韓曉麗，黃景濤，趙寶山，孫光蕊，朱翠敏，梁宗英

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，河北承德 067000；2 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤放化療科

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的腫瘤，約占腫瘤總病死率的20%［1］。肺腺癌是肺癌最常見的病理類型，也是非小細胞肺癌的病理類型之一。肺腺癌患者預(yù)后普遍較差，且具有遺傳易感性。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）基因定位于染色體19q3，其配體存在于多種細胞表面，與多種腫瘤密切相關(guān)。TGF-β1經(jīng)橫跨細胞膜的絲/蘇氨酸激酶受體發(fā)出，使Smad蛋白磷酸化，并將信號傳導(dǎo)至細胞核，通過激活靶基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用［2］。在腫瘤進展過程中，這種作用模式會影響上皮或間質(zhì)蛋白表達，促進癌細胞發(fā)生上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。鼠雙微體2（MDM2）是E3泛素連接酶RING家族成員之一，參與多種人體生命活動，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［3］。MDM2在肺腺癌組織中表達升高，與肺癌的進展和化療耐藥性等多個機制有關(guān)。2020年9月—2022年3月，本研究觀察了肺腺癌組織中TGF-β1和MDM2的表達變化，并探討二者與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為研究肺腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新型腫瘤標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準：①經(jīng)外科手術(shù)切除且病理檢查確診為肺腺癌；②術(shù)前未接受過放化療及免疫治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準：①伴有嚴重感染或肝、腎功能嚴重異常；②合并其他惡性腫瘤或存在其他惡性腫瘤病史；③手術(shù)切除術(shù)后、術(shù)后輔助治療開始前出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)、進展甚至死亡。選取同期我院收治并符合上述標(biāo)準的肺腺癌患者60例，術(shù)中收集其肺腺癌組織和癌旁正常肺組織（距癌組織邊緣＞6 cm，病理證實為正常組織）各60例份。60例肺腺癌患者中，男21例、女39例，≥60歲36例、＜60歲24例，吸煙22例，TNM分期：Ⅰ期25例、Ⅱ期22例、Ⅲ期13例，組織學(xué)分級：高分化10例、中分化41例、低分化9例，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。本研究通過承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準（LL2021028），患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 肺組織TGF-β1、MDM2蛋白檢測 ①定位檢測：采用免疫熒光法。將肺腺癌組織和癌旁正常肺組織脫水后石蠟包埋，連續(xù)5 μm厚度切片；烤片機65 ℃烤片120 min，常規(guī)脫蠟水化，PBS清洗，微波抗原修復(fù)打開甲醛固定造成的交聯(lián)鍵暴露抗原表位，10%山羊血清封閉；加入TGF-β1、MDM2一抗（稀釋比例分別為1∶ 100、1∶ 300），4 ℃孵育過夜。第二天溫箱復(fù)溫45 min，PBST清洗（曲拉松0.1%），加入熒光二抗，37 ℃孵育1 h，PBST清洗。避光條件下，使用DAPI試劑對細胞核染色，室溫條件下PBST清洗3 min × 3次；滴加抗熒光淬滅劑，中性樹脂稀釋后，封片固定。熒光免疫結(jié)果判定：熒光顯微鏡下根據(jù)熒光的分布位置及強度，確定相應(yīng)抗原是否存在及其所在部位。TGF-β1蛋白使用Alexa Fluor 488-conjugated羊抗兔熒光抗體標(biāo)記信號顯綠色，MDM2使用ATTO 594-conjugated羊抗鼠熒光抗體標(biāo)記信號顯紅色，細胞核使用DAPI染色標(biāo)記信號顯藍色。每張標(biāo)本隨機取5個不重復(fù)的高倍視野，按照熒光強度確定蛋白定位。②半定量檢測：采用免疫組化法。將肺腺癌組織和癌旁正常肺組織脫水后石蠟包埋，連續(xù)5 μm厚度切片，冰凍切片恢復(fù)至室溫，60 ℃烤箱烤片30 min～1 h，或80 ℃烤片15～20 min。將石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水，微波爐火力修復(fù)，自然冷卻或放入通風(fēng)櫥中冷卻至室溫，PBS漂洗5 min × 3次。3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，37 ℃條件下加入10%山羊血清封閉45 min，加入TGF-β1、MDM2一抗（稀釋比例分別為1∶ 100、1∶ 300），4 ℃孵育過夜，BSA代替一抗作為陰性對照；第二天37 ℃復(fù)溫45 min，PBS漂洗5 min × 3次；滴加通用型酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37 ℃溫箱孵育20 min，PBS漂洗5 min × 3次。滴加配置好的DAB染色劑，并進行鏡下實時觀察，以控制最合適的顯色時間。流水沖洗10 min，超純水浸泡1 min，蘇木素復(fù)染細胞核，依次梯度乙醇脫水，二甲苯透明。將中性樹脂用二甲苯稀釋至合適濃度，封片固定。免疫組化結(jié)果判定：每張切片在光學(xué)顯微鏡下連續(xù)觀察10個高倍視野，以細胞核與細胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色定義為陽性，計算陽性率，陽性率＜5%為0分、5%～＜25%為1分、25%～＜50%為2分、50%～＜75%為3分、≥75%為4分；按照著色強度評分：無色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕黑色為3分；兩項評分相乘，0～3為陰性，＞3為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以n（%）表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗。肺腺癌組織中TGF-β1、MDM2蛋白表達的關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織和癌旁正常肺組織TGF-β1、MDM2蛋白定位情況 與癌旁正常肺組織比較，肺腺癌組織中TGF-β1、MDM2蛋白均呈過表達狀態(tài)，TGF-β1大量表達于細胞質(zhì)、少量表達于細胞核，MDM2絕大多數(shù)表達于細胞質(zhì)。見OSID碼圖1。

2.2 肺腺癌組織和癌旁正常肺組織TGF-β1、MDM2蛋白陽性表達率比較 肺腺癌組織TGF-β1蛋白陽性表達42例份（70.00%）、MDM2蛋白陽性表達47例份（78.33%），癌旁正常肺組織分別為24例份（40.00%）、24例份（40.00%）；肺腺癌組織TGF-β1、MDM2蛋白陽性表達率均高于癌旁正常肺組織（P均＜0.05）。見OSID碼圖2。

2.3 不同臨床病理特征的肺腺癌患者癌組織TGF-β1、MDM2蛋白陽性表達率比較 不同性別、年齡、吸煙情況的肺腺癌患者癌組織TGF-β1、MDM2蛋白陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ期及低分化的肺腺癌患者癌組織TGF-β1、MDM2蛋白陽性表達率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期及高中分化者（P均＜0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征的肺腺癌患者癌組織TGF-β1、MDM2蛋白陽性表達情況比較［例（%）］

2.4 肺腺癌組織中TGF-β1、MDM2蛋白表達的關(guān)系 肺腺癌組織中TGF-β1、MDM2蛋白表達呈正相關(guān)關(guān)系（r= 0.539，P＜0.05）。見表2。

表2 肺腺癌組織中TGF-β1、MDM2蛋白表達的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

肺癌早期癥狀并不明顯或典型，其診斷標(biāo)志物尚不明確，導(dǎo)致檢出率較低，部分患者被發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期。而肺癌轉(zhuǎn)移往往在早期就已發(fā)生，導(dǎo)致其病死率一直居高不下。因此，深入研究肺癌的生物學(xué)機制，及時有效地發(fā)現(xiàn)早期診斷標(biāo)志物意義重大。

TGF-β1本質(zhì)上是個多功能的多肽細胞因子，在早期胚胎發(fā)育和成人體內(nèi)代謝平衡的維持中發(fā)揮重要作用。TGF-β1主要以復(fù)合物的形式存在于細胞外基質(zhì)中，只有被激活才能與受體結(jié)合發(fā)揮功能［4］。研究表明，TGF-β信號失調(diào)與腫瘤發(fā)生有關(guān)，且其在腫瘤發(fā)生中的作用有明顯雙向性，在癌前細胞中是腫瘤抑制因子，在癌細胞中是腫瘤促進因子［5］。TGF-β參與腫瘤發(fā)生的典型通路為TGF-β/Smad通路，被外來信號刺激的TGF-β1配體結(jié)合并激活由Ⅰ型/Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸受體（TGF-βRⅠ/Ⅱ）組成的四聚體復(fù)合物，激活的TGF-βRⅠ/Ⅱ隨即磷酸化其下游的R-SmadS （Smad2和Smad3），Smad2和Smad3進一步與 Smad4結(jié)合，形成Smad2/3/4復(fù)合體后共同移位進細胞核，結(jié)合到特定DNA區(qū)域發(fā)揮作用［6］。研究顯示，TGF-β1作為促癌因子，通過該通路經(jīng)誘導(dǎo)EMT的方式促進乳腺癌［7］、肝癌［8］、宮頸癌［9］和甲狀腺癌［10］等多種腫瘤進展，但其在肺腺癌中的報道較少。FAN等［11］研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA lnc01137可靶向增強TGF-β1Ⅰ型受體（TbRⅠ）的多泛素化和蛋白酶體降解，從而抑制TGF-β1/Smad信號通路傳導(dǎo)，阻斷肺腺癌的EMT轉(zhuǎn)化。WU等［12］研究顯示，lnc00941通過直接結(jié)合Smad4蛋白的MH2結(jié)構(gòu)域來阻止Smad4蛋白降解，并與β-TrCP競爭性激活EMT，從而激活TGF-β/Smad2/3信號通路，加速結(jié)腸癌裸鼠的肺轉(zhuǎn)移。除此之外，被有絲分裂蛋白激酶PLK1磷酸化的波形蛋白會進一步激活TGF-β1信號通路，這能使磷酸化Smad2/3蛋白募集到細胞程序性死亡配體1（PD-L1）啟動子上，激發(fā)PD-L1產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯，同時催化肺腺癌發(fā)生EMT和免疫逃逸［13］。在TGF-β1的誘導(dǎo)下，PLK1還可以結(jié)合并磷酸化β-catenin第311位絲氨酸，使β-catenin穩(wěn)定性增強，并與E-鈣黏蛋白分離，推動非小細胞肺癌中EMT的發(fā)生［14］。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌組織中TGF-β1呈過表達狀態(tài)，且其高表達與肺腺癌患者的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這提示TGF-β1促進了肺腺癌的發(fā)生，同時可能推進了肺腺癌的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。

MDM2作為一個E3泛素連接酶，因與腫瘤抑制因子p53存在特異性泛素化結(jié)合位點而成為最重要的p53負性調(diào)節(jié)因子，其含有的環(huán)指結(jié)構(gòu)可促進p53從細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，從而減少p53轉(zhuǎn)錄，而其N端則存在結(jié)合位點標(biāo)記p53，誘導(dǎo)p53的泛素化降解。MDM2在多種腫瘤中過表達，是主要的凋亡抑制蛋白之一，通過參與周期阻滯、細胞凋亡和DNA損傷修復(fù)等途徑促進腫瘤的遷移和侵襲。研究顯示，MDM2抑制劑處理的彌漫性大B淋巴瘤組織細胞周期阻滯在G1期，細胞凋亡率升高、細胞增殖能力受限，同時伴有p53蛋白表達升高［15］。MDM2對腫瘤的誘導(dǎo)作用可能還與基因擴增有關(guān)。LI等［16］研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白S27a（RPS27a）與RPL11在肺腺癌細胞p53的激活調(diào)控中存在相互作用，敲低RPS27a能在減弱該相互作用的同時，增強RPL11與MDM2結(jié)合，從而抑制MDM2對p53的泛素化降解，穩(wěn)定p53，誘導(dǎo)肺腺癌細胞活力被抑制、細胞周期阻滯和細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌組織中MDM2陽性表達率升高，并且與肺腺癌患者的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這提示MDM2可能通過某種途徑促進了肺腺癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化，使其有了更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

既往研究表明，TGF-β1可通過Smad依賴的方式激活MDM2，誘使其表達升高；MDM2也可激活信號通路中Smad的磷酸化水平，促進肺腺癌細胞增殖和EMT，而TGF-β1是主要的EMT誘導(dǎo)因子，因此EMT節(jié)點蛋白可能是二者聯(lián)系的橋梁［17］。TGF-β1最重要的靶分子之一Snail是E-鈣黏蛋白的強阻遏因子。Snail蛋白氨基末端存在一個高度保守的SNAG轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域，可特異性結(jié)合靶基因上游調(diào)控區(qū)，以起到特異性抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用。因此，Snail作為轉(zhuǎn)錄抑制因子在肺癌等多種腫瘤中存在異常表達。國外研究報道，Snail的SNAG結(jié)構(gòu)域可以與E-鈣黏蛋白的CDH1啟動子區(qū)域偶聯(lián)，通過和組蛋白脫乙酰酶（HDAC）形成多分子復(fù)合物，從而阻滯E-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄而抑制其表達［18］。TGF-β1異常激活可促進Snail表達，進而使E-鈣黏蛋白表達降低，而沉默MDM2會使E-鈣黏蛋白表達升高和EMT進程受阻，提示二者在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用存在聯(lián)系。目前，關(guān)于TGF-β1和MDM2是否存在直接聯(lián)系鮮見報道。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌組織中TGF-β1和MDM2的表達呈正相關(guān)關(guān)系。這說明TGF-β1和MDM2或許相互影響，共同促進肺腺癌的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化。其機制有兩種可能：一是TGF-β1可能存在特異性泛素化結(jié)合位點，受MDM2泛素化調(diào)節(jié)而影響腫瘤進程，兩者同時高表達可能是相互促進的結(jié)果；二是TGF-β1在肺腺癌中的過度表達可通過異常激活Smad，使得MDM2表達增加，同時影響E-鈣黏蛋白和Snail的功能及表達情況，使肺腺癌細胞進一步發(fā)生EMT，進而導(dǎo)致肺腺癌惡性進展的表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，肺腺癌組織中TGF-β1、MDM2蛋白陽性表達率均升高，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ期及低分化的肺腺癌組織升高更明顯，二者可能共同參與了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體機制仍有待進一步研究，本研究結(jié)果或可為肺腺癌分子靶向治療提供新的理論支持。