蔣義碧，陳鑫，舒藝璇，鄭曉梅

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646099

腦出血（ICH）是一種發(fā)病率、病死率、致殘率均較高的腦血管疾病，除原發(fā)性腦損傷之外，ICH引起的繼發(fā)性腦損傷（SBI）是影響患者預(yù)后的主要原因［1］。研究顯示，ICH后SBI的發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，炎癥小體激活可釋放大量炎癥因子，誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而加重腦組織損傷及神經(jīng)細(xì)胞死亡［2］。細(xì)胞焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種高度促炎性程序性細(xì)胞死亡方式，主要由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）/消皮素D（GSDMD）經(jīng)典焦亡途徑介導(dǎo)，可在細(xì)胞膜上形成孔隙，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂，細(xì)胞內(nèi)炎癥物質(zhì)釋放，引起周圍組織強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，ICH發(fā)生后小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元均可出現(xiàn)焦亡，而抑制細(xì)胞焦亡能夠降低ICH患者的炎癥反應(yīng)，改善其神經(jīng)功能［4］。因此，探究能夠減輕ICH患者炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞焦亡的干預(yù)措施對(duì)于減輕ICH后的SBI具有重要意義。褪黑素是一種主要由松果體合成和分泌的激素，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等多種作用［5］。研究顯示，NLRP3炎癥小體是褪黑素發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，褪黑素可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體，減輕糖尿病小鼠神經(jīng)元焦亡和自噬，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［6-7］。但目前褪黑素對(duì)ICH后SBI的影響及其相關(guān)機(jī)制研究較少，為此我們于2023年3月—10月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康雄性大鼠72只，8～10周齡，體質(zhì)量250～300 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2023-0017，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（川）2023-0065；大鼠飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)清潔，溫度（22 ± 1）℃，濕度50% ± 20%，每12 h晝夜周期循環(huán)，可自由獲取水和食物。主要試劑：褪黑素、褪黑素受體抑制劑Luzindole均購(gòu)自武漢阿拉丁生物有限公司，蘇木素染液、伊紅染液、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白一抗、二抗稀釋液均購(gòu)自美國(guó)Aspen公司，白細(xì)胞介素18（IL-18）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）試劑盒、TUNEL試劑盒均購(gòu)自武漢科鹿生物科技有限公司。主要儀器：熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司，正置熒光拍照顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 ICH大鼠模型建立及褪黑素干預(yù) 將72只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、褪黑素組、抑制劑組，每組18只。模型組、褪黑素組、抑制劑組均采用基底節(jié)注射膠原酶的方法建立ICH模型：大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上，于距中線3.0 mm、前囟后1.0 mm處鉆孔，使用5 μL注射器抽?、餍湍z原酶0.6 U，進(jìn)針深度5.8 mm、注射時(shí)長(zhǎng)5 min，針頭留于原位約10 min后緩慢拔出；骨蠟封閉鉆孔，縫合切口，碘伏消毒［8］。假手術(shù)組僅鉆孔后插入針頭，不注射膠原酶。各組建模后行Longa評(píng)分，評(píng)分1～3分提示建模成功。模型建立成功后，褪黑素組腹腔注射褪黑素30 mg/kg，抑制劑組腹腔注射Luzindole 30 mg/kg，假手術(shù)組、模型組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)給藥3 d。

1.3 神經(jīng)功能損傷評(píng)估 ①改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）：各組分組處理后采用mNSS評(píng)估運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡和反射功能，mNSS越高提示神經(jīng)功能損傷程度越嚴(yán)重。②轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)：各組分組處理后采用轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)評(píng)估肢體協(xié)調(diào)能力。將兩塊擋板相交形成30°夾角，驅(qū)趕大鼠至夾角區(qū)域，觀察大鼠進(jìn)入夾角后向左或向右轉(zhuǎn)身情況，每只測(cè)試10次。向左轉(zhuǎn)身百分比 = 左轉(zhuǎn)身次數(shù)/所有轉(zhuǎn)身次數(shù) × 100%，向左轉(zhuǎn)身百分比越高表示損傷越小。③前肢放置實(shí)驗(yàn)：各組分組處理后采用前肢放置實(shí)驗(yàn)評(píng)估運(yùn)動(dòng)功能。研究人員輕輕抓住大鼠項(xiàng)背部皮膚，使其四肢脫離平面懸空，放松狀態(tài)下以其胡須輕觸桌面邊緣，觀察其左前肢成功放置桌面情況，每只測(cè)試10次。左前肢成功放置率 = 左前肢成功放置次數(shù)/所有放置次數(shù) × 100%，左前肢成功放置率越高表示損傷越小。

1.4 腦組織含水量檢測(cè) 采用干濕比重法。各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)束后抽取尾靜脈血，靜脈注射戊巴比妥鈉150 ～ 200 mg/kg處死，立即分離病灶側(cè)大腦半球，用電子分析天平稱量獲得腦組織濕重。將腦組織在（100 ± 5）℃恒溫電干燥器中干燥48 h，稱量獲得腦組織干重。腦組織含水量 = （濕重 - 干重）/濕重 × 100%。

1.5 腦組織病理觀察 采用HE染色。取各組病灶側(cè)大腦組織，4%多聚甲醛保存并固定24 h，石蠟包埋、切片、烤片，石蠟切片脫蠟、水洗和脫水。進(jìn)行HE染色，中性樹(shù)膠封片，200倍顯微鏡下觀察腦組織病理改變。

1.6 血清IL-18、IL-1β水平檢測(cè) 采用ELISA法。取各組大鼠尾靜脈血，4 ℃條件下3 000 r/min離心30 min，取上層血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清IL-18、IL-1β水平。

1.7 腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。于冰上取各組病灶側(cè)血腫周圍腦組織約20 mg，加入TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度及純度。使用EnTurbo? SYBR Green PCR Super Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.8 腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。取各組大鼠病灶側(cè)血腫周圍腦組織，加入組織蛋白提取劑，冰浴徹底勻漿并確保勻漿液完全裂解。4 ℃條件下，12 000 g/min離心10 min，收集上清液，采用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。制備蛋白質(zhì)樣品，取30 μg蛋白，使用10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入NLRP3、Caspase-1、GSDMD一抗（稀釋比例均為1∶ 1 000），4 ℃搖床孵育過(guò)夜，加入稀釋后的二抗，室溫條件下孵育1 h。ECL發(fā)光顯影，Image J軟件檢測(cè)條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 腦組織細(xì)胞焦亡情況觀察 ①GSDMD陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量：采用雙重免疫熒光染色。取各組大鼠病灶側(cè)血腫周圍腦組織，石蠟包埋后進(jìn)行切片，脫蠟至水，置于檸檬酸鹽緩沖液中。微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，加入3%牛血清白蛋白孵育2 h，加入IBA-1、GSDMD一抗（稀釋比例均為1∶ 200）孵育過(guò)夜，次日PBS沖洗5 min × 3次。加入二抗，室溫避光孵育40 min，PBS沖洗5 min × 3次。滴加DAPI染核，室溫避光孵育20 min。抗熒光淬滅封片劑封片，正置熒光顯微鏡下觀察IBA-1與GSDMD共表達(dá)情況并拍照。使用Image J軟件記錄并分析數(shù)字圖像，對(duì)1 mm2內(nèi)的GSDMD陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。②TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率：采用TUNEL法。取各組大鼠病灶側(cè)血腫周圍腦組織石蠟切片，脫蠟至水；配制工作液，37 ℃水浴鍋孵育20 min；配置破膜液，室溫孵育10 min。取TUNEL試劑盒內(nèi)的TdT酶、CF488-dUTP綠光反應(yīng)液、EB平衡緩沖液，按1∶ 5∶ 50的比例進(jìn)行混合，37 ℃避光孵育1.5 h；滴加DAPI染核，室溫避光孵育30 min。抗熒光淬滅封片劑封片，顯微鏡下觀察拍照，計(jì)數(shù)橫斷面中的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率 = TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS27.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用K-S法檢驗(yàn)正態(tài)性，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本LSD-t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷相關(guān)指標(biāo)及腦組織含水量比較 假手術(shù)組、褪黑素組、抑制劑組、模型組大鼠mNSS及腦組織含水量均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。與假手術(shù)組比較，褪黑素組、抑制劑組、模型組向左轉(zhuǎn)身百分比及左前肢成功放置率均降低（P均＜0.05）；與模型組和抑制劑組比較，褪黑素組向左轉(zhuǎn)身百分比及左前肢成功放置率均升高（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠mNSS、向左轉(zhuǎn)身百分比、左前肢成功放置率及腦組織含水量比較（± s）

表1 各組大鼠mNSS、向左轉(zhuǎn)身百分比、左前肢成功放置率及腦組織含水量比較（± s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與褪黑素組比較，△P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組褪黑素組抑制劑組腦組織含水量（%）77.32 ± 1.35 85.88 ± 1.45*79.67 ± 1.40*#82.58 ± 1.50*#△n 18 18 18 18 mNSS（分）1.83 ± 0.75 10.00 ± 1.41*6.17 ± 1.17*#8.00 ± 1.41*#△向左轉(zhuǎn)身百分比（%）58.33 ± 7.53 28.33 ± 7.53*46.17 ± 8.67*#33.33 ± 10.33*△左前肢成功放置率（%）73.33 ± 10.33 31.67 ± 7.53*48.33 ± 7.53*#35.00 ± 10.49*△

2.2 各組大鼠腦組織病理情況比較 假手術(shù)組細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，排列整齊，分布均一，染色均勻；模型組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，神經(jīng)細(xì)胞核消失，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)染色加深；與模型組比較，褪黑素組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞腫脹減輕，細(xì)胞排列相對(duì)整齊，細(xì)胞固縮、溶解減少；與褪黑素組比較，抑制劑組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列分布不均，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加，固縮壞死細(xì)胞數(shù)量增加。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.3 各組大鼠血清IL-18、IL-1β水平比較 假手術(shù)組、褪黑素組、抑制劑組、模型組大鼠血清IL-18、IL-1β水平均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清IL-18、IL-1β水平比較（pg/mL，± s）

表2 各組大鼠血清IL-18、IL-1β水平比較（pg/mL，± s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與褪黑素組比較，△P＜0.05。

IL-1β組別n IL-18 34.30 ± 6.61 90.47 ± 9.37*59.43 ± 6.77*#79.05 ± 6.97*#△假手術(shù)組模型組褪黑素組抑制劑組18 18 18 18 65.45 ± 5.92 148.65 ± 8.97*103.62 ± 7.78*#129.68 ± 8.55*#△

2.4 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白表達(dá)比較 假手術(shù)組、褪黑素組、抑制劑組、模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見(jiàn)表3及OSID碼圖2。

表3 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

表3 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與褪黑素組比較，△P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組褪黑素組抑制劑組n 蛋白0.11 ± 0.02 0.54 ± 0.04*0.21 ± 0.03*#0.37 ± 0.05*#△NLRP3 mRNA 1.03 ± 0.07 4.11 ± 0.25*2.09 ± 0.22*#3.06 ± 0.23*#△蛋白0.14 ± 0.03 0.49 ± 0.04*0.25 ± 0.04*#0.40 ± 0.02*#△18 18 18 18 Caspase-1 mRNA 1.05 ± 0.05 3.44 ± 0.15*2.25 ± 0.13*#2.90 ± 0.18*#△蛋白0.11 ± 0.03 0.69 ± 0.06*0.25 ± 0.06*#0.52 ± 0.05*#△GSDMD mRNA 1.07 ± 0.05 4.54 ± 0.16*2.36 ± 0.25*#3.78 ± 0.21*#△

2.5 各組大鼠腦組織GSDMD陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率比較 假手術(shù)組、褪黑素組、抑制劑組、模型組大鼠腦組織GSDMD陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見(jiàn)表4及OSID碼圖3、4。

表4 各組大鼠腦組織GSDMD陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率比較（± s）

表4 各組大鼠腦組織GSDMD陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率比較（± s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與褪黑素組比較，△P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組褪黑素組抑制劑組n GSDMD陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（個(gè)）TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率（%）18 18 18 18 41.33 ± 6.71 187.67 ± 9.59*131.17 ± 8.89*#165.33 ± 7.58*#△0.93 ± 0.24 11.65 ± 1.48*3.78 ± 1.06*#7.60 ± 1.66*#△

3 討論

ICH后SBI的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，主要與神經(jīng)炎癥反應(yīng)、腦水腫、血液成分沉積的毒性作用等有關(guān)，神經(jīng)炎癥反應(yīng)是加重ICH后SBI病情的關(guān)鍵因素［9］。炎癥小體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與細(xì)胞死亡相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)，NLRP3炎癥小體是目前研究最為廣泛的炎癥小體，既可介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，又可介導(dǎo)細(xì)胞焦亡［10］。細(xì)胞焦亡是一種兼具凋亡和壞死細(xì)胞特征的促炎性程序性細(xì)胞死亡方式，主要病理表現(xiàn)為細(xì)胞膜上出現(xiàn)氣泡狀突出物，形成10～15 nm的小孔隙，同時(shí)也可出現(xiàn)核固縮、DNA斷裂，TUNEL染色陽(yáng)性等；隨后細(xì)胞膜內(nèi)外離子梯度降低，水分子彌散內(nèi)流及細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓增高，細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外，從而引起炎癥反應(yīng)、加重組織損傷［11］。

細(xì)胞焦亡主要由NLRP3/Caspase-1/GSDMD經(jīng)典焦亡途徑及Caspase-4/5/11非經(jīng)典焦亡途徑介導(dǎo)。當(dāng)機(jī)體受到各種病原體及損傷分子模式刺激時(shí)可激活NLRP3，其招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白、Caspase-1前體（Pro-Caspase-1），并與之組裝形成NLRP3炎癥小體，進(jìn)而使細(xì)胞質(zhì)中的Pro-Caspase-1形成具有活性的Caspase-1；隨后，活化的Caspase-1既可將IL-18、IL-1β前體轉(zhuǎn)化為有活性的IL-18和IL-1β，并促進(jìn)其成熟和分泌，又可切割GSDMD蛋白，將其N-端孔隙形成結(jié)構(gòu)域釋放［12］。GSDMD是細(xì)胞焦亡的效應(yīng)蛋白，在細(xì)胞焦亡的各種途徑中均發(fā)揮重要作用，GSDMD的N端片段通過(guò)溶解磷脂或心磷脂在細(xì)胞膜上形成廣泛的氣溶性小孔隙，釋放IL-18、IL-1β等炎癥因子，引起一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［13］。小膠質(zhì)細(xì)胞在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，而ICH后異常激活的小膠質(zhì)細(xì)胞是NLRP3的主要來(lái)源，NLRP3又可以促進(jìn)炎癥因子釋放、誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，進(jìn)而加劇炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，加重腦組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡是ICH后繼發(fā)性腦損傷的治療靶點(diǎn)［14］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠mNSS、向左轉(zhuǎn)身百分比、左前肢成功放置率、腦組織含水量均升高，提示ICH大鼠存在SBI。本研究模型組較假手術(shù)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率升高，表明ICH后發(fā)生了細(xì)胞焦亡；雙重免疫熒光結(jié)果顯示，GSDMD與小膠質(zhì)細(xì)胞定位重合，將ICH后發(fā)生焦亡的細(xì)胞定位在小膠質(zhì)細(xì)胞；此外，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18水平以及腦組織中NLRP3、Caspase-1、DSDMD蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，提示ICH后小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡的機(jī)制可能與NLRP3/Caspase-1/GSDMD經(jīng)典焦亡途徑的激活有關(guān)。

褪黑素是一種廣泛分布于動(dòng)植物中的內(nèi)源性吲哚胺，具有強(qiáng)抗氧化及抗炎作用，且具有親水性及親脂性，能夠輕易跨越血腦屏障，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［15］。目前研究證實(shí)，褪黑素可通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體相關(guān)信號(hào)通路，在多種疾病中發(fā)揮抗焦亡作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB/NLRP3信號(hào)通路，減輕急性高眼壓所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)元焦亡［17］。另外，褪黑素可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路，抑制NLRP3炎癥小體激活，減少心肌細(xì)胞焦亡，發(fā)揮心臟保護(hù)作用［18］。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中，褪黑素通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路而抑制NLRP3/GSDMD通路，有效減輕肺泡損傷、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺水腫，從而減輕細(xì)胞焦亡、提高小鼠存活率［19］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，褪黑素組大鼠神經(jīng)功能損傷與腦水腫減輕，固縮壞死細(xì)胞及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，提示褪黑素可以改善ICH后的SBI，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；褪黑素組較模型組腦組織焦亡相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)均降低，血清IL-18、IL-1β等炎癥因子水平及TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率、GSDMD陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均降低，提示褪黑素可抑制ICH大鼠腦組織細(xì)胞經(jīng)典焦亡通路，減少小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡。另外本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，褪黑素組ICH大鼠神經(jīng)功能損傷與腦水腫減輕、固縮壞死細(xì)胞及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，故推測(cè)褪黑素可能通過(guò)抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD細(xì)胞焦亡通路，減少促炎因子釋放及小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡，從而改善ICH后SBI，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

Luzindole為褪黑素膜結(jié)合位點(diǎn)MT1/MT2受體抑制劑。為進(jìn)一步證明褪黑素能否改善ICH后SBI，以及其機(jī)制是否與NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡途徑有關(guān)，本研究對(duì)ICH大鼠予以褪黑素受體抑制劑Luzindole干預(yù)處理。結(jié)果顯示，與褪黑素組相比，抑制劑組大鼠神經(jīng)功能損傷及腦水腫加重，血清炎癥因子水平及腦組織焦亡相關(guān)蛋白、mRNA表達(dá)均升高，提示抑制褪黑素受體后可加重ICH大鼠后的SBI，增加炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡。此外，褪黑素受體還存在核結(jié)合位點(diǎn)，包括類視黃醇孤兒受體α（RORα）和類視黃醇Z受體家族的孤兒受體（RZR），其與細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此在本研究中，與模型組比較，抑制劑組可表現(xiàn)出改善神經(jīng)損傷及減輕細(xì)胞焦亡的作用，考慮與褪黑素核結(jié)合相關(guān)受體發(fā)揮作用有關(guān)。

綜上所述，褪黑素腹腔注射可減輕ICH大鼠的SBI情況，其機(jī)制可能與抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號(hào)通路而減少小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡及減輕神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)有關(guān)。但未來(lái)仍需對(duì)該通路上游信號(hào)的具體調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探索，另外如何抑制焦亡效應(yīng)蛋白GSDMD表達(dá)而減輕細(xì)胞焦亡，也是研究方向之一。