聲40 min。指紋圖譜通過結(jié)合HCA、PCA等指化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析，14批YC樣品大致分為2類，可能是由于不同批次的生產(chǎn)時(shí)間差異或不同批次間的原料藥材不同造成。在PCA模型基礎(chǔ)上設(shè)定Hotelling’s2和DMod控制限，實(shí)現(xiàn)批次間質(zhì)量差異的監(jiān)控，提高了質(zhì)控效率。幾種化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法相互驗(yàn)證，多角度、多方位挖掘指紋圖譜中的信息，尋找出共性中的差異，探尋出內(nèi)在的聯(lián)系，有利于建立更加科學(xué)全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。為保證產(chǎn)品批間穩(wěn)定性、一致性，本課題組后續(xù)還將關(guān)注原料藥材及中間工藝過程的質(zhì)量控制方面。

圖10 14批YC樣品4個(gè)定量成分含量的聚類熱圖分析

3.2 含量測(cè)定及分析評(píng)價(jià)

本研究根據(jù)指紋圖譜共有峰指認(rèn)及歸屬情況，選擇YC中峰形良好的成分以及對(duì)指紋圖譜共有峰貢獻(xiàn)較大的藥味，將白芍中的芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷，川芎中的阿魏酸及川芎和獨(dú)活中共有的綠原酸成分作為為定量評(píng)價(jià)對(duì)象。白芍柔筋止痛，川芎活血止痛，獨(dú)活抗炎止痛。其中選取的芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷為白芍的特征性指標(biāo)成分，具有鎮(zhèn)痛抗炎的藥理作用[27-29]；多研究表明，阿魏酸通常在組方中發(fā)揮抗血栓、抗炎的藥理作用[30-31]，且阿魏酸為《中國(guó)藥典》藥材項(xiàng)下規(guī)定的指標(biāo)成分；綠原酸廣泛存在多種藥材中，因顯著的抗炎、抗氧化活性而廣為人知[32-34]，可通過影響如MAPK信號(hào)通路等抑制炎癥反應(yīng)。結(jié)合課題組前期的YC大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果，大鼠尿液中可檢測(cè)到阿魏酸硫酸酯化產(chǎn)物，膽汁代謝中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷為原型成分[35]，表明該方法定量成分選擇有一定合理性和可行性。含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)在供試品制備方法中對(duì)提取方式（超聲提取和加熱回流提?。?，提取溶劑（水、甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇）和提取時(shí)間（20、30、40、50 min）進(jìn)行單因素考察，根據(jù)峰形、分離度等選擇最優(yōu)條件為50%甲醇超聲40 min。聚類熱圖是一種在聚合大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，以一種漸進(jìn)的藍(lán)紅色帶直觀的將結(jié)果展現(xiàn)出來(lái)的分析圖，橫向?qū)悠肪垲?，聚?類，不同批次間YC存在含量差異，差異的原因可能與原料藥材的產(chǎn)地、采收年限和采收期的不同有關(guān)，但總體差異較小。為進(jìn)一步提高制劑質(zhì)量，建議對(duì)藥材的相關(guān)性指標(biāo)成分含量加強(qiáng)檢測(cè)。

綜上，YC現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制方法較為低下，本實(shí)驗(yàn)不同于單一指標(biāo)成分的質(zhì)量控制方法，采用高效液相色譜指紋圖譜定性及多成分定量的方法控制YC質(zhì)量，并緊密結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)多批次產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)分析，設(shè)定控制限和警戒限以更好監(jiān)測(cè)不同批次產(chǎn)品質(zhì)量。紋圖譜反映制劑整體特點(diǎn)，且多成分含量測(cè)定方法可準(zhǔn)確測(cè)定YC中主要成分含量，兩者結(jié)合有利于整體質(zhì)量控制。此外，中藥固體制劑的整體質(zhì)量控制研究并不止步于指紋圖譜研究和指標(biāo)成分含量測(cè)定，如溶出度也是質(zhì)量控制的關(guān)鍵屬性之一，其在一致性評(píng)價(jià)、生物等效性等方面逐漸應(yīng)用廣泛[36-37]。后續(xù)為全面提升YC整體質(zhì)量，課題組將開展更多相關(guān)研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation of Yaobitong Capsules based on HPLC fingerprint combined with chemometrics and multi-component content determination

LIAO Jiasui1, 2, FU Juan2, 3, ZHANG Rimei1, 2, LIU Qianru2, 3, HU Junhua2, 3, WANG Zhenzhong2, 3, XIAO Wei1, 2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China 2. National Key Laboratory on Technologies for Chinese Medicine Pharmaceutical Process Control and Intelligent Manufacture, Lianyungang 222001, China 3. Jangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China

To establish an HPLC fingerprint method and a method for the determination of multi-component content of Yaobitong Capsules (腰痹通膠囊, YC), and to evaluate the quality of multiple batches of the product by combining related chemometrics methods.Based on the fingerprinting of lumbar paralysis capsules, hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA) were used to evaluate the quality of multiple batches of samples, while Hotelling’s2and DModmethods were used to establish control ranges for the quality of different batches of products; The content of four active ingredients, namely chlorogenic acid, albiflorin, paeoniflorin and ferulic acid, in multiple batches of YC was determined by HPLC and the quality was evaluated by cluster heat map analysis.The results of fingerprint methodology of YC were in accordance with the requirements of the determination, 17 common peaks were labeled, and eight chromatographic peaks were identified by standard comparison, and the similarity of samples from 14 batches was more than 0.90. No abnormal batches were found in HCA and PCA, indicating good inter-batch consistency. The upper limits of Hotelling’s2and DModcontrol were 15.077 and 1.653, respectively. The contents of albiflorin, paeoniflorin, chlorogenic acid, and ferulic acid in 14 batches of YC samples ranged from 1.733 to 2.853 mg/g, 4.674 to 8.127 mg/g, 1.128 to 2.417 mg/g and 0.586 to 1.232 mg/g, respectively, with a good linearity (≥ 0.999 3). The results of cluster heat map analysis showed that 14 batches of samples could be clustered into three categories.The fingerprint method and the multi-component content determination method are accurate and reliable, which could be used for the quality evaluation of YC. The multi-batch product data combined with the chemometric method can be used for the stability control and quality evaluation of YC.

Yaobitong Capsules; HPLC; fingerprint; chemometrics; quality evaluation; hierarchical cluster analysis; principal component analysis; chlorogenic acid; albiflorin; paeoniflorin; ferulic acid; Cluster heatmap analysis

R283.6

A

0253 - 2670(2024)08 - 2579 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.009

2023-11-02

國(guó)家中醫(yī)藥管理局基于重點(diǎn)研究室研究領(lǐng)的中醫(yī)藥多學(xué)科研究能力提升項(xiàng)目——中藥提取精制新技術(shù)；連云港市揭榜掛帥項(xiàng)目——中藥口服固體制劑智能化連續(xù)制造關(guān)鍵技術(shù)研究

廖嘉穗，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail: 546023294@qq.com

通信作者：肖 偉，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幍难芯颗c開發(fā)。E-mail: kanionlunwen@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]