賈莉莉，喻文立，張濤，呂丹

1 天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津 300192；2 南開大學生命科學院；3 天津市第一中心醫(yī)院疼痛科

肝缺血再灌注（HIR）是肝移植手術的重要病理生理過程，嚴重的缺血再灌注損傷可導致肝臟本身和遠隔臟器受損。腦損傷是兒童肝移植術后常見并發(fā)癥之一，其嚴重程度及繼發(fā)病死率均高于成人肝移植，且合并術后神經系統(tǒng)并發(fā)癥的患兒預后更差。本課題組前期觀察了兒童肝移植圍手術期的血清腦損傷標志物，結果顯示兒童肝移植術中血清星形膠質源性蛋白（S100β）及神經特異性烯醇化酶（NSE）水平約為術前基線值的3倍；進一步通過貝利嬰幼兒發(fā)展量表評估患兒術后2周的認知功能，結果顯示其智力發(fā)展指數(shù)和運動發(fā)展指數(shù)較術前下降；這提示兒童肝移植術后存在腦損傷，并可能造成認知功能障礙。麻醉和手術可導致老年小鼠血腦屏障（BBB）通透性增加，可能與老年小鼠遠期認知功能障礙有關［1］。研究顯示，幼鼠HIR可導致遠期空間記憶學習能力下降［2］，但其機制是否與BBB通透性有關尚未可知。2022年11月—12月，本研究觀察了HIR對幼鼠BBB通透性及腦組織細胞凋亡的影響，為兒童肝移植術后腦損傷的預防提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：健康清潔級C57BL/6幼鼠24只，2周齡，性別不限，體質量6～8 g，購自解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，飼養(yǎng)于恒濕恒溫、12 h/12 h晝夜交替的環(huán)境中，自由攝取食物和水。主要試劑：BBB緊密連接蛋白相關指標閉合蛋白（Claudin）、咬合蛋白（Occludin）、β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）、緊密連接蛋白1（ZO-1）蛋白檢測試劑盒均購自美國CST公司，山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物分組及HIR處理方法 選擇24只健康清潔級C57BL/6幼鼠，術前適應性喂養(yǎng)3～5 d，采用隨機數(shù)字表法分為假手術組、右旋糖苷組10和右旋糖苷40組，每組8只。右旋糖苷10組和右旋糖苷40組均建立HIR模型［3］：術前禁食6 h、自由飲水，采用1.5%～3%異氟烷吸入麻醉，沿腹白線開腹，采用自制拉鉤暴露肝臟及肝門血管；血管夾夾閉肝臟左、中葉的肝蒂造成70%肝缺血，缺血肝葉由紅色轉變?yōu)榘导t色表明建模成功；血流阻斷成功后，濕紗布覆蓋腹部切口，60 min后恢復血流，生理鹽水沖洗腹腔，關腹。右旋糖苷10組、右旋糖苷40組于再灌注60 min后經下腔靜脈注射相對分子量分別為10、40 kD的右旋糖苷。假手術組僅行開關腹、游離血管等操作。各組再灌注后6 h，1.5%～3%異氟烷吸入麻醉，4 ℃條件下將PBS緩沖液經心尖穿刺行血液灌流，斷頭獲取腦組織，選擇部分冰凍切片后迅速放入液氮，其余腦組織-80 ℃保存待檢。

1.3 腦組織BBB通透性觀察 采用免疫熒光染色。取各組-80 ℃保存的腦組織，OCT包埋劑包埋，12 μm厚度切片，-20 ℃冰箱保存。將冰凍切片在預冷的無水甲醇中固定10 min，10%山羊血清室溫封閉1 h。加入一抗室溫孵育2 h，37 ℃回溫1 h，回收一抗，PBS洗滌5 min × 3次。加入二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌5 min × 3次。滴加DAPI工作液染核，室溫反應10～20 min。使用熒光素鈉和FITC標記的右旋糖苷為熒光示蹤劑，共聚焦顯微鏡下觀察并進行拍照，取5個高倍視野，計算右旋糖苷通過率。

1.4 腦組織Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組-80 ℃保存的腦組織，RIPA裂解液進行蛋白裂解，BCA試劑盒進行蛋白定量。取定量好的蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，隨后轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1及內參GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶ 1 000），4 ℃孵育過夜；第二天恢復至室溫30 min，TBST洗滌10 min × 3次，記入山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例均為1∶ 5 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌10 min × 3次，加入ECL顯色液曝光。采用Image J軟件檢測各蛋白條帶灰度值，計算Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相對表達量。

1.5 腦組織細胞凋亡率檢測 采用TUNEL法。取各組完整腦組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制備組織切片。二甲苯及梯度濃度乙醇脫蠟，蒸餾水和PBS緩沖液各洗滌5 min × 3次。0.1% Triton X-100室溫孵育8 min，通透組織，PBS洗滌5 min × 3次。滴加TUNEL染色液，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌5 min × 3次。滴加DAPI染液，細胞核著藍色，凋亡細胞著紅色，熒光顯微鏡下觀察計數(shù)凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用S-W法檢驗正態(tài)性，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組幼鼠腦組織右旋糖苷通過率比較 假手術組、右旋糖苷10組、右旋糖苷40組幼鼠腦組織右旋糖苷通過率分別為0% ± 3%、26% ± 5%、15% ±4%，組間兩兩比較P均＜0.05。

2.2 各組幼鼠腦組織Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相對表達量比較 與假手術組比較，右旋糖苷10組、右旋糖苷40組幼鼠腦組織Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相對表達量均降低（P均＜0.05），右旋糖苷10組、右旋糖苷40組上述指標比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組幼鼠腦組織Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相對表達量比較（± s）

表1 各組幼鼠腦組織Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相對表達量比較（± s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05。

組別假手術組右旋糖苷10組右旋糖苷40組ZO-1 0.98 ± 0.06 0.23 ± 0.03*0.24 ± 0.03*n8 8 8 Claudin 0.85 ± 0.07 0.41 ± 0.03*0.40 ± 0.03*Occludin 1.30 ± 0.11 0.50 ± 0.06*0.52 ± 0.06*β-Catenin 1.21 ± 0.12 0.64 ± 0.08*0.62 ± 0.09*

2.3 各組幼鼠腦組織細胞凋亡率比較 假手術組、右旋糖苷10組、右旋糖苷40組幼鼠腦組織細胞凋亡率分別為9% ± 4%、45% ± 5%、48% ± 5%，右旋糖苷10組、右旋糖苷40組幼鼠腦組織細胞凋亡率均高于假手術組（P均＜0.05），右旋糖苷10組、右旋糖苷40組幼鼠腦組織細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

大腦的海馬區(qū)主管學習和記憶，主要通過調節(jié)神經細胞興奮性來編碼并存儲記憶。研究顯示，神經細胞增殖和分化的“黃金時期”開始于妊娠末期6個月，并延續(xù)至出生后15歲左右；在此階段，樹突、軸突快速生長，突觸大量形成，短期內形成復雜的神經網絡，50%～70%的神經細胞參與了這一過程［4］。生長發(fā)育期的大腦極易受到外界不良刺激的影響，導致信息傳導的神經環(huán)路出現(xiàn)障礙，最終造成遠期認知功能損傷。肝移植患兒手術時間與神經系統(tǒng)生長發(fā)育期重疊，因此圍手術期發(fā)生HIR、免疫抑制劑的應用等多種因素都能對發(fā)育期大腦造成不良影響，這可能是兒童肝移植術后腦損傷程度比成人更嚴重的根源［5-10］。

HIR是肝移植術中不可避免的病理生理過程，也是導致圍手術期心、腦、腎等遠隔臟器損傷的重要原因［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，麻醉和手術打擊可以導致術后認知功能障礙的發(fā)生，其機制可能是BBB被破壞，導致有害物質進入腦組織，從而引起認知功能障礙［13-16］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，幼鼠HIR后出現(xiàn)了遠期認知功能障礙，但是其機制尚不明了［2，16-17］。BBB是保持腦組織內環(huán)境動態(tài)平衡的重要結構，一旦被破壞，循環(huán)中產生的有害物質易穿透BBB，從而對中樞神經系統(tǒng)產生嚴重損傷。大多數(shù)的炎癥因子和有害分子的分子量為10～40 kD，因此本研究選擇觀察小分子量（10 kD）和中分子量（40 kD）右旋糖苷穿過BBB情況，以此反映BBB破壞程度。本研究結果顯示，幼鼠HIR后10、40 kD右旋糖苷均能透過BBB，說明幼鼠HIR后循環(huán)血中大多數(shù)的炎癥分子和有害分子可以進入腦組織，進而導致腦損傷。

緊密連接蛋白是維持BBB完整性的重要因素，許多中樞神經系統(tǒng)BBB的破壞都與緊密連接蛋白表達改變有關。緊密連接蛋白由跨膜蛋白、胞質附著蛋白和細胞骨架蛋白共同組成，跨膜蛋白包括Occludin、Claudin和連接黏附分子（JAM）組成。其中，Claudin是內皮細胞緊密連接的主要蛋白，與BBB通透性的改變密切相關。本研究結果顯示，與假手術組比較，右旋糖苷10組、右旋糖苷40組幼鼠腦組織Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相對表達量均降低，提示BBB遭到了破壞。為了觀察BBB被破壞后腦組織是否受到了損傷，本研究檢測了腦組織細胞凋亡率；結果顯示，與假手術組比較，右旋糖苷10組、右旋糖苷40組幼鼠腦組織細胞凋亡率均升高，提示BBB的破壞參與了HIR后腦損傷的發(fā)生。

綜上所述，HIR會導致幼鼠BBB通透性增加、腦組織細胞凋亡增多，可能與術后腦損傷的發(fā)生有關。本研究立足于臨床兒童肝移植術中最重要的病理生理過程，探究影響術后認知功能障礙的原因。但由于幼鼠年齡和體質量的限制，不能完全模擬臨床兒童肝移植的手術操作過程，這是本研究的主要不足之處。其次，本研究僅探索了HIR對幼鼠BBB通透性的影響，并未探索后續(xù)的具體機制，這也是未來研究的重點。