桑亞茹，張李娜，方瑩，周平輝，韓躍峰

蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，安徽 蚌埠 233000

面神經是一種包含運動、感覺的復合神經，同時控制著面部表情肌、面部感覺以及腺體的分泌，在人類語言交流和非語言交流中具有重要作用［1］。盡管面神經損傷不會危及生命，但是其功能喪失會導致面部表情及吞咽功能障礙，不僅會影響患者的社會生活，也會對其精神健康產生重大影響［2］。目前，臨床上對于面神經損傷多采取外科手術治療和保守治療，其中外科手術治療可用性有限，且額外的手術干預可能會對面神經造成進一步損傷［3］。因此，面神經損傷的保守治療對于損傷神經的恢復愈發(fā)重要［4］。目前，通過調控面神經損傷后周圍的炎癥免疫微環(huán)境來促進面神經修復逐漸成為面神經損傷保守治療的研究重點。富血小板血漿（PRP）是自體血液經多次離心后獲得的血小板濃縮物，血小板被激活后可以釋放血小板衍生生長因子（PDGF）、胰島素樣生長因子1（IGF-1）、表皮生長因子（EGF）、血管內皮生長因子（VEGF）等多種生長因子，從而調控炎癥免疫微環(huán)境，并促進細胞有絲分裂和組織再生［5-6］。聚焦式低強度脈沖超聲（FLIPUS）是一種特定類型的超聲，具有低強度輸送并以脈沖波模式輸出的特點，已被證明是一種可以用于治療的非侵入性物理刺激［7］。但是，目前關于PRP局部注射聯合FLIPUS對面神經損傷的修復作用尚未可知。為此，我們于2023年4月—5月進行了如下研究，為面神經損傷的保守治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：健康雄性SD大鼠28只，8周齡，體質量250 g；置于18～20 ℃恒溫環(huán)境及12 h光/暗循環(huán)的清潔動物房內，按時給予充足的食物和水；本研究通過蚌埠醫(yī)學院動物實驗倫理委員會批準［倫動科批字（2022）第259號］。主要試劑及儀器：異氟烷吸入麻醉劑購自深圳瑞沃德生命科技有限公司，超聲波治療儀HANIL-TM HS-501購自韓國HANIL-TM公司，肌電誘發(fā)電位儀MEB-9404C購自日本光電公司，R500通用型小動物麻醉機購自深圳瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 PRP制備 采用二次離心法。取健康雄性SD大鼠8只，吸入異氟烷誘導并維持麻醉，剃除前胸部毛發(fā)，消毒后常規(guī)采血針經心臟穿刺抽吸動脈血10 mL，處死大鼠。將全血合并到含有3.8%檸檬酸鈉的試管中（血液∶ 檸檬酸鈉為9∶ 1），取抗凝血液10 μL于玻璃試管中，加入血小板稀釋劑90 μL，混勻后靜置10 min，高倍鏡下進行血小板計數。取剩余部分動脈血，室溫下1 000 r/min離心15 min，使用移液管吸取上清液及交界面以下2 mm的全部液體至另一支離心管中；3 000 r/min離心10 min，獲得貧血小板血漿（PPP）和含有血小板濃縮物的顆粒，吸出PPP后的溶液即為PRP。室溫條件下將PRP在旋轉平臺上孵育30 min，以消除血小板結塊；取PRP 10 μL于玻璃試管中，加入血小板稀釋劑90 μL，混勻后靜置10 min，高倍鏡下進行血小板計數。每次制備的PRP均進行血小板計數，并與全血血小板計數進行比較，PRP中的血小板最終濃度約為全血血小板濃度的3倍或3倍以上才可用于后續(xù)實驗。每1 mL PRP中加入10% CaCl2活化劑50 μL，混勻后37 ℃條件下孵育1 h，以產生活化的PRP；4 ℃條件下，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，-20 ℃保存［8］。

1.3 面神經損傷模型建立及PRP、FLIPUS處理將20只健康雄性SD大鼠隨機分為模型組、PRP組、FLIPUS組及PRP + FLIPUS組，每組5只。各組均建立右側面神經損傷模型，方法如下：將大鼠吸入異氟烷麻醉誘導后，置于左側臥位，剃除右側面神經對應區(qū)域的毛發(fā)，碘伏消毒后沿耳后作一1.5 cm的弧形切口，逐層鈍性分離頸部肌肉，識別斜方肌肌腱，進一步暴露右側面神經主干，并進行鈍性解剖［9］；文氏鉗鉗夾右側面神經主干30 s，并重復該步驟以覆蓋遠端部分，鉗夾的面神經主干區(qū)域呈半透明，但面神經主干并未破裂；碘伏沖洗切口后，生理鹽水沖洗2次，縫合切口；待大鼠蘇醒后進行瞬目反射和胡須運動的行為學評估，以確保建模成功［10］。PRP組縫合切口前取PRP 50 μL浸漬受損面神經主干，然后縫合切口，并對神經損傷部位進行標記，其后采用局部注射的方法給予PRP 50 μL，2次/周。FLIPUS組在縫合切口并對神經損傷部位進行標記后，對面神經損傷處進行FLIPUS治療10 min，1次/天，參數設置：脈沖占空比20%、頻率1 MHz、功率密度300 mW/cm2。PRP + FLIPUS組參照上法給予PRP局部注射及FLIPUS治療。模型組僅以特殊縫合標記面神經損傷部位，不予特殊處理。各組療程均為28 d。

1.4 損傷面神經恢復的行為學觀察 各組術后每周于固定時間由兩名觀察者獨立進行行為學評估，包括胡須運動和瞬目反射［9］。胡須運動評分標準：胡須無運動且胡須位于后位為1分，胡須輕微顫抖且胡須位于后位為2分，胡須明顯顫抖且胡須位于后位為3分，胡須正常運動但胡須位于后位為4分，胡須對稱運動且胡須位于前位為5分。瞬目反射評分標準：無眨眼和閉眼為1分，眼輪匝肌收縮但無眨眼反射為2分，通過眨眼反射可以閉合50%的眼睛為3分，通過眨眼反射可以閉合75%的眼睛為4分，完全閉眼和存在眨眼反射為5分。行為學評分越高提示大鼠面神經功能恢復越好。

1.5 損傷面神經最大復合肌肉動作電位（CMAP）振幅測算 各組術前及術后第28天，使用肌電誘發(fā)電位儀行右側面神經電生理檢查。各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，將雙極針記錄電極插入大鼠觸須肌墊，接地電極插入大鼠背部，雙極刺激電極置于接近面神經從莖乳孔的出口點；對大鼠給予刺激時間為0.1 ms的刺激脈沖以產生CMAP，以達到最大CMAP振幅所需水平以上20%的電流進行輸送，確定超分子刺激。在超分子刺激下記錄波形，通過EMG軟件記錄超分子刺激下的最大CMAP振幅，計算R值。R值 = 術后最大CMAP振幅/術前最大CMAP振幅，最大CMAP振幅及R值越大越高提示面神經功能越好。各組大鼠右側面神經電生理檢查均由同一位專業(yè)人員獨立操作，重復3次后取平均值［11］。

1.6 損傷面神經節(jié)段組織病理學觀察 各組右側面神經電生理檢查結束后，均采用腹腔注射高劑量10%水合氯醛的方法處死。經原耳后切口再次進行切開，并逐層鈍性分離頸部肌肉，暴露右側面神經主干，取出從損傷部位到遠端約0.6 cm的神經節(jié)段。標記神經節(jié)段的方向后，采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片。HE染色后，40倍光學顯微鏡下觀察損傷面神經組織的神經束變性、脫髓鞘、軸突空泡化程度。每張切片隨機選取10個不同部分的軸突，采用ImagePro Plus軟件記錄單位面積的軸突數量、直徑及面積［12］。

1.7 統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件。計量資料采用S-W法檢驗正態(tài)性，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠術后1～4周行為學評分比較 各組大鼠術后1～4周瞬目反射及胡須運動評分比較P均＞0.05。見表1、2。行為學評分后各組大鼠均死亡1只，后續(xù)研究每組4只。

表1 各組大鼠術后1～4周瞬目反射評分比較［分，M（P25，P75）］

2.2 各組大鼠手術前后損傷面神經最大CMAP振幅及R值比較 與同組術前比較，各組大鼠術后損傷面神經的最大CMAP振幅均降低（P均＜0.05）。與模型組比較，PRP組、FLIPUS組及PRP +FLIPUS組大鼠術后損傷面神經的最大CMAP振幅及R值均升高（P均＜0.05），PRP組、FLIPUS組及PRP + FLIPUS組比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表3、OSID碼圖1。

表3 各組大鼠手術前后損傷面神經最大CMAP振幅及R值比較［± s/M（P25，P75）］

表3 各組大鼠手術前后損傷面神經最大CMAP振幅及R值比較［± s/M（P25，P75）］

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別模型組PRP組FLIPUS組PRP + FLIPUS組R值0.10 ± 0.05 0.29 ± 0.04*0.29 ± 0.03*0.31 ± 0.08*n4 4 4 4術前最大CMAP振幅（mV）9.50（5.78，10.00）7.50（7.29， 7.93）6.75（5.93， 8.54）7.72（6.87， 9.22）術后最大CMAP振幅（mV）0.65（0.58， 1.19）2.25（1.81， 2.44） *1.97（1.64， 2.59） *2.38（2.03， 2.67） *

2.3 各組大鼠損傷面神經節(jié)段組織病理情況比較 與模型組比較，PRP組、FLIPUS組及PRP +FLIPUS組神經束變性、脫髓鞘及軸突空泡化程度減輕，再生軸突增多且神經纖維排列更有序（OSID碼圖2）。與模型組比較，PRP組、FLIPUS組及PRP + FLIPUS組大鼠損傷面神經節(jié)段組織單位面積內的軸突數量均升高（P均＜0.05），PRP組、FLIPUS組及PRP + FLIPUS組比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。PRP組大鼠損傷面神經節(jié)段組織單位面積內的軸突直徑、軸突面積均高于模型組、FLIPUS組、PRP + FLIPUS組（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠損傷面神經節(jié)段組織單位面積內的軸突數量、直徑及面積比較［± s/M（P25，P75）］

表4 各組大鼠損傷面神經節(jié)段組織單位面積內的軸突數量、直徑及面積比較［± s/M（P25，P75）］

注：與模型組比較，*P＜0.05；與PRP組比較，#P＜0.05。

組別模型組PRP組FLIPUS組PRP + FLIPUS組軸突面積（μm2）0.71（0.63， 0.85）1.04（0.82， 1.50）*0.57（0.47， 0.77）#0.64（0.49， 0.91）#n4 4 4 4軸突數量（個）52.55 ± 19.35 72.48 ± 26.69*72.03 ± 27.06*68.48 ± 22.78*軸突直徑（μm）0.92（0.82， 0.98）1.14（0.97， 1.26）*0.80（0.74， 0.94）#0.86（0.75， 1.06）#

3 討論

面神經分支解剖位置表淺，缺乏軟組織及骨骼的保護，同時其分支分布廣泛且解剖位置變異較大，這些因素導致面神經在頜面部外傷及頭頸外科手術中容易受到損傷［13］。面神經損傷后會引起包括干眼癥、角膜炎、言語和發(fā)音障礙、進食困難、面部表情障礙等多種并發(fā)癥，嚴重影響患者的心理健康和日常生活［14］。因此，如何有效治療面神經損傷成為了人們愈發(fā)關注的問題，也是臨床上面臨的重要難題。研究表明，神經損傷程度可以分為五個級別，其中Ⅰ、Ⅱ級神經損傷的神經內膜管保持完整，神經再生是完全的，而Ⅲ、Ⅴ級神經損傷程度從神經束內神經纖維中斷到神經完全離斷不等。外周神經治療旨在恢復受損神經元的結構和功能完整性，因此臨床上針對Ⅰ、Ⅱ級神經損傷主要采用非手術治療的方法來促進神經的再生，Ⅲ、Ⅴ級神經損傷則主要通過外科手術縫合和生物輔助來進行治療［15］。但由于自體移植物獲取困難、手術二次創(chuàng)傷可能、生物材料的排斥反應等多種因素，限制了手術治療在面神經損傷治療中的應用。

神經損傷的修復和再生是一個十分復雜的過程，近年來隨著炎癥微環(huán)境和生長因子在神經修復中的作用逐漸得到認識，多種治療面神經損傷的非手術保守治療方法的有效性也逐漸得到證實［16］。這些非手術保守治療不僅可以單獨用于神經損傷的治療，還可以在神經損傷手術治療后作為輔助治療，成為未來臨床上神經損傷治療的主要方向。PRP是全血經離心得到的富含血小板的血漿，富含多種高濃度生長因子，且各種因子所占的比例與體內正常生長因子的比例相似，從而具有最佳的協同作用。PRP無疾病傳染及免疫排斥的風險，且制備簡單，國內外已有多種類型的PRP制備儀器［17］。WANG等［5］研究顯示，中等濃度PRP（4.5～6.5倍PRP）和高濃度PRP（7.5～8.5倍）均可以促進坐骨神經的再生。FLIPUS強度遠低于傳統超聲，并以低強度、脈沖式模式給予靶目標以熱效應、空化效應及機械效應等無創(chuàng)性物理及生物刺激，從而發(fā)揮治療作用。研究表明，FLIPUS可以改善順鉑誘導的坐骨神經功能障礙和神經變性［18］。REN等［19］研究表明，FLIPUS可以通過增強GSK-3β/β-catenin信號通路，升高細胞周期蛋白D1表達，從而促進雪旺細胞增殖。但目前PRP聯合FLIPUS是否也能有效加速損傷早期面神經修復尚未可知。

本研究結果顯示，各組大鼠術后1～4周瞬目反射及胡須運動評分比較差異均無統計學意義，可能與樣本數量少有關；與模型組比較，PRP組、FLIPUS組及PRP + FLIPUS組大鼠術后損傷面神經的最大CMAP振幅及R值均升高，而PRP組、FLIPUS組及PRP + FLIPUS組比較差異無統計學意義，提示單獨及聯合應用PRP局部注射和FLIPUS均有助于恢復損傷面神經的電生理，且效果相當。本研究病理觀察結果顯示，與模型組比較，PRP組、FLIPUS組及PRP + FLIPUS組神經束變性、脫髓鞘及軸突空泡化程度減輕，再生軸突增多且神經纖維排列更有序，且大鼠損傷面神經節(jié)段組織單位面積內的軸突數量均升高，提示單獨及聯合應用PRP局部注射和FLIPUS均有助于促進面神經的再生，且效果相當。

綜上所述，單獨應用FLIPUS及PRP局部注射即可有效修復大鼠面神經損傷，且效果相當，二者聯合應用并沒有協同作用，為臨床治療外周神經損傷提供了一些理論依據。但本研究中沒有確定PRP治療的最佳給藥條件及精確注射部位，且FLIPUS治療的最佳強度、最佳治療時間也有待于進一步研究。