李 鎮(zhèn)，李 俊，安若凡，孫 偉，岳中寶，楊 維*，賀瑞坤*

基于標(biāo)準(zhǔn)提取物的歐洲越橘提取物質(zhì)量控制方法及藥效活性關(guān)聯(lián)研究

李 鎮(zhèn)1, 2，李 俊2，安若凡2，孫 偉2，岳中寶3，楊 維2*，賀瑞坤3*

1. 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000 2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 中藥鑒定與安全性評(píng)估北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100007 3. 湯臣倍健股份有限公司營(yíng)養(yǎng)健康研究院，廣東 廣州 510663

建立對(duì)照品非依賴性的20種花青素類成分定量分析方法，并利用該法對(duì)市售歐洲越橘提取物進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)篩選出代表性抗氧化活性成分。以歐洲越橘標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照提取物替代對(duì)照品，采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-QQQ-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)，建立一種針對(duì)20種花青素類成分的定量方法，并利用該法對(duì)10批市售歐洲越橘提取物中的花青素類成分含量進(jìn)行研究。采用DPPH自由基清除法和總抗氧化能力測(cè)試法評(píng)價(jià)不同歐洲越橘提取物的抗氧化能力。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，20種花青素類成分線性良好，為0.999 4～1.000 0，精密度RSD為0.05%～4.23%，穩(wěn)定性RSD為0.29%～3.38%，平均加樣回收率為98.1%～102.1%，RSD為0.50%～4.12%。樣品分析結(jié)果顯示，不同樣品中部分花青素類成分含量存在顯著差異，其中錦葵素變化最大，RSD為18.23%。歐洲越橘提取物具有較好的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力。其中矢車菊素與DPPH自由基率相關(guān)性為0.94，芍藥素-3--半乳糖苷與總抗氧化活性相關(guān)性為0.93。二者有望作為歐洲越橘提取物清除DPPH自由基活性和總抗氧化活性的潛在質(zhì)控成分?；赨PLC-QQQ-MS/MS所建立的對(duì)照品非依賴性的歐洲越橘提取物中20種花青素類成分定量分析方法，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，方法簡(jiǎn)單，適用于歐洲越橘提取物中20種花青素類成分的含量測(cè)定，為中藥對(duì)照提取物替代單體對(duì)照品在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐，為中藥材質(zhì)量控制研究提供新的研究思路。

歐洲越橘；對(duì)照提取物；UPLC-QQQ-MS/MS；抗氧化能力；質(zhì)量控制；花青素；矢車菊素-3--葡萄糖苷；芍藥素- 3--葡萄糖苷；飛燕草素3--半乳糖苷；錦葵素；矢車菊素；芍藥素-3--半乳糖苷

歐洲越橘L.是杜鵑花科（Ericaceae）的一種落葉灌木，原產(chǎn)于歐洲北部和中部的山區(qū)，也廣泛分布在意大利阿爾卑斯山和亞平寧山脈。越橘提取物含有豐富的花青素，具有緩解眼疲勞，保護(hù)肝臟、心腦血管，抗癌等作用，已被廣泛應(yīng)用于保健食品、藥品等領(lǐng)域[1-2]。

花青素是歐洲越橘提取物的主要活性成分，其中常見的花青素類成分多達(dá)20種[3]?；ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，這一特點(diǎn)為其提供了強(qiáng)大的抗氧化活性基礎(chǔ)。由于花青素性質(zhì)不穩(wěn)定，且部分單體成分的提取分離難度大，加之儲(chǔ)存、運(yùn)輸條件高，導(dǎo)致部分花青素對(duì)照品價(jià)格過高。越橘對(duì)照提取物是指經(jīng)過特定工藝制備得到的含有多種主要成分或指標(biāo)性成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具有易制備、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉等特點(diǎn)[3]。同時(shí)歐洲藥典（EP 10.0）中對(duì)越橘對(duì)照提取物的提取方法、性狀、所含花青素種類、含量、干燥失重、總灰分等指標(biāo)進(jìn)行了嚴(yán)格控制。因此，本研究擬以越橘對(duì)照提取物替代對(duì)照品，對(duì)市售越橘提取物進(jìn)行定量研究。

目前，花青素類成分常用的檢測(cè)方法有紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相-紫外分光光度法（HPLC-UV）等[4-5]。相較于以上方法，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、分離能力好等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。因此，本研究擬以歐洲越橘標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照提取物代替對(duì)照品，采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-QQQ-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)，建立一種針對(duì)20種花青素類成分的定量方法，并利用該法對(duì)10批市售歐洲越橘提取物中的花青素類成分含量進(jìn)行研究。對(duì)不同歐洲越橘提取物的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并篩選歐洲越橘提取物清除DPPH自由基活性和總抗氧化活性的潛在質(zhì)控成分。本研究有望為歐洲越橘花青素類成分的質(zhì)量控制提供新方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Spectra Max I3X型多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；Agilent G6470型三重四極桿質(zhì)譜儀、Agilent 1290型超高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫有限公司；臺(tái)式DK-3450 Mini型高速離心機(jī)，丹麥Labogene公司；Mettler Toledo ME155DU型十萬(wàn)分之一級(jí)電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；移液器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；舒美KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Blue Pard型恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 材料

10批市售歐洲越橘提取物分別購(gòu)自湯臣倍健股份有限公司（批號(hào)20S0303003，編號(hào)S1）、寧波綠之健藥業(yè)有限公司（批號(hào)20221202/10962、20230102/10962、20230202/10962，編號(hào)S2～S4）、楊凌萃健生物工程技術(shù)有限公司（批號(hào)20221203、20230402、20230701，編號(hào)S5～S7）、桂林萊茵生物科技股份有限公司（批號(hào)23021302，編號(hào)S8）和諾黛然股份有限公司（批號(hào)118190120、118181018，編號(hào)S9、S10）。標(biāo)準(zhǔn)越橘對(duì)照提取物，批號(hào)ZEP-Y0001788-C1A，購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司。

對(duì)照品矢車菊素-3--葡萄糖苷（C11，批號(hào)CFN92046）、芍藥素-3--葡萄糖苷（C14，批號(hào)CFN92046）和飛燕草素3--半乳糖苷（C15，批號(hào)CFN92037），Chem Faces?，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，均購(gòu)于武漢天植生物技術(shù)有限公司。

1,1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH），批號(hào)300267，購(gòu)自Sigma公司；水溶性維生素E（Trolox），批號(hào)C14735198，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（T-AOC），批號(hào)BC1315，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；甲醇、甲酸，質(zhì)譜級(jí)，均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；屈臣氏蒸餾水購(gòu)自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 液質(zhì)聯(lián)用條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相為0.5%甲酸水溶液（A）和含0.5%甲酸的98%乙腈水溶液（B）；洗脫梯度為0～10 min，5%～10% B；10～25 min，10%～25% B；25～30 min，25%～95% B；30～33 min，95%～5% B；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量3 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 使用電噴霧離子源（ESI源），正離子模式，鞘氣溫度250 ℃。鞘氣體積流量11 L/min，噴嘴電壓500 V，霧化器壓力310.28 kPa。毛細(xì)管電壓：正電壓4 000 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣體積流量5 L/min；各路氣體均為氮?dú)?。?shù)據(jù)采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。各定量成分的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 20種花青素類成分的質(zhì)譜信息

2.2 樣品制備

2.2.1 越橘提取物制備 精確稱取越橘提取物1 mg（精確至0.01 mg），加入1 mL 40%甲醇水溶液，超聲提取5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清，用40%甲醇水稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜，制成100 μg/mL的供試品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)越橘對(duì)照提取物制備 精確稱取越橘提取物1 mg（精確至0.01 mg），加入1 mL 40%甲醇水溶液（料液比1∶1），超聲提取5 min，12 000 r/min離心（離心半徑5 cm）5 min，取上清，制備成1 mg/mL的儲(chǔ)備液。用40%甲醇水稀釋將儲(chǔ)備溶液依次稀釋成500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.6 μg/mL的對(duì)照提取物溶液。

2.2.3 混合越橘提取物制備 取6種不同來(lái)源的越橘提取物，制成混合越橘提取物，按照“2.2.1”項(xiàng)下的方法制備混合越橘提取物溶液。

2.2.4 對(duì)照品溶液制備 精確稱取C11、C14和C15各1 mg，加入40%甲醇水溶液，制備成1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取3種對(duì)照品溶液，混合，用40%甲醇水稀釋將儲(chǔ)備溶液依次稀釋成含C11（8 μg/mL）、C14（8 μg/mL）和C15（8 μg/mL）的混合對(duì)照品溶液，依次稀釋得一系列混合對(duì)照品溶液，分別為4、2、1、0.5 μg/mL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”和“2.2.4”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)越橘對(duì)照提取物溶液和對(duì)照品溶液，按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行分析，記錄花青素的峰面積響應(yīng)值。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（），用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

基于標(biāo)準(zhǔn)越橘對(duì)照提取物的回歸方程分別為C1＝5.840 1－2.569，＝0.999 9；C2＝4.974 6＋49.224，＝0.999 8；C3＝1.873＋5.454，＝1.000 0；C4＝3.429－8.500，＝0.999 7；C5＝1.063 5＋0.528 7，＝0.999 7；C6＝9 303.8＋166 970.0，＝0.999 6；C7＝1 912.0＋23 430.0，＝0.999 6；C8＝7 578.2＋125 615.0，＝0.999 6；C9＝3 759.6＋64 990.0，＝0.999 7；C10＝ 11 182.0＋44 570.0，＝0.999 9；C11＝11 511.0＋121 451.0，＝0.999 7；C12＝4 490.3－ 5 913.0，＝0.999 7；C13＝2 691.1＋26 678.0，＝0.999 6；C14＝7 535.9＋266 948.0，＝0.999 5；C15＝9 450.3＋55 708.0，＝0.999 6；C16＝9 618.7＋49 714.0，＝0.999 6；C17＝5 108.5＋44 329.0，＝0.999 6；C18＝9 399.1＋103 213.0，＝0.999 5；C19＝3 767.7＋47 512.0，＝0.999 7；C20＝12 926.0＋76 915.0，＝0.999 7；C1～C20的線性范圍均為15.6～500.0 μg/mL。

基于對(duì)照品溶液的回歸方程分別為C11＝ 2 280 466.4＋82 554.0，＝0.999 8；C14＝ 1 374 443.9＋74 505.0，＝0.999 5；C15＝ 1 404 172.2＋52 319.0，＝0.999 5；C11、C14、C15的線性范圍均為0.5～8.0 μg/mL。

2.3.2 精密度考察 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)越橘對(duì)照提取物溶液，按照“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)的色譜條件和質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，詳細(xì)記錄20種花青素的峰面積響應(yīng)值，并計(jì)算各成分峰面積的RSD值。結(jié)果（表2）顯示20種花青素峰面積的RSD值在0.05%～4.23%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備混合越橘提取物溶液，并將其放置在4 ℃保存。分別于0、2、4、6、8、12、24 h，按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下的方法對(duì)20種成分進(jìn)行測(cè)定，詳細(xì)記錄各成分峰面積響應(yīng)值，計(jì)算RSD值，結(jié)果（表2）顯示RSD值為0.29%～3.38%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下的方法平行制備6份混合越橘提取物溶液，按照“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件對(duì)6份提取物溶液進(jìn)行檢測(cè)，獲取20種花青素的峰面積響應(yīng)值，并計(jì)算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值。結(jié)果（表2）顯示RSD值在1.02%～4.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 20種花青素類成分的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(對(duì)照提取物法)

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精確稱取“2.2.3”項(xiàng)下越橘提取物0.5 mg，分別加入越橘對(duì)照提取物約1.250、0.500、0.156 mg，加入1 mL 40%甲醇水溶液，超聲提取5 min，12 000 r/min離心（離心半徑5 cm）5 min，取上清，用40%甲醇水稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜。按照“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下的方法測(cè)定，記錄花青素峰面積，計(jì)算平均加樣回收率和RSD。結(jié)果（表2）顯示RSD均小于5.00%，表明該方法加樣回收率良好。

精密吸取3種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，混合，用40%甲醇水稀釋，配制成含C11（40 μg/mL）、C14（40 μg/mL）和C15（40 μg/mL）的混合對(duì)照品溶液（QC-高），用甲醇依次稀釋，制備成含C11（20 μg/mL）、C14（20 μg/mL）和C15（20 μg/mL）的中質(zhì)量濃度質(zhì)控溶液（QC-中），以及含C11（10 μg/mL）、C14（10 μg/mL）和C15（10 μg/mL）的低質(zhì)量濃度質(zhì)控溶液（QC-低）。先測(cè)定混合越橘提取物中C11、C14、C15含量后，精確稱混合越橘提取物0.5 mg，分別加入1 mL QC-高、QC-中和QC-低（每組平行6份），超聲提取5 min，12 000 r/min離心（離心半徑5 cm）5 min，取上清，用40%甲醇水稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜。按照“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下的方法測(cè)定，記錄花青素峰面積，計(jì)算平均加樣回收率和RSD。結(jié)果（表3）顯示RSD均小于5.00%，表明該方法加樣回收率良好。

2.4 花青素類成分含量測(cè)定

2.4.1 樣品中20種花青素類成分的含量測(cè)定 取待測(cè)樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定。進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，記錄峰面積根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中各成分質(zhì)量濃度，按照下式計(jì)算樣品中各成分含量。

表3 3種花青素類成分的加樣回收率結(jié)果(對(duì)照品法)

被測(cè)成分相對(duì)于對(duì)照越橘提取物中該成分的量＝(標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出的各化合物濃度×所用提取溶劑體積×稀釋倍數(shù))/所取樣品質(zhì)量

采用建立的對(duì)照品非依賴性花青素類UPLC-QQQ-MS/MS定量方法，對(duì)10批市售歐洲越橘提取物中的花青素類成分含量進(jìn)行研究。正離子模式下的提取離子流色譜圖見圖1。按照“2.4”項(xiàng)下公式計(jì)算被測(cè)成分相對(duì)于對(duì)照越橘提取物中該成分的量，結(jié)果表明不同產(chǎn)家中化合物C1、C4、C6、C10、C13、C14、C16～C18和C20含量差異相對(duì)較?。≧SD＜5.00%），而其余化合物含量波動(dòng)較大，其中化合物C5的含量差異最為明顯（RSD為18.23%）。結(jié)果詳見表4。

2.4.2 20種花青素類成分的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析是指對(duì)2個(gè)或多個(gè)具備相關(guān)性的變量元素進(jìn)行分析，從而衡量2個(gè)變量因素的相關(guān)性密切程度（0＜||≤0.3為微弱相關(guān)，0.3＜||≤0.5為低度相關(guān)，0.5＜||≤0.8為顯著相關(guān)，0.8＜||≤1.0為極顯著相關(guān)）。為了解花青素之間的相關(guān)性密切程度，用SPSS 22.0軟件對(duì)20種花青素類成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，應(yīng)用Graphpad Prism軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖展示。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，矢車菊素與C6（＝0.87，＜0.01）、芍藥素與C7（＝0.86，＜0.01）、飛燕草素與C16（＝0.95，＜0.01）、飛燕草素與C15（＝0.91，＜0.01）、矮牽牛素與C17（＝0.90，＜0.01）呈極顯著相關(guān)。此外，C11與飛燕草素（＝?0.67，＜0.05）、C16（＝?0.55，＜0.05）、C8（＝?0.68，＜0.05）呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，C10與C13（＝?0.62，＜0.05）、錦葵素與C18（＝?0.60，＜0.05）也呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖1 越橘標(biāo)準(zhǔn)提取物(A) 和越橘提取物(S1, B) 中20種花青素類成分(C1～C20) 的MRM色譜圖

表4 10批越橘提取物樣品中20種花青素類成分相對(duì)于對(duì)照越橘提取物中該成分的量

圖2 20種花青素類成分的相關(guān)性分析

2.5 體外抗氧化活性檢測(cè)

2.5.1 DPPH自由基清除活性的測(cè)定 DPPH自由基清除能力測(cè)定參考文獻(xiàn)方法[8]。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取10.012 mg的水溶性維生素E（Trolox）對(duì)照品粉末，加入無(wú)水乙醇溶解200 mL，配制成200 μmol/L的Trolox母液。隨后將母液稀釋為20、40、60、100、140、160、180 μmol/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)梯度液。準(zhǔn)確吸取0.9 mL不同濃度的Trolox對(duì)照品溶液于不同離心管中，隨后加入0.9 mL 100 μmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻后在室溫下黑暗靜置30 min。在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值（1），同樣的方法檢測(cè)Trolox對(duì)照品與25%甲醇溶劑的吸光度值（2），以及25%甲醇溶劑與100 μmol/L DPPH溶液混合后的吸光度值（3），利用以下公式計(jì)算DPPH自由基的清除率。

清除率＝1－(1－2)/3

根據(jù)Trolox濃度（）和DPPH自由基清除率（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為＝0.005 6－0.031 1，＝0.999 0，線性范圍為20～180 μmol/L。依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品的DPPH清除能力，單位為每克樣品干質(zhì)量的μmol Trolox當(dāng)量（Trolox μmol/g DW）。

（2）樣品的DPPH自由基清除率：分別取“2.2.1”項(xiàng)下制備的越橘提取物溶液和100 μmol/L DPPH溶液各0.9 mL，充分混合，室溫避光靜置30 min后，于517 nm處測(cè)定其吸光度（）值，每個(gè)樣品重復(fù)3次。DPPH自由基清除率公式同上。

對(duì)10批越橘提取物清除DPPH自由基活性研究，結(jié)果如表5所示，在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL下，所有越橘提取物的DPPH自由基清除率均高于90%。樣品S1的DPPH自由基清除率最高，為96.7%，該樣品在質(zhì)量濃度0.1 mg/mL時(shí)與178.26 Trolox μmol/g DW的清除率相當(dāng)；樣品S10的清除率最低，為91.4%，該樣品在質(zhì)量濃度0.1 mg/mL時(shí)與168.80 Trolox μmol/g DW的清除率相當(dāng)。

表5 不同批次越橘提取物的DPPH自由基清除率和總抗氧化能力檢測(cè)結(jié)果(, n = 3)

2.5.2 總抗氧化活性測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取FeSO4·7H2O 10 mg。加入0.9 mL蒸餾水，20 μL濃硫酸，配制成40 μmol/mL FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液母液。將母液用蒸餾水稀釋為100.0、50.0、25.0、12.5、62.5、3.125 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)梯度液。根據(jù)總抗氧化能力試劑盒說明書，分別取500 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液（蒸餾水作空白）加入500 μL工作液，充分混勻，反應(yīng)10 min，測(cè)定593 nm下的，計(jì)算Δ標(biāo)準(zhǔn)＝標(biāo)準(zhǔn)－空白，此時(shí)Fe2+終濃度為50.0、25.0、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μmol/L。根據(jù)Fe2+終濃度（，μmol/L）和Δ標(biāo)準(zhǔn)（），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為＝5.118 6－0.000 7，＝0.999 8，線性范圍為1.562 5～50.0 μmol/L。

（2）樣品總抗氧化活性測(cè)定：根據(jù)總抗氧化能力試劑盒說明書，分別取“2.2.1”項(xiàng)下制備的越橘提取物溶液30 μL，蒸餾水90 μL及混合工作液900 μL充分混勻，室溫準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，隨后于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定值。將值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到達(dá)到同樣吸光度變化值（Δ）所需的標(biāo)準(zhǔn)液離子濃度（μmol/mL）。根據(jù)以下公式計(jì)算樣品總抗氧化能力（μmol/g）。

總抗氧化能力（μmol/g）＝×反總÷(樣÷樣總×)＝34×÷

樣總為加入提取液體積，1 mL；反總為反應(yīng)總體積，1.02 mL；樣為反應(yīng)中樣品體積，0.03 mL；為標(biāo)準(zhǔn)液離子濃度；為樣品質(zhì)量

越橘提取物總抗氧化能力的結(jié)果如表5所示，其中，樣品S1的總抗氧化能力最高，為4.92 μmol/g，樣品S10的總抗氧化能力最低，為3.65 μmol/g。與DPPH自由基清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.5.3 20種花青素類成分抗氧化活性的相關(guān)性分析 20個(gè)花青素類成分與抗氧化活性的相關(guān)性見表6。矢車菊素、C15與DPPH自由基清除率相關(guān)性均大于0.90，其中矢車菊素最高，為0.94。錦葵素、C10及C11相關(guān)性≤0.30。C9、C13與總抗氧化能力相關(guān)性均大于0.90，其中C13最高，為0.93。錦葵素和C10相關(guān)性≤0.30。

表6 20種花青素類成分與DPPH自由基清除率和總抗氧化能力的相關(guān)性

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照提取物在含量測(cè)定中的優(yōu)勢(shì)

對(duì)照品在被測(cè)物質(zhì)含量測(cè)定過程中能夠起到至關(guān)重要的作用。但是，實(shí)際操作中常常面臨的問題是對(duì)照品價(jià)格較高或者較難獲得，這些因素?zé)o形中增加了科研的難度和阻力[9]。而利用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照提取物進(jìn)行含量測(cè)定，相較于單體化合物最大的優(yōu)勢(shì)在于其能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)化合物進(jìn)行含量測(cè)定，且標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照提取物更穩(wěn)定、易獲取，價(jià)格便宜，能夠解決部分單體化合物穩(wěn)定性差、制備要求嚴(yán)苛、制備成本高、運(yùn)輸保存難等問題[10-13]。歐洲越橘的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照提取物在《歐洲藥典》10.0中有記載，從定義、含量、生產(chǎn)過程、特征及鑒別5個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行了限制，質(zhì)量可控。目前，《中國(guó)藥典》2020年版收載的對(duì)照提取物有23種，集中在揮發(fā)油、脂肪酸、皂苷類成分[14]，且這些對(duì)照提取物主要被用于定性鑒別，而在含量測(cè)定項(xiàng)目中應(yīng)用較少。

3.2 檢測(cè)方法的選擇

目前，常見的花青素類成分含量測(cè)定方法有分光光度法、高效液相色譜紫外分光光度法及薄層色譜法等[15-16]。分光光度法雖然簡(jiǎn)單常用，但不具備分離能力，不能同時(shí)對(duì)多個(gè)成分進(jìn)行定量，且結(jié)果受到溶劑選擇、樣品顏色和雜質(zhì)的影響，容易引入誤差；薄層色譜法快速，較多用于定性研究，具有分離能力，但分離能力不佳。綜合考慮本研究采用同時(shí)兼具液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)的LC-MS聯(lián)用法[6,17]。三重四極桿質(zhì)譜（QQQ）的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）具有極高的靈敏度，可對(duì)樣品中的微量成分精確定量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是中藥定量分析中的有效手段[18-19]，因此，本實(shí)驗(yàn)利用UPLC-QQQ-MS/MS建立越橘中20種花青素類成分的定量分析方法。

3.3 不同批次越橘提取物中花青素含量測(cè)定

通過對(duì)10批市售提取物含量測(cè)定結(jié)果可以看出，化合物C2、C3、C5、C7～C9、C11、C12、C15和C19在各樣品中含量波動(dòng)較大（RSD＞5.00%），其中以C5差異最為顯著，RSD值為18.23%，而C1、C4、C6、C10、C13、C14、C16～C18和C20的含量波動(dòng)相對(duì)較?。≧SD＜5.00%）。此外，除S9和S10 2批樣品以外，其余8批樣品中化合物C4、C8、C16和C18的含量均高于越橘對(duì)照提取物，造成這種差異的原因可能是由于不同廠家生產(chǎn)工藝差異或材料來(lái)源不同等，導(dǎo)致越橘提取物中花青素含量波動(dòng)較大。因此對(duì)越橘提取物中花青素類成分含量的控制顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)花青素類成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示矢車菊素與C6、芍藥素與C7、飛燕草素與C15及C16、矮牽牛素與C17呈極顯著相關(guān)，可能是因?yàn)樵诨ㄇ嗨睾铣赏分校ㄇ嗨厥歉黝惢ㄇ嘬蘸铣傻那绑w，在類黃酮-3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下花青素實(shí)現(xiàn)糖基化變成較為穩(wěn)定的花青苷，因此，它們的含量變化緊密相關(guān)。此外，C11與飛燕草素、C16、C8呈顯著負(fù)相關(guān)。可能是因?yàn)樵诨ㄇ嗨睾铣蛇^程中，二氫黃酮醇在類黃酮3′-羥化酶、類黃酮3′,5′-羥化酶作用下分別生成二氫槲皮素和二氫楊梅黃酮，二者在二氫黃酮醇還原酶和花青素合成酶的作用下分別生成矢車菊素和飛燕草素[20]，矢車菊素、飛燕草素及二者糖苷皆由二氫黃酮醇分化而來(lái)，因此它們可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這一原因可能導(dǎo)致了它們呈負(fù)相關(guān)。

3.4 抗氧化活性的研究

目前，關(guān)于花青素抗氧化機(jī)制的研究已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展。研究者認(rèn)為花青素的抗氧化活性受到分子結(jié)構(gòu)的影響，苷元、糖基、甲基和酰化酸的類型、糖基化、甲基化和酰化的位置和程度對(duì)其抗氧化能力均有影響。此外，花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也是影響抗氧化活性的重要因素[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在20種花青素類成分與抗氧化活性相關(guān)性研究中矢車菊素與DPPH自由基清除能力呈極顯著相關(guān)，C13與總抗氧化能力呈極顯著相關(guān)，建議將二者作為抗氧化活性的標(biāo)志性成分，便于對(duì)后續(xù)花青素抗氧化活性的研究。

4 結(jié)論

歐洲越橘作為重要的“功能性食品”擁有悠久的食用史，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及人民生活水平的提高，越橘提取物因其豐富的花青素含量而備受關(guān)注。本研究以《歐洲藥典》中的越橘標(biāo)準(zhǔn)提取物代替對(duì)照品，基于UPLC-QQQ-MS/MS建立了同時(shí)測(cè)定歐洲越橘提取物中20種花青素的定量方法，該方法穩(wěn)定性高，精密度好，重復(fù)性強(qiáng)能夠準(zhǔn)確測(cè)定越橘中花青素的含量。

同時(shí)定量結(jié)果表明，來(lái)自不同產(chǎn)家樣品中花青素含量差異，這可能是由于花青素本身不穩(wěn)定或者生產(chǎn)工藝、材料來(lái)源等原因?qū)е?。此外抗氧化活性?shí)驗(yàn)表明，矢車菊素有望作為歐洲越橘提取物清除DPPH自由基活性的質(zhì)控成分，而C13有望作為總抗氧化活性的質(zhì)控成分。本研究為歐洲越橘花青素類成分的質(zhì)量控制提供了新方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality control method and pharmacological activity correlation study ofextract based on reference extract

LI Zhen1, 2, LI Jun2, AN Ruofan2, SUN Wei2, YUE Zhongbao3, YANG Wei2, HE Ruikun3

1. College of Pharmaceutical Science, Dali University, Dali 671000, China 2. Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100007, China 3. Institute of Nutrition & Health, BYHEATH Co., Ltd., Guangzhou 510663, China

To establish a method for the quantitative analysis of 20 anthocyanin components based on the reference extract of Ouzhouyueju () and to utilize the method for the quality control of commercializedmacrocarpon extracts, and screen out a representative antioxidant active ingredient.An ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry (UPLC-QQQ-MS/MS) method was developed for the quantification of 20 anthocyanin components using reference extract ofmacrocarpon as the standard, and the method was utilized to investigate 10 batches of commercially availablemacrocarpon extracts. The antioxidant capacity of differentextracts was evaluated using the DPPH free radical scavenging method and the total antioxidant test.A UPLC-QQQ-MS/MS method was developed for the quantitative analysis of 20 anthocyanin compounds in the extract ofwith reference extract. Methodological validation demonstrated good linearity (: 0.999 4—1.000 0), precision RSD (0.05%—4.23%), stability (0.29%—3.38%), and average recovery rate (98.1%—102.1%) of the 20 anthocyanin components. The results of the sample analysis showed that there were significant differences in the content of some components in different samples, with the greatest variation being malvidin with an RSD of 18.23%.extract has better DPPH radical scavenging and total antioxidant capacity. Cyanidin and peonidin-3--galactoside could be potential quality control components for assessing the DPPH radical scavenging and total antioxidant activity ofextracts, respectively.A quantitative analysis method of 20 anthocyanin components inextract was established in this study based on UPLC-QQQ-MS/MS. The method is sensitive, accurate, simple, and suitable for the determination of the content of 20 anthocyanin components in theextract, which provides data support for the application of the reference extract of traditional Chinese medicine to replace the single standard in the quality control of traditional Chinese medicine. The method provides a new research idea for the quality control study of traditional Chinese medicine.

L.; reference extract; UPLC-QQQ-MS/MS; antioxidant capacity; quality control; anthocyanins; cyanidin-3--glucoside; peonidin 3--glucoside; delphinidin-3--galactoside; malvidin; cyanidin; peonidin-3--galactoside

R283.6

A

0253 - 2670(2024)08 - 2561 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.007

2023-09-26

中央級(jí)公益性科研院所基本業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（ZZ13-YQ-45）；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CI2021A04902）；中央級(jí)公益性科研院所基本業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（ZXKT18015）

李 鎮(zhèn)（1996—），男，彝族，碩士研究生，從事藥動(dòng)學(xué)研究。E-mail: lizhen77649@126.com

通信作者：楊 維，副研究員，從事藥動(dòng)學(xué)研究。E-mail: wyang@icmm.ac.cn

賀瑞坤，從事天然產(chǎn)物功效研究及保健食品開發(fā)。E-mail: herk@by-health.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]