曹麗茹 龐蕓蕓 葉飛宇 馬晨晨 張 新王振華 魯曉民，*

（1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；2神農(nóng)種業(yè)實驗室，河南 鄭州 450002；3鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

玉米（ZeamaysL.）在我國廣泛種植，是重要的糧食作物和飼料作物，同時也是食品、化工業(yè)中不可缺少的原材料。在玉米生長周期內(nèi)，所需降水量至少為250 cm［1］，但我國有50%以上的玉米種植在干旱、半干旱地區(qū)，尤其在北方和西南地區(qū)經(jīng)常受到干旱和高溫天氣的危害［2］。在植物生長發(fā)育過程中遭遇高溫、干旱等非生物脅迫時，體內(nèi)一系列復(fù)雜的抗逆機(jī)制會被激活，其中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控在植物抵御外界非生物脅迫、影響作物正常生長發(fā)育及產(chǎn)量方面發(fā)揮重要作用［3-4］。

堿性亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中家族成員數(shù)量較多且功能較為復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［5］。據(jù)報道，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗生物和非生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［6］。Li 等［7］發(fā)現(xiàn)玉米轉(zhuǎn)錄因子bZIP68 通過抑制DREB1 轉(zhuǎn)錄因子的冷誘導(dǎo)表達(dá)從而提高玉米的耐寒性。蘋果（Maluspumila）轉(zhuǎn)錄因子MdbZIP44 通過增強(qiáng)MdMYB1與下游靶基因啟動子的結(jié)合，促進(jìn)花青素積累響應(yīng)脫落酸（abscisic acid，ABA）［8］。水稻（Oryza sativa）OsbZIP52 在寒冷和干旱脅迫中起負(fù)調(diào)節(jié)作用，OsbZIP52 過表達(dá)后提高了植株對寒冷和干旱脅迫的敏感性［9］；Kang 等［10］發(fā)現(xiàn)NaCl、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-6000 和ABA 等能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)甘薯（Dioscoreaesculenta）轉(zhuǎn)錄因子IbbZIP1表達(dá)，IbbZIP1過表達(dá)后能顯著提高擬南芥（ArabidopsisthalianaL.）的耐鹽性和耐旱性；Ma等［11］發(fā)現(xiàn)玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP4參與玉米根系發(fā)育，增加側(cè)根數(shù)量、促進(jìn)初生根生長，ZmbZIP4 過表達(dá)后提高植物抵抗非生物脅迫的能力；玉米ZmbZIP72 過表達(dá)后能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱和耐鹽性，同時增強(qiáng)ABA誘導(dǎo)基因如RD29B、RAB18和HIS1-3的表達(dá)［12］。大量研究表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生長發(fā)育并提高植物在生物及非生物脅迫下的耐受力，因此，挖掘bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族中能夠響應(yīng)相關(guān)脅迫的基因?qū)μ岣咧参镌谀婢持械哪褪苄跃哂兄匾囊饬x。

鑒于此，本研究對三葉期玉米幼苗進(jìn)行正常灌溉、干旱脅迫及復(fù)水處理，分別取處理下的葉片和根系送轉(zhuǎn)錄組測序；分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選核心節(jié)點基因，克隆ZmbZIP84并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究其不同組織及逆境脅迫下的表達(dá)模式，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得擬南芥純合突變體植株bzip84-1、bzip84-2、bzip84-3，分析在高溫、干旱脅迫下野生型（Columbia，Col）和bzip84-1、bzip84-2、bzip84-3植株的表型，初步探究該基因的功能。本研究旨在探究bZIP轉(zhuǎn)錄因子在玉米逆境脅迫和生長發(fā)育中的作用，為培育抗逆玉米品種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料處理及試驗設(shè)計

選取大小一致、顆粒飽滿的玉米自交系鄭8713 為試驗材料，人工氣候長日照培養(yǎng)箱（28 ℃、16 h光照/8 h黑暗）進(jìn)行培養(yǎng)。待幼苗生長兩周后，選擇生長整齊一致的三葉期幼苗進(jìn)行干旱-復(fù)水脅迫處理。利用SYSWSD 土壤溫濕度測定儀（遼寧賽亞斯科技有限公司）測量土壤水分含量，干旱處理時土壤含水量為45%～50%，復(fù)水處理時土壤含水量＞95%。取玉米脅迫處理前、干旱5 d、復(fù)水3 d 的葉片和根，分別命名為T0Y、T5dY、TR3dY 和T0G、T5dG、TR3dG，并提取RNA，于-80 ℃保存。5 株混為一個樣品，每個樣品各3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 ZmbZIP84基因的克隆

將玉米自交系B73播種于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原陽基地，每行種植16株，行長4 m，行距60 cm，株距25 cm，共種植6行，且最大田間持水量一直保持在80%以上。以B73 幼苗的cDNA 為模板，用基因特異性引物（ZmbZIP84-F：5′-ATGGCTTCCTCCAGCGGGA-3′ ；ZmbZIP84-R：5′-CGAGTACCAGCTCTGCTAG-3′）和高保真P505 酶進(jìn)行基因擴(kuò)增。反應(yīng)體系共50 μL：高保真P505 酶1 μL、10 μmol·L-1正反引物各2 μL、dNTP Mix 1 μL、2×Phanta Max Buffer 25 μL、100 ng·μL-1cDNA 1 μL、ddH2O 18 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收目的條帶。目的產(chǎn)物連接PMD18-T載體，將陽性菌落進(jìn)行菌液PCR 檢測，把檢測到目的片段的菌液送到北京六合華大基因科技有限公司（青島）測序。

1.3 ZmbZIP84基因的生物信息分析

使用Cytoscape3.8.2 軟件構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。利用ExPasy ProtParam 網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/protparam-doc.html）對ZmbZIP84基因編碼的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、疏水性及蛋白穩(wěn)定性等進(jìn)行預(yù)測；利用MEGA11軟件構(gòu)建ZmbZIP84蛋白與不同物種中的同源蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析；利用MEME 在線工具（http：//meme-suite.org/tools/meme）對蛋白的保守基序（motif）進(jìn)行分析，把基序的最大數(shù)值設(shè)置為6。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

取0.1 g 玉米組織樣品，液氮中磨碎，用TRIzol 法提取試劑盒（Invitrogen，北京）提取總RNA。用NANODROP 2000 濃度測定儀（Thermo，北京）檢測濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的質(zhì)量。取1 μg 的總RNA 用Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，北京）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋至終濃度100 μg·μL-1作為基因擴(kuò)增和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）模板。

1.5 qRT-PCR樣品及試驗處理

以田間正常生長（生長條件同1.2）的玉米自交系B73 為材料，取三葉期的幼根、幼莖、幼葉以及成熟期的根、莖、葉、雄穗、雌穗等不同組織的樣品進(jìn)行表達(dá)模式分析。取0.1 g 組織樣品于液氮中磨碎，TRIzol 法提取試劑盒提取總RNA。濃度測定儀檢測其濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的質(zhì)量，取1 μg的總RNA 用Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋至終濃度100 μg·μL-1。根據(jù)目的基因的保守性，利用NCBI網(wǎng)站設(shè)計特異性引物（ZmbZIP84-F：5′-AGAAAGGGCGGTTCTTGCG-3′；ZmbZIP84-R：5′-AAGCGGATGCTGTCGAACC-3′）。以稀釋后的cDNA為模板，利用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（上海翊圣生物科技有限公司）進(jìn)行qRTPCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系共20 μL： Hieff qPCR SYBR Green Master Mix10 μL、正反引物各引物0.4 μL、100 ng·μL-1cDNA 1 μL、ddH2O 8.2 μL。以玉米18S（18S-F：5′-C CTGCGGCTTAATT GACTC-3′；18S-R：5′-CCAGACCT CAGCCTGCTAAC-3′）為內(nèi)參，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。采用2-△△CT法計算基因的相對表達(dá)量［13］，每個處理3 個重復(fù)。

1.6 非生物脅迫試驗處理

以飽滿的玉米自交系B73 為材料，于人工氣候長日照培養(yǎng)箱（28 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗）進(jìn)行培養(yǎng)。待幼苗生長2 周后，選擇長勢一致的玉米三葉期幼苗進(jìn)行脅迫處理。干旱脅迫：利用20% PEG-6000（Holland營養(yǎng)液+20% PEG）進(jìn)行處理［14］；高溫脅迫：將溫度升高至42 ℃進(jìn)行處理［15］；鹽脅迫：利用200 mmol·L-1濃度的NaCl 進(jìn)行處理［14］；氮脅迫：利用缺乏銨態(tài)氮的Holland營養(yǎng)液進(jìn)行處理［14］。

1.7 CRISPR/Cas9 構(gòu)建擬南芥敲除載體、陽性植株的獲得及抗旱性檢測

查找ZmbZIP84在擬南芥中的同源基因（AT4G345 90），參照Tsutsui 等［16］的方法構(gòu)建CRISPR/Cas9載體。首先登錄CRISPRdirect網(wǎng)站（http：//crispr.dbcls.jp/）設(shè)計靶點，分析gRNA結(jié)構(gòu)，在Cas-OFFinder網(wǎng)站（http：//www.rgenome.net/cas-offinder/）評估脫靶情況，篩選靶點，設(shè)計引物（F： 5′-ATTGGATTCAAACGTCGTCAGGAT-3′，R：5′- GATT CAAACGTCGTCAGGATGTTT-3′）。將引物濃度稀釋至100 μmol·L-1，取正反引物各10 μL于200 μL PCR 管中混合均勻，100 ℃加熱5 min，自然冷卻至室溫，使引物聚合為二聚體形式。利用限制性內(nèi)切酶AarI（Thermo，北京）酶切PKI1.1R 載體，體系為20 μL：10×Buffer AarI 2 μL、DNA 1.5 μL、50×oligonucleotide 0.4 μL、AarI 0.6 μL、Nuclease-free water 15.5 μL。37 ℃孵育8 h，65 ℃孵育20 min，用DNA回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收線性化載體。利用T4 ligase（TaKaRa，北京）連接靶點和PKI1.1R 載體，體系為15 μL：靶點引物二聚體5.8 μL、T4 連接Buffer 1.5 μL、線性化載體1 μL、T4連接酶0.7 μL、Nucleasefree water 6 μL，22 ℃孵育30 min。將上一步連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，用壯觀霉素（spectinomycin，Spec）平板進(jìn)行陽性克隆的篩選。用引物U6.26：5′-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3′和靶點反向引物進(jìn)行PCR鑒定，目標(biāo)條帶大小約260 bp，用引物U6.26對陽性單克隆菌液測序驗證。將測序驗證后的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。陽性菌落經(jīng)PCR 驗證后利用花序浸染法浸染野生型（Col）擬南芥，成熟后收獲的種子為T0代。T0代種子消毒后，涂在含有潮霉素的1/2 MS 培養(yǎng)基（Murashige and Skoog medium）上進(jìn)行陽性苗的篩選，PCR驗證為陽性的幼苗進(jìn)行種植，成熟后單株收獲，即T1代種子。T1代種子消毒后，涂在不含抗生素的1/2 MS 培養(yǎng)基上，篩選分離比符合3∶1 的分離單株，PCR驗證為陽性的幼苗進(jìn)行種植并收獲，即T2代種子。相同的培養(yǎng)基再種植一代，選擇不發(fā)生分離的T2代單株進(jìn)行種植并收獲，為純合的T3代種子。

利用野生型擬南芥Col 和穩(wěn)定純合的T3代種子，經(jīng)消毒后分別涂在無抗1/2 MS 培養(yǎng)基上。生長5 d后，選擇長勢一致的幼苗移至營養(yǎng)土中培養(yǎng)，待生長到5 片葉，進(jìn)行干旱和高溫脅迫（土壤含水量45%）處理一周，觀察表型差異并測定生理生化指標(biāo)。

1.8 ZmbZIP84基因亞細(xì)胞定位

根據(jù)玉米MaizeGDB（https：//maizegdb.org）公布的ZmbZIP84基因序列，利用NCBI 設(shè)計目的基因引物（ZmbZIP84-pMDC83-GFP-SpeI-F：5′-GGACTAGTAT GGCTTCCTCCAGCGGGA-3′；ZmbZIP84-pMDC83-GFPBamHI-R：5′-CGGGATCC CAGATCAGACGTGGCGG TGA-3′）。以測序正確的ZmbZIP84-PMD18 為模板，克隆蛋白編碼區(qū)（coding sequence，CDS）序列。原始載體pMDC83-GFP 經(jīng)SpeI 和BamHI 雙酶切將載體線性化后，利用T4連接酶將目的條帶連接到帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)簽的融合表達(dá)載體pMDC83上。將菌液PCR 目的片段正確的陽性菌落送到北京六合華大基因科技有限公司（青島）測序。測序正確的菌液抽取質(zhì)粒后，使用熱激法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 中。使用注射法將菌液注射到煙草背面的葉肉細(xì)胞中，48～96 h在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP綠色熒光信號。

1.9 生理指標(biāo)的測定

葉綠素含量采用95%乙醇法測定［17］，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定［18］，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用NBT 法測定［18］，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定［18］。

1.10 統(tǒng)計分析

每組試驗進(jìn)行3 個生物學(xué)重復(fù)，每組數(shù)據(jù)3 個重復(fù)。用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并制圖，用SPSS 22 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmbZIP84的鑒定

對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中基因每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM）和功能注釋進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有27 個基因參與干旱-復(fù)水脅迫響應(yīng)。選取相關(guān)系數(shù)大于0.5 的基因構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果顯示，ZmbZIP84基因與其他基因之間的關(guān)聯(lián)度較高，表明ZmbZIP84基因是核心節(jié)點的關(guān)鍵基因（圖1），可知ZmbZIP84基因在干旱-復(fù)水處理過程中起著重要的作用。

圖1 差異表達(dá)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Co-expression network of differentially expressed genes

2.2 ZmbZIP84基因的克隆及生物信息學(xué)分析

利用網(wǎng)站MaizeGDB 下載ZmbZIP84基因的cDNA序列，以玉米自交系B73幼苗的cDNA為模板，利用PCR技術(shù)對ZmbZIP84基因進(jìn)行擴(kuò)增。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果得到約489 bp的條帶（圖2-A），回收目的條帶。將膠回收產(chǎn)物連接PMD18-T載體，陽性菌落送到北京六合華大基因科技公司（青島）進(jìn)行測序，通過比對測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)克隆到的基因與參考序列一致。

圖2 ZmbZIP84 基因（A）、編碼蛋白結(jié)構(gòu)（B）、結(jié)構(gòu)域（C）Fig.2 Gene structure of ZmbZIP84（A），coding protein structure （B） and domain （C）

對ZmbZIP84的基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因位于玉米的第4 號染色體，編碼區(qū)全長489 bp，編碼162 個氨基酸（圖2-B）。對該基因的蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，顯示ZmbZIP84具有典型的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域（圖2-C）。

利用Expasy Protpara 網(wǎng)站對ZmbZIP84 的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)的預(yù)測和分析。結(jié)果表明，分子式為C718H1182N226O235S；相對分子量為17.13 kDa，理論等電點（pI）為6.29；帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為18，帶正電殘基總數(shù)（Arg+Lys）為17，為酸性蛋白；親水性系數(shù)為-0.107，說明該蛋白是親水性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為84.75，屬于不穩(wěn)定蛋白。對其氨基酸組成成分進(jìn)行分析，其中Ala（A）含量最多，占21.6%；其次為Arg（R），占9.3%；含量最少的是Ile（I），占0.6%。

2.3 ZmbZIP84蛋白進(jìn)化樹分析及保守基序分析

為了研究ZmbZIP84與其他物種的親緣關(guān)系，利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖3可知，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子具有較高的保守性（圖3-A），與ZmbZIP84 親緣關(guān)系最近的物種為柳枝稷和高粱（圖3-B）。對同源物種的6 個保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7 個物種含有相似的保守基序（如：motif 1、motif 2、motif 3、motif 4），說明高粱、哈利谷草、柳枝稷、水稻、玉米、光稃稻、粳稻物種間可能存在某種相似的生物學(xué)功能（圖3-C）。

圖3 ZmbZIP84與其他物種的序列（A）分析、蛋白進(jìn)化樹（B）及保守基序（C）分析Fig.3 Sequence analysis （A） of ZmbZIP84 and other species，protein evolutionary tree （B） and conserved motif analysis（C）

2.4 ZmbZIP84的啟動子順式元件分析

啟動子順式作用元件在基因表達(dá)的調(diào)控過程中起著重要作用。為了進(jìn)一步探究ZmbZIP84的功能，利用PlantCARE在線軟件對ZmbZIP84基因ATG上游2 kb啟動子的順式元件進(jìn)行預(yù)測（表1）。發(fā)現(xiàn)ZmbZIP84基因啟動子區(qū)含有多種功能元件，除了在啟動子中最常見的TATA-box、CAAT-box 元件外，還包括ABRE、G-Box、Sp1、GT1-motif、CGTCA-motif、RY-element、Abox和TCCC-motif 等其他元件。其中，ABRE 參與響應(yīng)ABA 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，能夠響應(yīng)干旱脅迫；TGACGmotif 和CGTCA-motif 是茉莉酸甲酯（metyl jasmonate，MeJA）的結(jié)合元件，通過參與茉莉酸甲酯的傳導(dǎo)從而來調(diào)節(jié)茉莉酸相關(guān)基因的表達(dá)；O2-site 是參與調(diào)控玉米蛋白代謝的順式作用元件；TGA-element 是生長素響應(yīng)元件，能夠提高生長素相關(guān)基因的表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)Box Ⅱ、Sp1、TCT-motif 等一些光刺激應(yīng)答元件。結(jié)果表明，ZmbZIP84基因的表達(dá)可能被識別這些元件的轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控，從而在植物生長發(fā)育、響應(yīng)激素信號刺激及逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

表1 ZmbZIP84基因啟動子順式元件分析Table 1 Cis-element analysis of ZmbZIP84 gene promoter

2.5 ZmbZIP84基因組織表達(dá)模式分析

分析ZmbZIP84基因在玉米不同時期不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，該基因在所有檢測的組織中均表達(dá)，但表達(dá)模式存在明顯的差異。其中，成熟根中的表達(dá)量最高，幼根、雌穗及幼葉中的表達(dá)量次之，幼莖中表達(dá)量最低（圖4）。

圖4 ZmbZIP84基因在玉米不同組織中的表達(dá)Fig.4 The expression of ZmbZIP84 gene in different tissues of maize

2.6 ZmbZIP84 基因在非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式分析

通過對ZmbZIP84基因在干旱、NaCl、高溫及缺氮處理下的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在逆境脅迫下能夠參與響應(yīng)。結(jié)果表明，在高溫、干旱及氮處理下ZmbZIP84基因的表達(dá)量顯著或極顯著上調(diào)，而在鹽脅迫處理下該基因的表達(dá)量顯著或極顯著下調(diào)（圖5）。在高溫處理條件下（圖5-A），ZmbZIP84基因的表達(dá)量顯著或極顯著上調(diào)，且上升趨勢一直持續(xù)到48 h，此時表達(dá)量達(dá)到處理前水平的12.5 倍；之后表達(dá)量緩慢下調(diào)；恢復(fù)正常培養(yǎng)36 h 時，表達(dá)量降至最低，但表達(dá)量仍比脅迫前高。在干旱處理條件下（圖5-B），ZmbZIP84基因的表達(dá)量變化趨勢與高溫處理相似；干旱處理8 h時，表達(dá)量已上調(diào)至13.7 倍；隨著干旱脅迫時間的增加，ZmbZIP84基因的表達(dá)量出現(xiàn)緩慢下降的趨勢，在脅迫52 h時，表達(dá)量又出現(xiàn)緩慢上調(diào)趨勢；之后表達(dá)量緩慢下調(diào)至84 h；在復(fù)水處理后，隨著時間的增加，表達(dá)量變化趨于穩(wěn)定。在鹽處理條件下（圖5-C），ZmbZIP84基因的表達(dá)量呈下調(diào)趨勢；鹽處理36 h時，表達(dá)量為處理前水平的0.3 倍，為最低水平；解除脅迫12～36 h，表達(dá)量逐漸下調(diào)。在缺氮條件下（圖5-D），ZmbZIP84基因的表達(dá)量也呈顯著或極顯著上調(diào)趨勢；缺氮處理48 h時，表達(dá)量上調(diào)至4.52 倍；而解除脅迫后，表達(dá)量恢復(fù)至處理前水平。以上結(jié)果表明，干旱、高溫、鹽、缺氮處理均可誘導(dǎo)ZmbZIP84基因的表達(dá)。

圖5 ZmbZIP84基因在高溫（A）、干旱（B）、鹽（C）、缺氮（D）脅迫下的表達(dá)Fig.5 Expression of ZmbZIP84 gene under drought （A），high temperature （B），NaCl （C） and nitrogen deficiency（D） stress

2.7 干旱、高溫脅迫下ZmbZIP84 敲除擬南芥植株的表型分析

ZmbZIP84基因與擬南芥AT4G34590的同源性最高，序列相似性達(dá)61.54%。將玉米與擬南芥同源度最高的片段利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得bZIP84缺失型擬南芥突變體（圖6-A）。將野生型Col 和突變體T3 代的純合株系bZIP84-1、bZIP84-2和bZIP84-3進(jìn)行干旱和高溫脅迫處理。在正常處理下，Col和突變體植株的長勢一致且良好（圖6-B、C）。干旱脅迫處理5 d后，發(fā)現(xiàn)突變體植株生長受到嚴(yán)重抑制，葉片萎蔫，甚至干死；而Col 植株影響較小，但弱于同時期正常處理的Col 植株。高溫處理5 d 時，各株系均出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的萎蔫、干枯現(xiàn)象；但相對于突變體植株，Col植株的萎蔫程度相對較輕。以上結(jié)果說明，在干旱、高溫脅迫處理下，缺失bZIP84基因?qū)е聰M南芥抗旱性和耐高溫能力明顯下降。

圖6 玉米ZmbZIP84基因與擬南芥AT4G34590序列分析（A）、干旱及高溫脅迫下bZIP84突變體和野生型的幼苗表型（B、C）Fig.6 Sequence analysis of maize ZmbZIP84 gene and Arabidopsis AT4G34590 gene （A），seedling phenotypes of bZIP84 mutants and wild types under high temperature and drought stress （B，C）

2.8 ZmbZIP84 敲除會降低擬南芥植株對干旱和高溫的耐受性

測定干旱和高溫脅迫下擬南芥突變體植株bzip84-1、bzip84-2、bzip84-3中葉綠素含量、脯氨酸含量、SOD 和POD 活性均發(fā)生變化（圖7），發(fā)現(xiàn)脅迫處理前，擬南芥植株正常生長，各指標(biāo)在野生型Col和突變體植株中無顯著差異。在干旱和高溫脅迫后，葉綠素含量均明顯下降，且突變體擬南芥植株的葉綠素含量顯著低于野生型（圖7-A）。

圖7 干旱、高溫脅迫下bZIP84突變體和野生型擬南芥生理指標(biāo)測定Fig.7 Physiological indices of bZIP84 mutant and wild Arabidopsis thaliana under drought and high temperature stress

植物體內(nèi)脯氨酸的含量在一定程度上能夠反映植物的抗逆能力。脅迫前各株系間脯氨酸含量無明顯差異；在干旱脅迫處理后，Col 株系中的脯氨酸含量是突變體株系中脯氨酸含量的1.63～1.87 倍；在高溫脅迫處理后，Col株系中的脯氨酸含量是突變體株系中脯氨酸含量的1.89～2.06倍（圖7-B）。

當(dāng)植株遭受到脅迫時，體內(nèi)的SOD 含量出現(xiàn)明顯增加的趨勢，干旱脅迫后，Col 株系中的SOD 含量比突變體株系中SOD含量分別高了29.8%、33.7%、32.5%；高溫脅迫后，Col 株系中的SOD 含量比突變體株系中SOD含量分別高36.8%、38.9%、34.1%（圖7-C）。在脅迫處理前，Col株系和突變體株系中的POD含量無明顯差異，在脅迫后植株體內(nèi)的POD 含量明顯升高。干旱脅迫后，Col 株系中POD 含量比突變體株系中分別高34.7%、37.3%、41.6%；高溫脅迫后，Col 株系中POD含量比突變體株系中分別高了31.7%、23.8%、29.3%（圖7-D）。

通過測定生理指標(biāo)，可以發(fā)現(xiàn)在高溫和干旱脅迫后，擬南芥體內(nèi)葉綠素含量下降，而脯氨酸、SOD和POD的含量上升，且Col 株系中脯氨酸、SOD 和POD 的含量高于突變體株系，說明擬南芥中缺失bZIP84基因后顯著降低了擬南芥對干旱脅迫和高溫脅迫的耐受性。

2.9 ZmbZIP84基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位

為了進(jìn)一步驗證ZmbZIP84蛋白在細(xì)胞中的位置，將其進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，對照組在細(xì)胞核和質(zhì)膜均能發(fā)出綠色熒光信號，而試驗組只能在細(xì)胞核中觀察到綠色熒光信號，說明該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核中，屬于核蛋白基因（圖8）。

圖8 ZmbZIP84的亞細(xì)胞定位Fig.8 Subcellular localization of ZmbZIP84

3 討論

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子是植物器官發(fā)育及生理過程的主要調(diào)節(jié)因子［19］，在植物抗逆中發(fā)揮著重要的作用，對選育優(yōu)質(zhì)、綠色、高產(chǎn)、抗逆作物品種具有重要意義［14，20］。本研究通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在玉米中篩選到一個響應(yīng)干旱脅迫及復(fù)水的轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP84，對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析并克?。煌ㄟ^qRT-PCR 系統(tǒng)分析該基因在高溫、干旱、缺氮及NaCl 處理下的表達(dá)模式；利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得擬南芥陽性純合突變體植株，驗證該基因在高溫及干旱脅迫下的耐受性；通過亞細(xì)胞定位確定該基因在細(xì)胞中的位置，這些研究內(nèi)容為進(jìn)一步深入探究ZmbZIP84的功能及其調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

研究表明，植物bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在提高作物的質(zhì)量、產(chǎn)量及抗逆方面具有積極的作用［21］。有研究報道，ZmbZIP72基因過表達(dá)后轉(zhuǎn)擬南芥，能夠增加過表達(dá)植株對ABA 和滲透脅迫的敏感性，同時提高轉(zhuǎn)基因株系對干旱和鹽脅迫的耐受性［12］；ZmbZIP81過表達(dá)后能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對NaCl 的耐受性［22］。本研究發(fā)現(xiàn)ZmbZIP84基因在玉米植株各器官中差異表達(dá)，且在高溫脅迫、干旱脅迫及缺氮處理下表達(dá)量上調(diào)，而在鹽脅迫下表達(dá)量下調(diào)，說明ZmbZIP84基因在玉米的逆境脅迫應(yīng)答中起重要的作用，這與前人研究結(jié)果一致。為進(jìn)一步研究ZmbZIP84基因的功能，以模式植物擬南芥為受體，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除ZmbZIP84基因與擬南芥同源基因中高度保守的序列獲得陽性純合突變體植株，對突變體植株分別進(jìn)行高溫、干旱脅迫后發(fā)現(xiàn)Col 株系的長勢比突變體株系好，說明Col 株系比突變體株系在高溫、干旱脅迫下具有較高的耐受性。進(jìn)一步說明bZIP84基因缺失會降低擬南芥的抗旱、耐高溫能力。

在植物抗逆性研究中，葉綠素含量、脯氨酸含量、SOD 及POD 活性等常被用作重要的檢測指標(biāo)，來反應(yīng)植物的抗逆性能。逆境脅迫下植物體內(nèi)葉綠體的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致葉綠素含量及光合作用過程相關(guān)酶的活性降低［23-24］；同時體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸等含量增加，以調(diào)節(jié)細(xì)胞水勢使植物適應(yīng)不利環(huán)境［25-26］。本研究測定在高溫、干旱脅迫下Col 和突變體植株中的葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)受脅迫后植株體內(nèi)的葉綠素含量顯著下降，但突變體植株的葉綠素含量顯著低于Col；而在高溫、干旱脅迫下Col 和突變體株系中的脯氨酸含量都顯著升高，且Col 株系中的脯氨酸含量是突變體株系中1～2 倍。逆境脅迫會損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子及過氧化氫（H2O2）等活性氧的累積［27-28］，SOD 和POD 作為植物細(xì)胞內(nèi)重要的保護(hù)酶，在逆境脅迫下其活性顯著增加以清除活性氧，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［29-30］。本研究發(fā)現(xiàn)在高溫、干旱脅迫下Col和突變體株系中SOD 和POD 酶活性顯著增加，且脅迫后Col株系相比于突變體株系中的SOD 和POD 酶活性較高。結(jié)果表明，擬南芥突變體植株在高溫、干旱脅迫下體內(nèi)的葉綠素、脯氨酸、SOD 及POD 含量較Col 較低，從而判斷ZmbZIP84基因敲除后會降低植物的抗旱、耐高溫能力。

4 結(jié)論

本研究鑒定并克隆了響應(yīng)干旱脅迫的基因ZmbZIP84，該基因?qū)儆赽ZIP 轉(zhuǎn)錄家族成員，是組成型表達(dá)基因，且被高溫、干旱、NaCl 和氮處理誘導(dǎo)表達(dá)。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得ZmbZIP84基因的擬南芥同源基因缺失型陽性純合突變體植株，發(fā)現(xiàn)突變體植株在干旱和高溫脅迫下生長狀況遠(yuǎn)不如野生型。亞細(xì)胞定位顯示，ZmbZIP84基因編碼的蛋白屬于核蛋白。本研究初步證明了bZIP84基因缺失會導(dǎo)致擬南芥抗旱性和耐高溫能力顯著下降，證明了ZmbZIP84轉(zhuǎn)錄因子在高溫、干旱脅迫中起正向調(diào)控作用。