陳松，馬啟超，鮑佳茵，潘保革，許利軍，劉華格，王學(xué)靜,★，陳立功★

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001；2.保定市畜牧工作站，河北保定 071001；3.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071001）

近年來河北部分地區(qū)肉雞關(guān)節(jié)囊腫病發(fā)病率有逐漸增多的趨勢， 患病肉雞飼料利用率下降，淘汰率增高，給肉雞養(yǎng)殖造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。 肉雞腿病的發(fā)病原因很多，其中細(xì)菌感染是主要原因之一。 肉雞關(guān)節(jié)囊腫中分離的細(xì)菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌，但尚無關(guān)于分離糞腸球菌的報道。 通常認(rèn)為，細(xì)菌所攜帶的毒力因子在疾病發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用，已報道的糞腸球菌毒力因子主要包括溶血素（cyl）、表面蛋白（esp）、明膠酶E（gelE）、聚集物質(zhì)（asal）、心內(nèi)膜炎抗原（efaA）、膠原蛋白黏附素（ace）、透明質(zhì)酸（Hyl）。 筆者自保定某雞場患關(guān)節(jié)囊腫肉雞的關(guān)節(jié)液中分離鑒定到一株糞腸球菌，該結(jié)果可為肉雞關(guān)節(jié)囊腫的防控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物材料

于2022 年6 月從保定某雞場采集肉雞關(guān)節(jié)囊腫液；糞腸球菌質(zhì)控菌（BNCC 102668）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。 BALB/c 小鼠購于河北伊維沃生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基、 胰蛋白胨大豆肉湯購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭氏染色液購自山東康華生物醫(yī)療科技股份有限公司；DL2000 DNA Marker、Premix TaqTM購自寶生物工程（大連）有限公司；快速DNA 提取檢測試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；50×TAE緩沖液、瓊脂糖購自索萊寶科技（北京）有限公司。

1.3 細(xì)菌分離鑒定

1.3.1 細(xì)菌分離純化與染色鏡檢

2 毫升胰蛋白胨大豆肉湯與500 微升肉雞關(guān)節(jié)囊腫液混合， 置37℃震蕩培養(yǎng)24 小時；取肉湯培養(yǎng)物在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上分區(qū)劃線，瓊脂平板置于37℃培養(yǎng)18～36 小時；挑取單個菌落在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上再次純化。判定已純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢、拍照。

1.3.2 細(xì)菌16S rDNA 遺傳進(jìn)化分析

擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴(kuò)增片段大小為1400bp。 用快速DNA 提取檢測試劑盒提取分離純化的細(xì)菌DNA。 PCR 擴(kuò)增體系依照快速DNA提取檢測試劑盒進(jìn)行， 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30 秒，55℃退火30 秒，72℃延伸1 分鐘，30 個循環(huán)；72℃終延伸10 分鐘。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR 陽性產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對。 應(yīng)用DNAStar 分析軟件對分離細(xì)菌的16S rDNA 基因序列與9 株糞腸球菌參考菌株 （基因登錄號ON778619.1、OP359300.1、OP359284.1、OQ405977.1、KJ726743.1、KP317676.1、OQ406010.1、OQ405593.1、MT604811.1） 進(jìn)行同源性分析； 基于細(xì)菌的16S rDNA 基因序列，用MEGA7 軟件繪制遺傳進(jìn)化發(fā)生樹， 并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.3.3 細(xì)菌毒力基因檢測

參照文獻(xiàn)設(shè)計8 對糞腸球菌毒力基因（ace、asal、gelE、efaA、cylA、hyl、Agg、esp） 以上引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。 PCR 擴(kuò)增體系同上。 擴(kuò)增程序：56℃退火，其余同上。

1.3.4 動物回歸試驗(yàn)

將30 只SPF 雞隨機(jī)分成a、b 兩組，每組15只。使菌液濃度達(dá)到每毫升樣品中含有1×108的細(xì)菌群落。 a 組經(jīng)跗關(guān)節(jié)注射1 毫升糞腸球菌，b組經(jīng)跗關(guān)節(jié)注射1 毫升滅菌生理鹽水。 分別隔離飼養(yǎng)觀察42 天。 接種后每天觀察記錄SPF 雞的死亡情況及跗關(guān)節(jié)處是否有腫脹， 死亡SPF雞及時進(jìn)行病理剖檢及細(xì)菌分離培養(yǎng)，同時將b組雞進(jìn)行剖檢及細(xì)菌分離培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離純化及染色結(jié)果

自保定某雞場采集的肉雞關(guān)節(jié)囊腫液中分離純化1 株細(xì)菌 （命名為HBBDYX E.faecalis株）。 HBBDYX E.faecalis 株分離菌在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上生長呈淺粉色、邊緣整齊、圓形的小菌落，光鏡下該細(xì)菌呈革蘭氏陽性、短鏈狀球菌。

2.2 細(xì)菌16S rDNA 鑒定結(jié)果

HBBDYX E.faecalis 株分離菌的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳可見大小約為1400bp的目的條帶 （圖1）；HBBDYX E.faecalis 株分離菌16S rDNA 序列與糞腸球菌參考株（ON778619.1）的同 源 性 達(dá)99.9%。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果（圖2）表明，HBBDYX E.faecalis 株分離菌與糞腸球菌參考株（ON778619.1）親緣關(guān)系最近，因此判定該分離菌屬于糞腸球菌。

圖1 細(xì)菌16S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 基于16S rDNA 基因序列生成的遺傳進(jìn)化樹

2.3 細(xì)菌毒力基因檢測結(jié)果

成功地擴(kuò)增出了HBBDYX E.faecalis 株分離 菌 的ace 基 因、asal 基 因、gelE 基 因、efaA 基因； 但未檢出cylA 基因、hyl 基因、Agg 基因、esp基因（圖3）。

圖3 糞腸球菌毒力基因檢測結(jié)果

2.4 動物回歸試驗(yàn)結(jié)果

a 組SPF 雞于接種后12 天發(fā)病， 表現(xiàn)精神沉郁（15/15）；接種后7 天、8 天、12 天分別死亡1 只，死亡率為20.00%（3/15）；接種后20 天跗關(guān)節(jié)見腫脹（1/12），到接種后42 天共有8 只雞見跗關(guān)節(jié)腫脹，跗關(guān)節(jié)腔發(fā)現(xiàn)大量白色黏液，病變率為66.67%（8/12）， 自a 組死亡雞和關(guān)節(jié)腫脹的雞均可回收到糞腸球菌。b 組雞觀察期內(nèi)未見發(fā)病死亡，人工處死后均無肉眼可見病變，細(xì)菌分離結(jié)果呈陰性。

3 討論

糞腸球菌多分布于糞便、尿液中，但本研究自肉雞關(guān)節(jié)囊腫液中分離純化得到1 株糞腸球菌。 目前，國內(nèi)對肉雞關(guān)節(jié)病中分離菌的報道多集中于葡萄球菌、大腸桿菌、沙門菌，未見分離到糞腸球菌的報道。本試驗(yàn)從河北保定某肉雞養(yǎng)殖場患有關(guān)節(jié)囊腫的肉雞中分離到1 株糞腸球菌， 試驗(yàn)結(jié)果表明該分離菌株攜帶4 種毒力基因， 且對SPF 雞具有致病性。 我國作為養(yǎng)禽大國，獸藥使用較多。 獸用的抗生素在禽病防治和提高養(yǎng)殖效益上十分重要。由于抗生素的使用不規(guī)范等原因?qū)е录?xì)菌耐藥性增高，給禽病防治工作帶來了很大的難度。筆者后期擬繼續(xù)開展雞源糞腸球菌的分離鑒定及分離菌的耐藥性監(jiān)測，以為肉雞關(guān)節(jié)囊腫的防治提供理論參考。