梁倩倩，荊晶，徐丹，王晶，姜敏，李爭，，3，4

1 新疆醫(yī)科大學第四臨床醫(yī)學院，烏魯木齊 830000；2 新疆國家中醫(yī)藥臨床研究基地；3 新疆呼吸疾病研究重點實驗室；4 新疆呼吸阻塞性肺疾病臨床醫(yī)學研究中心

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種全身系統性、慢性持續(xù)性炎癥疾病，其特征是不可逆和進行性氣流阻塞。COPD患者常常合并高脂血癥、肥胖等代謝紊亂性疾病，肥胖是其常見的共患疾?。?］。COPD患者易發(fā)生內臟脂肪異常堆積，而內臟脂肪的堆積會導致機體發(fā)生代謝性炎癥反應，引起慢性炎癥性疾病的發(fā)生和加重，如冠心病、高血壓、糖尿病等［2］。脂肪組織由皮下脂肪和內臟脂肪構成，脂肪細胞分為白色脂肪細胞、棕色脂肪細胞和米色脂肪細胞，而內臟脂肪主要由白色脂肪細胞構成，分布在附睪、腎周、腸系膜等部位。白色脂肪細胞棕色化能夠產生能量、消耗熱量，減少內臟脂肪異常堆積，從而減輕機體代謝性炎癥水平，對于延緩COPD的疾病進程具有重要意義。益氣固表丸是我院呼吸科經過多年臨床經驗的總結和積累研制而成的院內制劑，主要應用于COPD穩(wěn)定期患者的治療。研究顯示，益氣固表丸能夠降低COPD患者的體脂率、減少其內臟脂肪面積［3］，但是其對COPD患者白色脂肪棕色化及代謝性炎癥反應的影響尚未可知。2022年7月—2023年9月，本研究觀察了益氣固表丸對COPD小鼠內臟脂肪堆積及代謝性炎癥反應的影響，觀察其機制是否與調控白色脂肪棕色化及棕色脂肪細胞激活有關，為中醫(yī)藥防治COPD提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：C57BL/6雄性小鼠30只，8周齡，體質量18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學動物中心，生產許可證號SYCK（新）2018.0002，使用許可證號SYCK（新）2018.0003，本研究通過新疆醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準（IACUC-20211104-30）。藥物：益氣固表丸購自新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院。主要試劑：白色脂肪棕色化相關指標沉默信息調節(jié)因子1（SIRT1）、酶偶聯蛋白1（UCP1）、過氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活因子1α（PGC-1α）抗體及HRP標記的山羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、β-actin抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司，PR結構域蛋白16（PRDM16）抗體購自美國CST公司；炎癥反應相關指標腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，白細胞介素6（IL-6）抗體購自上海碧云天生物科技有限公司，白細胞介素8（IL-8）抗體購自上海愛必信生物科技有限公司。主要儀器：Tanon 4600系列全自動化學發(fā)光/熒光圖像分析系統購自上海天能科技有限公司，LightCycler?96型實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.2 COPD模型建立及益氣固表丸給藥方法 將30只C57BL/6雄性小鼠隨機分為空白對照組、COPD組、益氣固表丸組，每組10只。COPD組、益氣固表丸組采用吸入香煙煙霧暴露聯合香煙煙霧提取物（CSE）腹腔注射的方法建立小鼠COPD模型［4］：將小鼠置于煙草煙霧室中，同時點燃5支香煙、持續(xù)暴露于香煙煙霧中15 min，打開蓋子讓動物休息5 min，結束1個暴露周期；第1、12、23天只需1個暴露周期，同時腹腔注射CSE 0.3 mL/20 g，共28 d?？瞻讓φ战M僅同時間點腹腔注射PBS 0.3 mL/20 g。將益氣固表丸以500丸/500 mL生理鹽水的比例進行溶解，益氣固表丸組于造模第29天給予200 μL灌胃，1次/天，連續(xù)2周；空白對照組及COPD組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.3 Lee's指數及脂體比測算 各組小鼠分組處理后稱取體質量，腹腔注射1%戊己比妥納100 mg/kg進行麻醉，仰臥平放，用游標卡尺測量小鼠鼻尖至肛門的長度（記為體長），Lee's指數 = 體質量（g）1/3×1 000/體長（cm）。使用大頭針眼球取血，擠壓滴至EP管中，3 000 r/min離心15 min，取上層血清于1.5 mL無菌EP管中，-80 ℃冷凍保存。將各組小鼠斷頸后處死，收集內臟（附睪、腎周、腸系膜）脂肪組織并稱取質量，脂體比 = 內臟脂肪組織質量/體質量 ×100%；分別收集左肺組織、附睪周圍的白色脂肪組織和肩胛間區(qū)的棕色脂肪組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片。

1.4 肺組織和白色、棕色脂肪組織病理觀察 采用HE染色。將各組肺組織和白色、棕色脂肪組織石蠟切片依次脫蠟，梯度乙醇脫水。置入蘇木素染液中染色3～5 min，分化液分化、返藍液返藍后流水沖洗。將切片依次置入85%、95%的梯度乙醇中脫水各5 min，置入伊紅染液中染色5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察肺組織病理變化及脂肪組織形態(tài)變化。

1.5 白色脂肪組織棕色化及炎癥反應相關指標蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組小鼠附睪周圍的白色脂肪組織，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上靜置30 min。13 000 r/min離心15 min（離心半徑15 cm），取上清移至另一離心管。使用BCA定量試劑盒測定蛋白濃度，將等量變性蛋白進行SDS-PAGE電泳后分離，轉移至活化的PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16、TNF-α、IL-6、IL-8及內參β-actin一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜10 min ×5次。加入相應的山羊抗兔或抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min × 5次。加入ECL化學發(fā)光顯影液，凝膠成像系統曝光成像。Image J軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.6 白色和棕色脂肪組織UCP1蛋白檢測 采用免疫熒光法。取各組部分白色和棕色脂肪組織石蠟切片，脫蠟至水，脫蠟脫水后蒸餾水洗，抗原修復后自然冷卻。加入牛血清白蛋白室溫封閉，滴加UCP1抗體，切片平放于濕盒內，4 ℃孵育過夜。加入對應的二抗，避光室溫孵育50 min；脫色搖床上晃動，PBS洗滌5 min × 3次。加入DAPI染液復染細胞核，避光室溫孵育10 min。加入自發(fā)熒光淬滅劑B液5 min，流水沖洗10 min。封片后將玻片置于掃描儀下采集圖像，熒光顯微鏡下顯示紅色熒光的區(qū)域定義為UCP1抗體陽性，采用Image J軟件分析UCP1相對熒光強度。

1.7 白色脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法。取附睪周圍的白色脂肪組織，加入TRIzol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以β-actin為內參，使用特定TaqMan熒光探針進行熒光定量PCR檢測。采用2-ΔΔCt法計算TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA相對表達量。

1.8 血清IL-6、IL-8、TNF-α檢測 采用ELISA法。取各組小鼠的眼球血血清，嚴格按照IL-6、IL-8、TNF-α ELISA試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀測量450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.9 統計學方法 采用SPSS26.00統計軟件。計量資料采用S-W法檢驗正態(tài)性，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠Lee's 指數、脂體比比較 與空白對照組比較，COPD組小鼠Lee's指數及脂體比均升高（P均＜0.05）；與COPD組比較，益氣固表丸組小鼠Lee's指數及脂體比均降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠Lee's 指數、脂體比比較（± s）

表1 各組小鼠Lee's 指數、脂體比比較（± s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與COPD組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組COPD組益氣固表丸組脂體比（%）1.00 ± 0.19 1.63 ± 0.29*1.10 ± 0.12#n 10 10 10 Lee's 指數87.94 ± 1.69 100.10 ± 5.49*91.55 ± 2.73#

2.2 各組小鼠肺組織病理情況比較 空白對照組小鼠肺臟表面被覆一層光滑的漿膜，無明顯異常；肺臟實質為肺內支氣管各級分支及其終末的大量肺泡，各級支氣管結構無明顯異常，肺泡壁由單層上皮組成，結構清晰；間質包括肺內結締組織及血管等，均無明顯異常；未見明顯的炎癥細胞浸潤。COPD組小鼠肺組織可見較大面積肺泡壁輕度增厚，肺泡間隔增寬，伴有少量粒細胞浸潤，肺泡大小不一，部分肺泡狹窄，部分肺泡代償性擴張；血管周圍可見少量淋巴細胞散在浸潤，局部肺泡腔內可見少量游離的巨噬細胞、粒細胞。益氣固表丸組小鼠肺臟組織可見小面積肺泡壁增厚，較COPD組肺泡間隔縮短、炎癥細胞浸潤情況減輕。見OSID碼圖1。

2.3 各組小鼠白色、棕色脂肪組織形態(tài)學比較 與空白對照組比較，COPD組白色、棕色脂肪組織內的脂肪細胞體積均增大，細胞內空泡均增多；與COPD組比較，益氣固表丸組白色、棕色脂肪組織內的脂滴減小，呈現出棕色化表現。見OSID碼圖2。

2.4 各組小鼠白色脂肪組織棕色化及炎癥反應相關指標蛋白表達比較 與空白對照組比較，COPD組小鼠白色脂肪組織SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白相對表達量均降低，TNF-α、IL-6、IL-8蛋白相對表達量均升高（P均＜0.05）。與COPD組比較，益氣固表丸組小鼠白色脂肪組織SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白相對表達量均升高，TNF-α、IL-6、IL-8蛋白相對表達量均降低（P均＜0.05）。見表2、OSID碼圖3。

表2 各組小鼠白色脂肪組織棕色化及炎癥反應相關指標蛋白相對表達量比較（± s）

表2 各組小鼠白色脂肪組織棕色化及炎癥反應相關指標蛋白相對表達量比較（± s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與COPD組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組COPD組益氣固表丸組TNF-α 1.00 ± 0.07 1.54 ± 0.12*0.93 ± 0.07#n 10 10 10 SIRT1 0.45 ± 0.20 0.17 ± 0.04*1.32 ± 0.09*PPARγ 0.67 ± 0.02 0.48 ± 0.08*0.62 ± 0.09#UCP1 1.18 ± 0.05 0.33 ± 0.06*0.98 ± 0.34#PGC-1α 1.00 ± 0.12 0.63 ± 0.10*1.23 ± 0.14#PRDM16 1.10 ± 0.16 0.70 ± 0.05*1.11 ± 0.10#IL-6 0.42 ± 0.16 1.05 ± 0.20*0.60 ± 0.04#IL-8 0.62 ± 0.02 1.16 ± 0.09*0.88 ± 0.10*#

2.5 各組小鼠白色、棕色脂肪組織UCP1相對熒光強度比較 與空白對照組比較，COPD組小鼠白色、棕色脂肪組織UCP1相對熒光強度均降低（P均＜0.05）。與COPD組比較，益氣固表丸組小鼠白色、棕色脂肪組織UCP1相對熒光強度均升高（P均＜0.05）。見表3及OSID碼圖4、5。

表3 各組小鼠白色、棕色脂肪組織UCP1相對熒光強度比較（± s）

表3 各組小鼠白色、棕色脂肪組織UCP1相對熒光強度比較（± s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與COPD組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組COPD組益氣固表丸組n 棕色脂肪組織1.00 ± 0.06 0.38 ± 0.06*1.27 ± 0.16*#10 10 10 UCP1相對熒光強度白色脂肪組織1.00 ± 0.05 0.47 ± 0.04*0.74 ± 0.04*#

2.6 各組小鼠白色脂肪組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達比較 與空白對照組比較，COPD組小鼠白色脂肪組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相對表達量均升高（P均＜0.05）。與COPD組比較，益氣固表丸組小鼠白色脂肪組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相對表達量均降低（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠白色脂肪組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相對表達量比較（± s）

表4 各組小鼠白色脂肪組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相對表達量比較（± s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與COPD組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組COPD組益氣固表丸組TNF-α mRNA 1.01 ± 0.17 2.73 ± 0.44*1.04 ± 0.19#n 10 10 10 IL-6 mRNA 1.01 ± 0.17 36.38 ± 5.45*5.94 ± 1.05*#IL-8 mRNA 1.01 ± 0.14 3.92 ± 0.62*2.50 ± 0.54*#

2.7 各組小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平比較 與空白對照組比較，COPD組小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均升高（P均＜0.05）；與COPD組比較，益氣固表丸組小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均降低（P均＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平比較（pg/mL，± s）

表5 各組小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平比較（pg/mL，± s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與COPD組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組COPD組益氣固表丸組TNF-α 17.89 ± 2.88 109.40 ± 5.10*30.58 ± 6.75*#n 10 10 10 IL-6 3.89 ± 0.22 6.88 ± 0.86*5.46 ± 0.42*#IL-8 10.98 ± 1.64 21.44 ± 1.59*13.03 ± 3.91#

3 討論

既往觀點認為，COPD患者基礎代謝率升高、分解代謝亢進可導致患者出現營養(yǎng)不良和體質量降低［5］。但是近年有研究指出，COPD患者中肥胖/超重的比例升高，表現為四肢肌肉減少合并體脂含量升高，以向心性肥胖主要特征［6］。COPD是一種系統性、慢性炎癥疾病，以內臟脂肪過度堆積為特點的腹部肥胖是其主要特征，肥胖可促進機體代謝性炎癥反應，引發(fā)多種慢性疾病的發(fā)生。本課題組前期研究顯示，內臟脂肪組織指數（VAI）與用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼氣量（FEV1）呈倒U型曲線關系，當VAI≥15時二者隨著VAI的升高而降低，這與近年來所提出的“肥胖悖論”存在一致性，可能與內臟脂肪組織過度堆積引發(fā)機體持續(xù)慢性低度炎癥反應有關［2，7］。

內臟脂肪組織主要由白色脂肪組織組成，脂肪細胞具有可逆性表型重新編程的能力，在特定（如寒冷刺激、運動、藥物、過度能量攝入）情況下，白色脂肪細胞會高表達UCP1，轉變?yōu)樽厣珮拥漠a熱細胞來消耗人體攝入的過多能量，從而維持機體能量平衡，該過程稱為“白色脂肪棕色化”［8］。本研究結果顯示，COPD組較空白對照組小鼠脂體比和Lee's指數升高，白色、棕色脂肪細胞體積增大，細胞內空泡及脂滴含量增多，這提示COPD小鼠存在內臟脂肪堆積和棕色脂肪活性被抑制；COPD組白色、棕色脂肪組織UCP1相對熒光強度較空白對照組下降，提示COPD模型小鼠對脂滴的消耗功能下降，這可能是造成COPD小鼠內臟脂肪過度堆積的重要原因之一。本研究結果顯示，COPD小鼠白色脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-8蛋白、mRNA相對表達量及血清水平均升高，提示COPD小鼠內臟脂肪過度堆積與體內炎癥水平升高有關。因此，COPD患者體內維持能量平衡的途徑可能受到抑制，從而導致白色脂肪組織過度堆積，引發(fā)白色脂肪細胞和免疫細胞之間相互作用，使機體產生持續(xù)低度代謝性炎癥反應，最終可能導致氣道高反應狀態(tài)，甚至氣道重塑的發(fā)生［9-13］。

白色脂肪棕色化的調節(jié)過程涉及復雜的調控網絡，多種轉錄因子與信號通路參與其中，其中PPARγ在白色脂肪棕色化中的研究最為深入［14］。PPARγ是細胞核激素受體家族的一種活性配體轉錄蛋白，SIRT1可通過促進PPARγ去乙?；鸢咨咀厣?，從而抑制脂肪組織儲存，并促進脂解以釋放脂肪酸［15］。SIRT1是一種NAD+依賴的蛋白質去乙酰化酶，參與調控脂質代謝、脂肪細胞分化、炎癥、細胞凋亡和衰老等過程［16］。UCP1、PGC-1α、PRDM16是棕色脂肪細胞分化的決定因子，也是促進白色脂肪棕色化的關鍵因子［17-19］。UCP1是一種特定的棕色脂肪細胞標志物，通過解偶聯三磷酸腺苷（ATP）合成的氧化磷酸化來調節(jié)棕色脂肪組織的產熱過程，是參與細胞產熱和能量消耗的直接蛋白［20-21］。PGC-1α是PPARγ轉錄共激活因子，可介導線粒體氧化，并上調棕色脂肪組織UCP1蛋白表達［22］。PPARγ能增加白色脂肪組織中線粒體生物合成，以及棕色脂肪相關基因UCP1和PGC-1α表達，同時能夠募集PRDM16發(fā)揮能量消耗作用，最終促進白色脂肪棕色化［23］。本研究結果顯示，COPD組較空白對照組白色脂肪組織SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白表達均下降，同時IL-6、IL-8、TNF-α蛋白表達升高，這提示可能由于COPD小鼠白色脂肪組織SIRT1低表達，抑制了PPARγ活性，從而導致UCP1、PGC-1α、PRDM16表達下降，阻礙了白色脂肪棕色化及能量消耗過程，引起內臟脂肪異常堆積及高代謝性炎癥狀態(tài)。本研究結果顯示，益氣固表丸組較COPD組脂體比和Lee's指數均降低，白色脂肪細胞體積及脂滴減小，呈現出棕色化表現，棕色脂肪組織也表現出細胞活化狀態(tài)，這提示益氣固表丸可以促進COPD小鼠白色脂肪棕色化過程；益氣固表丸組較COPD組白色脂肪組織中SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16表達均升高，IL-6、IL-8、TNF-α表達均下降。這提示益氣固表丸可能通過SIRT1/PPARγ/UCP1信號通路上調UCP1、PGC-1α、PRDM16表達，啟動能量消耗，促進白色脂肪棕色化過程，抑制COPD小鼠內臟脂肪堆積的同時也降低其代謝性炎癥水平。

綜上所述，益氣固表丸可減輕COPD小鼠的內臟脂肪堆積及代謝性炎癥反應，其機制可能與靶向SIRT1/PPARγ/UCP1信號通路而促進白色脂肪棕色化有關。今后本課題組將進一步明確益氣固表丸對COPD異常脂肪堆積的調控作用，及其對SIRT1/PPARγ/UCP1信號通路分子之間的調控互作關系，深入探討益氣固表丸改善COPD慢性炎癥及相關代謝紊亂的作用機制。