吳婉芬，鄭文烈，池玉梅，趙曉莉，張 雯，謝 輝*，狄留慶*

經(jīng)典名方溫膽湯基準(zhǔn)樣品標(biāo)志性成分群質(zhì)量評(píng)價(jià)體系構(gòu)建

吳婉芬1, 2，鄭文烈1, 2，池玉梅1, 2，趙曉莉1, 2，張 雯1, 2，謝 輝1, 2*，狄留慶1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程研究技術(shù)中心，江蘇 南京 210023

建立經(jīng)典名方溫膽湯基準(zhǔn)樣品特征圖譜，并采用一測(cè)多評(píng)（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）法同時(shí)測(cè)定5種標(biāo)志性成分（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸、6-姜辣素）的含量。制備15批溫膽湯基準(zhǔn)樣品，以橙皮苷為參照峰確定共有峰，建立溫膽湯HPLC特征圖譜；以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)參照物，確定其他4種成分的相對(duì)校正因子（s/i）并計(jì)算含量，同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定，比較兩者結(jié)果差異。建立了溫膽湯基準(zhǔn)樣品的HPLC特征圖譜，15批基準(zhǔn)樣品的特征圖譜相似度均大于0.99；以橙皮苷為內(nèi)參的柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸、6-姜辣素的s/i分別為0.940 1、0.932 9、0.413 6、0.607 3，QAMS法含量測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法無(wú)顯著差異。建立的HPLC特征圖譜結(jié)合QAMS法方便、穩(wěn)定，能較好地對(duì)溫膽湯基準(zhǔn)樣品進(jìn)行整體質(zhì)量評(píng)價(jià)。

溫膽湯；經(jīng)典名方；基準(zhǔn)樣品；HPLC；特征圖譜；一測(cè)多評(píng)法；質(zhì)量評(píng)價(jià)；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷；甘草酸；6-姜辣素

經(jīng)典名方溫膽湯出自唐代孫思邈的《備急千金藥方》，該方由半夏（清半夏）、竹茹、枳實(shí)（麩炒）、陳皮、生姜、甘草（炒）6味藥組成，具有理氣化痰、和胃利膽之功效，主要治療膽胃不和、膽虛痰熱內(nèi)擾所致的虛煩不得眠，現(xiàn)代臨床也常應(yīng)用于心血管、內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病治療[1-4]，因其應(yīng)用廣泛、療效明確，收錄于第一批《古代經(jīng)典名方目錄》[5]。2016年，劉昌孝院士[6]首次提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）這一概念，明確了Q-Marker的五大原則分別是特有性、有效性、傳遞與溯源、可測(cè)性和配伍環(huán)境，為建立全過(guò)程質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供了新思路。因?yàn)橹兴幎喑煞?、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用，目前特征圖譜和多指標(biāo)成分含量測(cè)定已被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的質(zhì)量評(píng)價(jià)中[7-10]。多成分定量測(cè)定一般使用外標(biāo)法，往往需要多個(gè)中藥化學(xué)對(duì)照品，而對(duì)照品存在分離難度大、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）是用其中某一成分作為內(nèi)參物，通過(guò)計(jì)算其他待測(cè)成分的相對(duì)校正因子（s/i），從而同時(shí)對(duì)多個(gè)成分進(jìn)行定量分析，具有節(jié)省成本、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，已被用于中藥單味藥和中藥復(fù)方的質(zhì)量評(píng)價(jià)中[11-14]。目前，針對(duì)經(jīng)典名方溫膽湯的質(zhì)量控制研究較少，且包含的指標(biāo)成分覆蓋藥味較少[14-17]，為進(jìn)一步提升溫膽湯基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量控制，提高特征指標(biāo)質(zhì)和量的針對(duì)性，本研究建立HPLC特征圖譜，并對(duì)15批溫膽湯基準(zhǔn)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，采用QAMS法，以橙皮苷為內(nèi)參物，通過(guò)內(nèi)參對(duì)照品對(duì)溫膽湯中多組分進(jìn)行測(cè)定，以期為經(jīng)典名方溫膽湯全面質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；XP-6型百萬(wàn)分之一電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；Sartorius CPA225D型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；KH-500DE型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Scientz-20F/A型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q Synthesis 108型超純水儀，美國(guó)Milli-Q公司。

1.2 對(duì)照品與試劑

對(duì)照品甘草苷（批號(hào)111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、柚皮苷（批號(hào)110722-202116，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.5%）、橙皮苷（批號(hào)110721-202019，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.3%）、新橙皮苷（批號(hào)111857-201804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、甘草酸單銨鹽（批號(hào)110731-202122、質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.4%）、6-姜辣素（批號(hào)111833-202007，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品對(duì)香豆酸（批號(hào)Y16O8C45561）、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮（批號(hào)C09O8Y45293）、芹糖異甘草苷（批號(hào)P09J11L108063）、蕓香柚皮苷（批號(hào)P25J9L66554）、川陳皮素（批號(hào)H22M8K32109），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98.0%以上，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；對(duì)照品新北美圣草苷（批號(hào)DST201128-095），質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%以上，購(gòu)自成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司。乙腈、甲醇，色譜純，美國(guó)Tedia公司；甲醇、冰醋酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸，色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；水由實(shí)驗(yàn)室Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.3 藥材

溫膽湯由半夏、竹茹、枳實(shí)、陳皮、生姜和甘草6味藥組成，藥材均購(gòu)自道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定，其中半夏來(lái)自甘肅隴南，為天南星科半夏屬植物半夏(Thunb.) Berit.的干燥塊莖；竹茹來(lái)自浙江嘉興，為禾本科剛竹屬植物淡竹(Lodd.) Munro var.(Mitf.) Stapf ex Rendle的莖稈的干燥中間層；枳實(shí)來(lái)自重慶江津，為蕓香科柑橘屬植物酸橙L.的干燥幼果；陳皮來(lái)自浙江東陽(yáng)，為蕓香科柑橘屬植物橘Blanco的干燥成熟果皮；生姜來(lái)自云南羅平，為姜科姜屬植物姜Rose.的新鮮根莖；甘草來(lái)自?xún)?nèi)蒙古王爺?shù)?，為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖。藥材按前期研究確定的各藥材炮制方法炮制加工成對(duì)應(yīng)的飲片，并按照《中國(guó)藥典》2020年版方法檢測(cè)，均符合規(guī)定。根據(jù)excel隨機(jī)數(shù)表法將溫膽湯6味飲片隨機(jī)組合成15批溫膽湯基準(zhǔn)樣品，15批基準(zhǔn)樣品編號(hào)及各飲片對(duì)應(yīng)批號(hào)見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 15批溫膽湯基準(zhǔn)樣品的制備

將組方中6味中藥飲片粉碎成粗粒，按處方量稱(chēng)取清半夏27.6 g，竹茹27.6 g，麩炒枳實(shí)27.6 g，陳皮41.4 g，生姜55.2 g，炒甘草13.8 g于陶瓷鍋中，加1 600 mL水，先武火2 200 W加熱煮沸后，在調(diào)制文火600 W保持微沸狀態(tài)繼續(xù)煎煮80 min，趁熱用100目篩網(wǎng)濾過(guò)，濾液放置至室溫后，將體積調(diào)整至400 mL，煎液經(jīng)70 ℃減壓濃縮并冷凍干燥25 h，即得。

表1 15批溫膽湯基準(zhǔn)樣品飲片批號(hào)

2.2 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），保護(hù)柱為Agilent Zorbax C18柱（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.3%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～28 min，12%乙腈；28～32 min，12%～19%乙腈；32～46 min，19%乙腈；46～65 min，19%～42%乙腈；65～75 min，42%乙腈；75～76 min，42%～70%乙腈；76～80 min，70%乙腈；80～82 min，70%～12%乙腈；82～90 min，12%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)為0～55 min，310 nm；55～69 min，250 nm；69～90 min，280 nm；柱溫為30 ℃；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3 溫膽湯基準(zhǔn)樣品特征圖譜的建立

2.3.1 供試品溶液制備 取溫膽湯基準(zhǔn)樣品粉末約0.1 g，精密稱(chēng)定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加80%甲醇10 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）20 min，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.2 精密度考察 取S1號(hào)溫膽湯基準(zhǔn)樣品粉末，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以橙皮苷色譜峰為參照峰，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.01%～0.19%和0.20%～3.30%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取S1號(hào)溫膽湯基準(zhǔn)樣品粉末，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以橙皮苷色譜峰為參照峰，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.03%～0.37%和0.23%～4.72%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取S1號(hào)溫膽湯基準(zhǔn)樣品粉末，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別于制樣后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以橙皮苷色譜峰為參照峰，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.03%～0.47%和0.09%～3.96%，結(jié)果表明供試品溶液在制樣后24 h穩(wěn)定性良好。

2.3.5 15批溫膽湯特征圖譜相似度評(píng)價(jià) 分別稱(chēng)取15批溫膽湯基準(zhǔn)樣品0.1 g，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到15批溫膽湯基準(zhǔn)樣品的特征圖譜，將S1～S15特征圖譜依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件進(jìn)行分析，以S10圖譜作為參照，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜并計(jì)算相似度，確定了17個(gè)特征峰，計(jì)算各批溫膽湯基準(zhǔn)樣品與其對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，分別為1.000、1.000、1.000、0.999、1.000、0.999、1.000、1.000、0.998、1.000、0.999、1.000、0.999、0.998、0.997。從指紋圖譜相似度結(jié)果可以看出，多批次的溫膽湯基準(zhǔn)樣品具有較高的一致性，表明樣品質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性良好。各批指紋圖譜疊加圖及其對(duì)照指紋圖譜（R）見(jiàn)圖1。

2.3.6 溫膽湯基準(zhǔn)樣品特征圖譜共有峰的指認(rèn)及歸屬 按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備單味飲片供試品溶液、缺單味飲片供試品溶液，將溫膽湯特征圖譜與混合對(duì)照品溶液及單味藥、缺單味藥供試品溶液進(jìn)行對(duì)比，對(duì)各共有峰進(jìn)行指認(rèn)和歸屬，指認(rèn)出其中12個(gè)共有峰，分別為對(duì)香豆酸（峰1）、甘草苷（峰3）、新北美圣草苷（峰4）、蕓香柚皮苷（峰5）、柚皮苷（峰6）、橙皮苷（峰7）、新橙皮苷（峰8）、芹糖異甘草苷（峰9）、甘草酸（峰14）、川陳皮素（峰15）、6-姜辣素（峰16）、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮（峰17），結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，1號(hào)峰（對(duì)香豆酸）來(lái)自竹茹和枳實(shí)；12、17（3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮）號(hào)峰來(lái)自陳皮；4（新北美圣草苷）、6（柚皮苷）、8（新橙皮苷）號(hào)峰來(lái)自枳實(shí)；2、5（蕓香柚皮苷）、7（橙皮苷）、15（川陳皮素）號(hào)峰來(lái)自陳皮和枳實(shí)；3（甘草苷）、9（芹糖異甘草苷）、10、11、13、14（甘草酸）號(hào)峰來(lái)自甘草；16號(hào)峰（6-姜辣素）來(lái)自生姜。溫膽湯及各單味藥基準(zhǔn)樣品特征圖譜見(jiàn)圖3。

圖1 15批溫膽湯基準(zhǔn)樣品的特征圖譜

2.4 含量測(cè)定方法的建立

2.4.1 供試品溶液的制備 取溫膽湯基準(zhǔn)樣品粉末約0.3 g，精密稱(chēng)定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加60%乙醇10 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）20 min，放冷，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1-對(duì)香豆酸；3-甘草苷；4-新北美圣草苷；5-蕓香柚皮苷；6-柚皮苷；7-橙皮苷；8-新橙皮苷；9-芹糖異甘草苷；14-甘草酸；15-川陳皮素；16-6-姜辣素；17-3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮。

圖3 溫膽湯及各單味藥制得基準(zhǔn)樣品特征圖譜

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素對(duì)照品適量，加甲醇制得質(zhì)量濃度分別為923.69、524.34、2 961.72、133.29、40.60 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程分別為柚皮苷＝3 903.3－2 467.2，2＝0.999 9，線性范圍92.37～923.69 μg/mL；橙皮苷＝3 707.1－2 201.8，2＝0.999 9，線性范圍52.43～524.34 μg/mL；新橙皮苷＝3 927.7－6 980.5，2＝0.999 8，線性范圍296.17～2 961.72 μg/mL；甘草酸＝8 761.0＋1 777.3，2＝0.999 7，線性范圍13.33～133.29 μg/mL；6-姜辣素＝6 071.5－2 445.9，2＝0.999 8，線性范圍4.06～40.60 μg/mL，結(jié)果表明，各成分在各質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸、6-姜辣素峰面積的RSD分別為0.33%、0.31%、0.34%、1.49%、0.43%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號(hào)溫膽湯基準(zhǔn)樣品粉末，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別于制樣后0、2、8、12、18、24 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸、6-姜辣素峰面積的RSD分別為0.54%、0.59%、0.51%、0.96%、1.03%，結(jié)果表明供試品溶液在制樣后24 h穩(wěn)定性良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1號(hào)溫膽湯基準(zhǔn)樣品粉末，按“2.4.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸、6-姜辣素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為0.13%、0.31%、0.23%、0.52%、0.54%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收試驗(yàn) 稱(chēng)取已測(cè)定指標(biāo)成分含量的溫膽湯基準(zhǔn)樣品粉末S1約0.15 g共6份，精密稱(chēng)定，置具塞量瓶中，分別精密加入與供試品溶液中含量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品，加60%乙醇至10 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）20 min，放冷，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得加樣回收試驗(yàn)供試品溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得到加樣回收率和RSD。結(jié)果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸、6-姜辣素的平均加樣回收率分別為97.18%、97.90%、102.24%、101.79%、96.81%，RSD分別為0.74%、0.96%、0.77%、1.56%、1.38%，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5 QAMS建立

2.5.1s/i的測(cè)定 按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件，將混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣4、8、10、12、15、20 μL，計(jì)錄各成分峰面積，以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)參照物，按照公式s/i＝s/f＝sC/ACs計(jì)算，其中s為內(nèi)標(biāo)參照物橙皮苷的峰面積，s為對(duì)照品橙皮苷的質(zhì)量濃度，A為待測(cè)成分的峰面積，C為待測(cè)成分的質(zhì)量濃度。分別計(jì)算內(nèi)參物橙皮苷與4個(gè)待測(cè)成分柚皮苷（a）、新橙皮苷（b）、甘草酸（c）、6-姜辣素（d）的s/i和RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5.2 不同儀器和色譜柱考察 考察了Waterse e2695和Agilent 1260高效液相色譜儀及Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo BDS HypersilTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）2種色譜柱對(duì)s/i的影響，并計(jì)算RSD，結(jié)果均小于2%，表明不同儀器和色譜柱適用性良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 各成分fs/i計(jì)算結(jié)果

2.5.3 不同柱溫對(duì)s/i的影響 采用Waters e2695色譜儀和Waters XBridge C18色譜柱考察了不同柱溫25、30、35 ℃對(duì)s/i的影響，并計(jì)算RSD，結(jié)果均小于2%，表明不同柱溫對(duì)各成分s/i無(wú)顯著影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5.4 不同體積流量對(duì)s/i的影響 采用Waters e2695色譜儀和Waters XBridge C18色譜柱考察了不同體積流量0.8、1.0、1.2 mL/min對(duì)s/i的影響，并計(jì)算RSD，結(jié)果均小于1%，表明不同體積流量對(duì)各成分s/i無(wú)顯著影響，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5.5 待測(cè)組分色譜峰定位 以橙皮苷色譜峰為參照峰，采用相對(duì)保留時(shí)間法（待測(cè)成分與對(duì)照物保留時(shí)間的比值）定位其他4種成分色譜峰。考察不同液相色譜儀及不同色譜柱時(shí)，柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸、6-姜辣素的相對(duì)保留時(shí)間（RRT），各待測(cè)成分RRT的RSD均小于2.0%，結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，各色譜峰可使用RRT法進(jìn)行定位，結(jié)果見(jiàn)表6。

表3 不同儀器和色譜柱對(duì)fs/i的影響

表4 不同柱溫對(duì)fs/i的影響

表5 不同體積流量對(duì)fs/i的影響

2.6 外標(biāo)法與QAMS測(cè)定的比較

取15批溫膽湯基準(zhǔn)樣品，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，采用QAMS法建立內(nèi)參物橙皮苷與柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素的s/i，對(duì)溫膽湯樣品中的各成分進(jìn)行含量測(cè)定，同時(shí)采用外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，用相對(duì)偏差（relative deviation，RD）驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的合理性及可行性，結(jié)果見(jiàn)表7，2種測(cè)定方法結(jié)果無(wú)顯著性差異，RD值均小于1.00%，表明所建立的QAMS測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性較高，在溫膽湯基準(zhǔn)樣品多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用是可行的。

表6 各成分相對(duì)保留時(shí)間

表7 外標(biāo)法和QAMS法測(cè)定溫膽湯基準(zhǔn)樣品中5種成分含量

3 討論

Q-Marker的“五原則”有利于提升中藥復(fù)方制劑的整體質(zhì)量，并為本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)典名方溫膽湯質(zhì)控成分的選擇提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)選取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸和6-姜辣素作為經(jīng)典名方溫膽湯的標(biāo)志性成分群，柚皮苷和新橙皮苷在方中含量極高，是枳實(shí)的主要有效特征成分；橙皮苷為陳皮和麩炒枳實(shí)共有成分，但主要來(lái)源于陳皮，為《中國(guó)藥典》2020年版中陳皮的質(zhì)量控制指標(biāo)；甘草酸的含量亦較高，歸屬于炒甘草；生姜在方中用量最大，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)方中含有生姜指標(biāo)成分6-姜辣素，以上體現(xiàn)了5個(gè)成分作為經(jīng)典名方溫膽湯Q-Marker的化學(xué)成分特有性及中藥質(zhì)量的可測(cè)性。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)各藥材、飲片進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)指標(biāo)性成分在藥材-飲片-溫膽湯基準(zhǔn)樣品中穩(wěn)定轉(zhuǎn)移，滿(mǎn)足質(zhì)量傳遞及溯源的要求。

研究表明，柚皮苷、新橙皮苷具有胃排空和小腸推進(jìn)作用[18]；甘草酸具有良好的抗炎和抗抑郁作用[19]；6-姜辣素是生姜發(fā)揮抗炎的主要有效成分[20]，并且能夠改善大鼠的海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）水平，是潛在的神經(jīng)保護(hù)劑[21]；橙皮苷具有抗氧化、清除自由基活性的作用，能通過(guò)保肝輔助抵抗抑郁癥[22]。以上體現(xiàn)了柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸和6-姜辣素作為溫膽湯Q-Marker的有效性，本實(shí)驗(yàn)選擇的5個(gè)指標(biāo)成分參考了Q-Marker的“五原則”，覆蓋方中4味藥味，與溫膽湯疏肝理氣、和胃利膽的功效有關(guān)，能夠較為全面的反應(yīng)溫膽湯的整體質(zhì)量。

溫膽湯中清半夏為君藥，在炮制工序中，其主要成分核苷類(lèi)成分損失較多；竹茹中的主要成分為多糖類(lèi)成分，因此，在目前的含量測(cè)定中沒(méi)有相應(yīng)的指標(biāo)性成分。后續(xù)將對(duì)清半夏、竹茹的特征信息進(jìn)行深入研究，并通過(guò)薄層鑒別、特征圖譜等手段進(jìn)行補(bǔ)充。本研究首次建立了QAMS法結(jié)合特征圖譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定經(jīng)典名方溫膽湯中的標(biāo)志性成分群含量，以色譜圖中保留時(shí)間和峰面積適中、對(duì)照品性質(zhì)穩(wěn)定的橙皮苷為內(nèi)參物，同時(shí)測(cè)定溫膽湯中柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸和6-姜辣素含量，確定其s/i分別為0.940 1、0.932 9、0.413 6、0.607 3，QAMS法和外標(biāo)法分別測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異，具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。特征圖譜和QAMS聯(lián)用能夠反映整個(gè)復(fù)方的整體質(zhì)量，經(jīng)典名方溫膽湯基準(zhǔn)樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，也為溫膽湯顆粒劑的后續(xù)研究提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation of indicative component group of classic prescription Wendan Decoction

WU Wanfen1, 2, ZHENG Wenlie1, 2, CHI Yumei1, 2, ZHAO Xiaoli1, 2, ZHANG Wen1, 2, XIE Hui1, 2, DI Liuqing1, 2

1.School of Pharmacy, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2.Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To establish the characteristic chromatograms of classic prescription Wendan Decoction (溫膽湯) and determine five index components (naringin, hesperidin, neohesperidin, glycyrrhizin and 6-gingerol) by quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS) methods.A total of 15 batches of Wendan Decoction benchmark sample were prepared and the HPLC characteristic chromatograms of Wendan Decoction were established to determine common peaks with hesperidin as the reference peak. Hesperidin was used as the internal standard reference to calculate the relative correction factors of naringin, neohesperidin, glycyrrhizin, and 6-gingerol by HPLC and the content determination of five active ingredients were determined using the external standard method (ESM) and QAMS methods respectively.The similarity of characteristic chromatograms of the 15 batches of samples were all greater than 0.99. The relative correction factors of naringin, neohesperidin, glycyrrhizin acid and 6-gingerol using hesperidin as the internal reference were 0.940 1, 0.932 9, 0.413 6 and 0.607 3, respectively, and there was no significant difference between the contents of the components determined by the QAMS method and the ESM method.The established HPLC characteristic chromatograms combined with QAMS method is convenient and stable, which provides a reference for the overall quality evaluation of Wendan Decoction benchmark sample.

Wendan Decoction; classic prescription; benchmark sample; HPLC; characteristic chromatograms; QAMS; quality evaluation; naringin; hesperidin; neohesperidin; glycyrrhizin; 6-gingerol

R283.6

A

0253 - 2670(2024)08 - 2553 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.006

2023-09-12

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（ZYBZH-C-JS-30）；江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（KYCX19-1313）

吳婉芬（1999—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)。E-mail: 20210890@njucm.edu.cn

通信作者：狄留慶，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┭芯颗c新產(chǎn)品研發(fā)。E-mail: diliuqing@126.com

謝 輝，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┭芯颗c新產(chǎn)品研發(fā)。E-mail: njxh66@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]