周曉敏，何霞紅，施 蕊，李順美，張靖儀*

（1.云南省林下資源保護與利用重點實驗室，云南昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南昆明 650224）

人參是五加科人參屬多年生草本植物，是植物界的活化石，自古便有“百草之王”的美稱，被列為我國重點一級保護野生植物。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人參在治療心血管疾病、抗癌、抗腫瘤等方面均有明顯作用[1]。人參的各部位都含有很多的化學(xué)成分，并且有很好的藥性，因此當(dāng)前對人參各部位的研究也越來越多。徐艷陽等研究表明，多酚含量最高的部位是人參葉，其次為莖和花，在根中的含量最低[2]。顧健等研究表明，人參皂苷20(R)-Rg2 在人參花中的含量較高[3]。WU等研究表明，人參花蕾中總皂苷含量高，用來泡水喝有提神抗疲勞和增強免疫力的作用[4]。姚麗娜等用人參根和人參莖葉皂苷溶液給單獨飼養(yǎng)的小鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)人參根皂苷具有中樞鎮(zhèn)靜的功效，而莖葉皂苷則有相反的功效，會使小鼠興奮[5]。

黃酮類成分是天然藥用植物中常見的化學(xué)成分之一，在治療心血管疾病、抗病毒、抗腫瘤等方面有積極作用，尤其是在抗癌、防癌方面功效顯著，因此黃酮類成分在臨床醫(yī)療、食品、工業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[6-8]。人參中含有的黃酮類成分具有很高的藥效。張儒等研究發(fā)現(xiàn)，人參根中總黃酮能夠通過提高腦組織超氧化物歧化酶的活性來增強腦組織的抗氧化能力[9]。目前，人參化學(xué)成分的研究與應(yīng)用更多的集中于根部，對地上部分的研究較少，而且對人參化學(xué)成分的研究主要集中于皂苷類，對人參不同部位黃酮類成分的研究相對較少。因此，筆者運用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)對林下人參不同部位黃酮類成分進行測定和分析，篩選出不同部位的差異代謝物，為人參各部位藥用價值的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用林下4 年生人參樣品采自遼寧省本溪縣東營坊鄉(xiāng)南營坊村林下人參種植基地（東經(jīng)41°29 8、北緯124°7 25，海拔310 m），選取人參根（L4-R）、莖（L4-S）、葉（L4-L）共3 組樣品，每組樣品設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗儀器和試劑

試驗儀器：UPLC-MS/MS 儀，來源于賽默飛世爾科技公司；Scientz-100F 凍干機，來源于北京四環(huán)起航科技有限公司；Retsch MM400 研磨儀，來源于上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；0.22 μm pore size 微孔濾膜，來源于上海摩速科學(xué)器材有限公司；離心機；渦旋儀；三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP）。

試驗試劑有甲醇（色譜純，Merck）、乙腈（色譜純，Merck）、標(biāo)準(zhǔn)品（BioBioPha/Sigma-Aldrich）、超純水、0.1%甲酸、聚丙二醇。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備與提取

將人參根、莖、葉樣品分別放到凍干機中真空冷凍干燥后用研磨儀研磨成粉末狀，稱取100 mg 粉末用1.2 mL70%甲醇提取液溶解，用渦旋儀每30 min 渦旋1 次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6 次，充分混勻后，將混合液用離心機離心10 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為12 000 r·min-1，吸取上清液，用微孔濾膜過濾樣品，放到進樣瓶中保存，用儀器UPLC-MS/MS 進行分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS 檢測條件

液相條件：使用色譜柱Agilent SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100.0 mm）進行色譜分離；以加0.1%甲酸的超純水為流動相A 相，加0.1%甲酸的乙腈為B 相進行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：采用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP）進行質(zhì)譜分析，系統(tǒng)配備ESI Turbo 離子噴霧接口，操作參數(shù)設(shè)置如表1 所示；在QQQ 和LIT模式下分別用10 μmol·L-1和100 μmol·L-1聚丙二醇溶液進行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)；碰撞氣體（氮氣）為中等。

表1 ESI 源操作參數(shù)

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

基于自建數(shù)據(jù)庫MWDB（Metware Database），根據(jù)二級譜信息對樣品中黃酮類成分進行定性分析，運用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀的多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）對樣品中黃酮類成分進行定量分析。用軟件Analyst 1.6.3 進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理，用MultiaQuant 軟件打開樣本下機質(zhì)譜文件，進行色譜峰的積分和校正。對不同質(zhì)控（Quality Control，QC）樣本，即混合樣本質(zhì)譜檢測分析的總離子流圖（Total Ions Current，TIC）進行重疊展示分析，根據(jù)TIC 圖判斷代謝物提取和檢測的技術(shù)重復(fù)及可靠性。處理后的數(shù)據(jù)采用主成分分析法（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA）相結(jié)合的多元統(tǒng)計分析，篩選差異變量，運用R 軟件中的MetaboAnalystR 包OPLSR.Anal 函數(shù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 林下人參黃酮類成分的定性定量分析

用UPLC-MS/MS法檢測得到多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式代謝物檢測多峰圖（見圖1)，并基于自建數(shù)據(jù)庫從人參根、莖、葉中共檢測到92 種黃酮類代謝產(chǎn)物，包括黃酮醇41 種，黃酮化合物13 種，二氫黃酮11 種，花青素7 種，黃酮碳糖苷、異黃酮和查耳酮各5 種，二氫黃酮醇4 種，其他類黃酮1 種。

圖1 MRM 模式代謝物檢測多峰圖

2.2 主成分分析

對樣本進行主成分分析，初步了解人參根（L4-R）、莖（L4-S）、葉（L4-L）各樣本組間的總體代謝差異和組內(nèi)的變異度大小。PCA 得分圖如圖2 所示，圖中每一個點表示一個樣品，點與點之間的距離越遠(yuǎn)則表示差異性越大。由圖2 可知，第一主成分（PC1）的貢獻率為45.39%，第二主成分的貢獻率（PC2）為41.18%，組內(nèi)呈現(xiàn)相互聚集的情況，組間有區(qū)分，說明林下人參不同部位含有的黃酮類成分有所差異。OPLS-DA 模型驗證如圖3 所示，R2X=0.914，R2Y=0.982 和Q2=0.968，模型驗證穩(wěn)定可靠。

圖2 L4-R_vs_L4-S_vs_L4-L_PCA 主成分分析圖

圖3 OPLS-DA 驗證圖

2.3 具體差異代謝物篩選

基于OPLS-DA 得到的結(jié)果，由表2 可知，從92種黃酮類代謝物中共篩選出27 種差異代謝物，其中黃酮醇12 種，黃酮化合物6 種，黃酮碳糖苷2 種，異黃酮2 種，二氫黃酮、二氫黃酮醇、查耳酮、花青素和其他類黃酮各1 種。

表2 林下人參不同部位差異代謝物統(tǒng)計

對比27 種差異代謝物，進行進一步分析可知，(3R)-5,7-二羥基-6,8-二甲基'-3-(4'-羥基芐基)-色烷-4-酮、卷柏石松素、2,4,2',4'-四羥基-3'-異戊烯基查爾酮、檉柳苷、異檉柳苷、苜蓿素-4'-甲基醚-3'-O-葡萄糖苷、苜蓿素-7-O-葡萄糖二酸苷、鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-7-O-葡萄糖苷(蔓菁苷)、澤蘭黃酮-7-O-葡萄糖苷、6-甲氧基山奈酚-3-O-葡萄糖苷、萬壽菊素-3-O-蕓香糖苷、2'-羥基-5-甲氧基染料木素-4',7-O-二葡萄糖、牽?；ㄋ?3-O-(6"-O-咖啡酰)葡萄糖苷共15 種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為莖＞葉＞根；5,7,8,3',4'-五羥基-6-甲氧基氧雜蒽酮、異鼠李素-3-O-(6"-丙二酰)葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-槐糖苷、槲皮素-3-O-(6"-沒食子酰)半乳糖苷、madreselvin A 共5 種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為根＞莖＞葉；4'-羥基-5,7-二甲氧基黃酮、金圣草黃素-8-C-葡萄糖苷-7-O-(6"-阿魏酰)葡萄糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷共4 種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為葉＞根＞莖；芹菜素-7,4'-二甲醚和香橙素-7-O-葡萄糖苷2 種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為葉＞莖＞根；檉柳黃素-3-O-(6"-丙二酰)葡萄糖苷在林下人參各部位的含量從高到低依次為莖＞根＞葉。

3 結(jié)論與討論

人參中不同的黃酮類化合物具有不同的藥理作用，在臨床治療方面都具備一定的功能價值。有關(guān)研究表明，異鼠李素在沙棘、銀杏葉的研究較為廣泛，是一種天然的小分子黃酮類化合物，也因其在抗癌、抗腫瘤以及心血管等方面有一定作用而用于臨床治療[11-14]。槲皮素可通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、侵襲、遷移，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)其凋亡，同時降低耐藥性[15]。天然的二氫黃酮具有抗癌、抗病毒等多種功能，但其在植物中含量較少，且提取困難，因此二氫黃酮人工化學(xué)合成在近幾年備受關(guān)注[16]。查耳酮由于其促進抑癌基因表達、抑制腫瘤血管生成、抑制酪氨酸蛋白激酶表達，從而抑制細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個抗癌機制在抗腫瘤領(lǐng)域引起廣泛重視[17-18]。此外，將查耳酮與其他抗菌藥效團結(jié)合形成的雜合體，具有耐藥性低、活性高等優(yōu)點，能成為新型抗菌藥開發(fā)的潛在候選物[17-18]。苜蓿素安全性好，因此也廣泛用于癌癥治療[19]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人參花黃酮在與其他類化合物的共同作用下，具有重要的抗疲勞、心血管保護、抗休克、抗腫瘤等功效[20-21]。崔福順等以人參莖葉黃酮苷元為芯材，對人參莖葉微膠囊化進行了研究，為人參莖葉黃酮類化合物的研究和人參莖葉的應(yīng)用提供了更多的可能性[22]。在前人研究中，西洋參根中發(fā)現(xiàn)有黃酮類化合物的存在，西洋參不同部位總黃酮含量測定結(jié)果顯示為花＞果＞莖葉＞根[23-24]。李珂珂等從人參花蕾中首次分離出5 個苯丙酰基?；S酮醇苷類化合物，均為山柰酚的黃酮母核[25]。

近年來，人參的研究一直處于較高的水平，在臨床應(yīng)用方面也有著較高的研究價值[26-27]。2012 年，我國將人工種植的人參批準(zhǔn)為新資源食品，自此之后人參也從單一的中藥材擴展到食品加工以及保健產(chǎn)品等多個方面，為我國人參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展創(chuàng)造了新的機會，提供了新的平臺，因此對于人參功效及作用機理還需要更加深入和全面的研究。

此次研究通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析了林下4 年人參根、莖、葉的黃酮類成分。此外，通過主成分分析法及正交偏最小二乘判別分析法對人參根、莖、葉中的黃酮類代謝物進行組間差異性和組內(nèi)穩(wěn)定性檢測分析，并篩選出根、莖、葉中共有的黃酮類代謝物及3 者間有差異的代謝物。結(jié)果共檢測到92 種黃酮類代謝物，包括41 種黃酮醇、13 種黃酮化合物、11 種二氫黃酮、7 種花青素、5 種黃酮碳糖苷、5 種異黃酮、5 種查耳酮、4 種二氫黃酮醇、1 種其他類黃酮；共篩選出27 種差異代謝物，其中15 種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為莖＞葉＞根，5 種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為根＞莖＞葉，4 種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為葉＞根＞莖，2 種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為葉＞莖＞根，1 種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為莖＞根＞葉。此次研究可為人參的綜合利用提供更多的可能性，同時為推廣林下人參栽培模式提供一定的理論依據(jù)。