沈小艷，謝孝平，李博文，王志維

武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管外科，武漢 430060

主動(dòng)脈夾層是一種十分危急的主動(dòng)脈疾病，在未得到及時(shí)治療的情況下病死率極高。目前，主動(dòng)脈夾層的治療方法主要是開(kāi)放手術(shù)和介入治療，但由于手術(shù)難度大、治療時(shí)機(jī)晚、病損區(qū)域常累及內(nèi)臟動(dòng)脈，手術(shù)成功率和術(shù)后存活率均較低［1］。因此，深入研究主動(dòng)脈夾層發(fā)生的病理生理機(jī)制，尋找相關(guān)治療靶點(diǎn)對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義。細(xì)胞焦亡是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞程序性死亡方式，消皮素（GSDM）蛋白家族成員可以通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞焦亡、釋放炎癥因子、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等機(jī)制，參與多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展［2-3］。消皮素B（GSDMB）是GSDM蛋白家族成員之一，在細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)中同樣發(fā)揮重要作用。研究表明，GSDMB蛋白與半胱氨酸蛋白酶4（Caspase-4）結(jié)合可增強(qiáng)Caspase-4的活性，促進(jìn)消皮素D（GSDMD）裂解為N-消皮素D（N-GSDMD），而GSDMD和N-GSDMD相關(guān)信號(hào)通路可直接參與細(xì)胞焦亡的調(diào)控，在非典型細(xì)胞焦亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。目前，關(guān)于GSDMB在主動(dòng)脈夾層組織中的表達(dá)變化，以及GSDMB沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HASMCs）焦亡和炎癥反應(yīng)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道，為此我們于2023年5月—11月進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)主動(dòng)脈計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影（CTA）檢查提示急性斯坦福A型主動(dòng)脈夾層；②擬行升主動(dòng)脈置換術(shù)。排除合并遺傳性胸主動(dòng)脈疾病者，如馬凡綜合征、洛伊—迪茨綜合征及先天性結(jié)締組織發(fā)育不全綜合征等。選擇2017年1月—2020年12月武漢大學(xué)人民醫(yī)院收治并符合上述標(biāo)準(zhǔn)的主動(dòng)脈夾層患者8例，男6例、女2例，年齡（55.2 ± 6.5）歲，術(shù)中收集其主動(dòng)脈夾層組織8例份。選擇捐獻(xiàn)心臟的腦死亡患者8例，主動(dòng)脈CTA檢查提示主動(dòng)脈無(wú)病變，男6例、女2例，年齡（51.6 ± 5.8）歲，收集其主動(dòng)脈組織8例份作為正常對(duì)照組織。主動(dòng)脈夾層患者與捐獻(xiàn)者性別構(gòu)成比、年齡均具有可比性（P均＞0.05）。本研究已經(jīng)通過(guò)武漢大學(xué)人民醫(yī)院人類研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（WDRY2020-K230），患者及捐獻(xiàn)者家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞：HASMCs購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，LipofectamineTM3000試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，細(xì)胞焦亡相關(guān)指標(biāo)（GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和內(nèi)參GAPDH一抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，炎癥因子白細(xì)胞介素18（IL-18）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒均購(gòu)自泉州樂(lè)達(dá)啟博生物科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自武漢塞維爾生物有限公司；NC-siRNA和GSDMB-siRNA均由上海生工有限公司合成，空白載體質(zhì)粒和GSDMB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒均購(gòu)自武漢淼靈生物有限公司。

1.3 主動(dòng)脈夾層組織與正常對(duì)照組織GSDMB蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取主動(dòng)脈夾層組織和正常對(duì)照組織，使用組織勻漿機(jī)在低溫條件下進(jìn)行研磨，在4 ℃條件下高速離心，分離出蛋白質(zhì)上清液。將提取的蛋白與上樣緩沖液按照1∶ 4的比例混合，100 ℃加熱10 min使蛋白變性。將蛋白樣本加載到聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上，依次進(jìn)行電泳濃縮和分離，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。加入5%脫脂牛奶封閉2 h，加入GSDMB及內(nèi)參GAPDH一抗孵育過(guò)夜，加入使用HRP標(biāo)記的二抗，孵育1 h。加入ECL化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯影，Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算GSDMB蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 GSDMB基因沉默對(duì)HASMCs焦亡和炎癥反應(yīng)的影響觀察

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 將HASMCs置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使用含有10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待HASMCs處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分為NC-siRNA組、脂多糖（LPS）組、GSDMB-siRNA組、GSDMB-siRNA+LPS組。LPS組和GSDMB-siRNA+LPS組加入1 μg/mL LPS作用24 h，NC-siRNA組、GSDMB-siRNA組、GSDMB-siRNA+LPS組分別使用LipofectamineTM3000試劑轉(zhuǎn)染NC-siRNA、GSDMB-siRNA、NC-siRNA，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 細(xì)胞GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD、MMP-9、MMP-2蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集處理后的各組細(xì)胞，加入RIPA緩沖液裂解10 min，使用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，加入上樣緩沖液混合并高溫變性。以GAPDH為內(nèi)參，參照“1.3”檢測(cè)并計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 細(xì)胞焦亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集處理后的各組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌后離心，加入Binding Buffer 100 μL 進(jìn)行重懸。加入PI 5 μL，室溫避光孵育20 min。加入PBS 400 μL混勻，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞焦亡率。

1.4.4 細(xì)胞上清液IL-18、IL-1β檢測(cè) 采用ELISA法。收集處理后的各組細(xì)胞上清，1 000 r/min離心20 min。在預(yù)先包被IL-18和IL-1β捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，溫浴60 min并徹底洗滌。底物TMB溫浴15 min顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下最終變?yōu)辄S色。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的光密度（OD）值，計(jì)算IL-18、IL-1β水平。

1.5 GSDMB基因過(guò)表達(dá)對(duì)HASMCs焦亡和炎癥反應(yīng)的影響觀察

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 將HASMCs置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使用含有10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待HASMCs處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分為空載質(zhì)粒組、LPS作用組、GSDMB過(guò)表達(dá)組、GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組。LPS作用組和GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組加入1 μg/mL LPS作用24 h，空載質(zhì)粒組、GSDMB過(guò)表達(dá)組、GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組分別使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒、GSDMB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、GSDMB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 細(xì)胞GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD、MMP-9、MMP-2蛋白檢測(cè) 參照“1.4.2”采用Western blotting法檢測(cè)各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5.3 細(xì)胞焦亡檢測(cè) 參照“1.4.3”采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞焦亡率。

1.5.4 細(xì)胞上清液IL-18、IL-1β檢測(cè) 參照“1.4.4”采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-18、IL-1β水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad9.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用S-W法檢驗(yàn)正態(tài)性，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 主動(dòng)脈夾層組織與正常對(duì)照組織GSDMB蛋白表達(dá)比較 主動(dòng)脈夾層組織與正常對(duì)照組織GSDMB蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.88 ± 0.16、0.62 ± 0.15，二者比較P＜0.05。

2.2 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組焦亡相關(guān)指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。

表1 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組焦亡相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

表1 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組焦亡相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

注：與NC-siRNA組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與GSDMB-siRNA組比較，△P＜0.05。

組別NC-siRNA組LPS組GSDMB-siRNA組GSDMB-siRNA+LPS組細(xì)胞焦亡率（%）11.17 ± 1.35 63.07 ± 4.27*11.73 ± 1.73#41.27 ± 2.22*#△GSDMB 0.73 ± 0.12 1.17 ± 0.10*0.34 ± 0.05*#0.78 ± 0.10#△Caspase-4 0.59 ± 0.03 1.06 ± 0.06*0.68 ± 0.15#0.88 ± 0.03*#△GSDMD 0.59 ± 0.03 1.06 ± 0.08*0.67 ± 0.14#0.90 ± 0.02*#△N-GSDMD 0.69 ± 0.17 1.14 ± 0.14*0.75 ± 0.19#0.85 ± 0.08*#

2.3 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)比較見(jiàn)表2。

表2 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

表2 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

注：與NC-siRNA組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與GSDMB-siRNA組比較，△P＜0.05。

組別NC-siRNA組LPS組GSDMB-siRNA組GSDMB-siRNA+LPS組IL-1β（pg/mL）105.30 ± 8.62 285.70 ± 7.02*110.30 ± 5.51#184.00 ± 9.00*#△MMP-9 0.62 ± 0.10 1.07 ± 0.16*0.61 ± 0.10#0.78 ± 0.02#MMP-2 0.60 ± 0.04 1.02 ± 0.04*0.52 ± 0.07#0.54 ± 0.05#IL-18（pg/mL）205.70 ± 16.04 411.00 ± 12.12*213.70 ± 14.29#290.30 ± 19.30*#△

2.4 空載質(zhì)粒組、LPS作用組、GSDMB過(guò)表達(dá)組和GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組焦亡相關(guān)指標(biāo)比較 見(jiàn)表3。

表3 空載質(zhì)粒組、LPS作用組、GSDMB過(guò)表達(dá)組和GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組焦亡相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

表3 空載質(zhì)粒組、LPS作用組、GSDMB過(guò)表達(dá)組和GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組焦亡相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

注：與空載質(zhì)粒組比較，*P＜0.05；與LPS作用組比較，#P＜0.05；與GSDMB過(guò)表達(dá)組比較，△P＜0.05。

組別空載質(zhì)粒組LPS作用組GSDMB過(guò)表達(dá)組GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組細(xì)胞焦亡率（%）11.09 ± 1.27 58.94 ± 3.98*11.73 ± 1.47#76.99 ± 5.28*#△GSDMB 0.57 ± 0.03 0.71 ± 0.05*0.77 ± 0.04*0.98 ± 0.04*#△Caspase-4 0.62 ± 0.02 0.73 ± 0.04*0.64 ± 0.07#0.89 ± 0.05*#△GSDMD 0.72 ± 0.03 0.83 ± 0.01*0.70 ± 0.02#1.08 ± 0.12*#△N-GSDMD 0.50 ± 0.02 0.73 ± 0.04*0.46 ± 0.05#0.99 ± 0.02*#△

2.5 空載質(zhì)粒組、LPS作用組、GSDMB過(guò)表達(dá)組和GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組炎癥相關(guān)指標(biāo)比較 見(jiàn)表4。

表4 空載質(zhì)粒組、LPS作用組、GSDMB過(guò)表達(dá)組和GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

表4 空載質(zhì)粒組、LPS作用組、GSDMB過(guò)表達(dá)組和GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

注：與空載質(zhì)粒組比較，*P＜0.05；與LPS作用組比較，#P＜0.05；與GSDMB過(guò)表達(dá)組比較，△P＜0.05。

組別空載質(zhì)粒組LPS作用組GSDMB過(guò)表達(dá)組GSDMB過(guò)表達(dá)+LPS組IL-1β（pg/mL）114.00 ± 7.55 271.70 ± 15.53*117.00 ± 8.00#327.30 ± 19.60*#△MMP-9 0.32 ± 0.02 0.59 ± 0.03*0.40 ± 0.16#0.86 ± 0.08*#△MMP-2 0.47 ± 0.04 0.58 ± 0.04*0.46 ± 0.04#0.94 ± 0.14*#△IL-18（pg/mL）211.70 ± 12.86 364.00 ± 16.09*209.00 ± 19.08#410.30 ± 13.05*#△

3 討論

主動(dòng)脈夾層是一種致命性大血管疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，主動(dòng)脈中層退行性變是其主要病理特征，表現(xiàn)為血管平滑肌細(xì)胞丟失，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞外基質(zhì)降解等［5］。當(dāng)血管平滑肌細(xì)胞受到損傷、氧化應(yīng)激及炎癥因子等刺激時(shí)，會(huì)激活凋亡、壞死性凋亡和焦亡等多種相關(guān)信號(hào)通路。血管平滑肌細(xì)胞焦亡是主動(dòng)脈夾層的重要發(fā)病機(jī)制之一，脂聯(lián)素通過(guò)靶向上調(diào)miR-133a基因而抑制細(xì)胞焦亡和表型轉(zhuǎn)換，從而減輕主動(dòng)脈夾層形成，其機(jī)制與抑制細(xì)胞焦亡經(jīng)典信號(hào)通路NLRP3/Caspase-1/GSDMD及炎癥因子釋放有關(guān)［6］。GSDMD通過(guò)激活血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激C/EBP同源蛋白（CHOP）信號(hào)通路，促進(jìn)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶 1 （ODC1）表達(dá)及提高腐胺水平，進(jìn)一步加劇平滑肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)［7］。但是，GSDM家族成員GSDMB與主動(dòng)脈夾層及血管平滑肌細(xì)胞的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。

GSDMB是一種GSDM蛋白，是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子之一，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等功能［8］。GSDMB的獨(dú)特之處在于其可以被特定的病原體感染，或被細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)所激活。一旦被激活，GSDMB能促進(jìn)細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄露，包括促炎癥細(xì)胞因子。因此，GSDMB異常表達(dá)或活化可能導(dǎo)致過(guò)度炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加劇疾病的嚴(yán)重程度［9-10］。本研究結(jié)果顯示，主動(dòng)脈夾層組織GSDMB蛋白相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組織；HASMCs經(jīng)LPS作用后GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量及細(xì)胞焦亡率均升高，提示成功使用LPS構(gòu)建HASMCs焦亡模型；該模型轉(zhuǎn)染GSDMB-siRNA后上述指標(biāo)降低，轉(zhuǎn)染GSDMB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后上述指標(biāo)升高，提示敲低GSDMB表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的HASMCs焦亡，而過(guò)表達(dá)GSDMB會(huì)加重LPS誘導(dǎo)的HASMCs焦亡。

研究顯示，GSDMB還可以通過(guò)激活Caspase-4，釋放IL-18和IL-1β等炎癥因子，從而加重炎癥反應(yīng)［11］。本研究結(jié)果顯示，HASMCs經(jīng)LPS作用后MMP-9、MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量及細(xì)胞上清液IL-18、IL-1β水平均升高，提示LPS可刺激HASMCs分泌炎癥因子；該模型轉(zhuǎn)染GSDMB-siRNA后上述指標(biāo)降低，轉(zhuǎn)染GSDMB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后上述指標(biāo)升高，提示敲低GSDMB表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的HASMCs炎癥因子釋放，過(guò)表達(dá)GSDMB表達(dá)可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的HASMCs炎癥因子釋放。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-18、IL-1β均能促進(jìn)MMP-9、MMP-2分泌，而MMP-9、MMP-2可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)主動(dòng)脈壁彈性纖維破裂，從而加速主動(dòng)脈夾層的形成［12-13］。研究顯示，A型主動(dòng)脈夾層患者血清IL-1β水平升高，可通過(guò)促進(jìn)MMP-9表達(dá)，增加主動(dòng)脈夾層破裂的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［14］。此外，IL-1β可通過(guò)促進(jìn)胸主動(dòng)脈夾層小鼠組織MMP-2和MMP-9表達(dá)，改變其主動(dòng)脈壁功能，在胸主動(dòng)脈夾層的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用［15］。因此，我們猜想GSDMB除了參與調(diào)控細(xì)胞焦亡以外，其釋放的炎癥因子可能進(jìn)一步影響HASMCs分泌MMP-2和MMP-9。但是本研究中GSDMB-siRNA組僅GSDMB蛋白相對(duì)表達(dá)量低于NC-siRNA組，GSDMB過(guò)表達(dá)組僅GSDMB蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空載質(zhì)粒組，其他焦亡及炎癥相關(guān)指標(biāo)沒(méi)有明顯改變，提示GSDMB沉默或過(guò)表達(dá)并不會(huì)誘導(dǎo)正常HASMCs發(fā)生焦亡或炎癥反應(yīng)。這可能與在未受到LPS作用時(shí)GSDMB的N端結(jié)構(gòu)域被C端結(jié)構(gòu)域抑制，無(wú)法形成孔道有關(guān)［10］。

綜上所述，人主動(dòng)脈夾層組織GSDMB表達(dá)升高；GSDMB不會(huì)影響正常HASMCs的焦亡和炎癥反應(yīng)，但會(huì)通過(guò)Caspase-4介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑正向調(diào)控LPS誘導(dǎo)的HASMCs細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)。因此，GSDMB是調(diào)控HASMCs焦亡和炎癥反應(yīng)非經(jīng)典途徑的關(guān)鍵分子，為主動(dòng)脈夾層的治療提供了新靶點(diǎn)。