黨仕卓 周 娟 湯學燊 劉 鑫 張亞紅， 袁 苗

（1寧夏大學葡萄酒與園藝學院，寧夏 銀川 750021；2寧夏大學林草學院，寧夏 銀川 750021）

葡萄（Vitisvinifera）栽培面積廣泛，經(jīng)濟效益高，是世界古老的果樹，也是寧夏乃至西北地區(qū)設施果樹的主栽樹種。葡萄花芽分化質量是衡量葡萄質量和產(chǎn)量的基礎［1］，葡萄花芽分化進程復雜，需要外部環(huán)境和內部因素的整合［2］，而光在此過程起關鍵作用。光是影響植物形態(tài)發(fā)生的重要信號，也是形態(tài)建成和花芽形成的關鍵因子［3-4］。研究表明，紅藍光組合能促進花芽分化，提高花蕾質量和數(shù)量［5］；在葡萄補光試驗中紅藍4∶1（R4B1）是促進紅地球葡萄花芽分化的最佳補光比例，能顯著提高葡萄產(chǎn)量及品質［6-8］。光可通過控制激素平衡來調節(jié)植物營養(yǎng)和生殖平衡，植物中光信號介導脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（erythromycin，GA）代謝基因的轉錄強烈抑制黑暗萌發(fā)，卻抑制油菜素內酯（brassinolide，BR）途徑促進光形態(tài)建成，BR、GA與光共同調控細胞伸長和光形態(tài)建成［3，9-10］。

BR 是一種促生長類固醇激素，在調節(jié)胚軸伸長、光形態(tài)建成及花發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用［11-12］。研究表明，BR能促進葡萄［13］、番茄（Solanumlycopersicum）［14］果實成熟并提高其產(chǎn)量；而油菜素唑（brassinazole，Brz）顯著延緩果實成熟［13］。BR 的生理作用和信號通路研究主要集中于擬南芥（ArabidopsisthalianaL.）、番茄和豌豆（PisumsativumL.）［15］。BES1是BR信號轉導途徑重要的轉錄因子，調控下游BR 生物合成基因并被其他物種證實在調控植物花發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。轉錄因子CmBES1促進菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）舌狀花花瓣融合發(fā)育［16］，地錢（Marchantia polymorpha）MpBES1調節(jié)細胞分裂和分化［17］。BR 信號和光信號相互作用調控植物生長發(fā)育，光敏色素作用因子PIF4 （phytochrome interacting factor 4）與BES1互作調控細胞伸長和植株生長［18］。擬南芥中BR ENHANCED EXPRESSION 1（BEE1）是BES1和隱花色素2（CRY2）介導開花的整合子，BES1-BEE1-FLOWERING LOCUS T（FT）是調控光周期開花的一條新的信號通路［19］，表明光信號介導BR 信號途徑在調節(jié)植物花發(fā)育中起重要作用。

花芽分化不良在設施葡萄栽培過程中普遍存在，發(fā)光二極管（light emitting diode，LED）補光技術有助于葡萄花芽分化［20-21］。目前關于光調控花芽分化機制研究主要聚焦在表型、生理及組學研究中，但就光介導激素信號尤其是BR 信號調控紅地球葡萄花芽分化的分子機制尚不清晰。寧夏大學葡萄酒與園藝學院張亞紅課題組（本課題組）前期研究發(fā)現(xiàn)，BR在紅藍光組合補光促進紅地球葡萄花芽分化中發(fā)揮重要作用。鑒于此，本研究分析轉錄組數(shù)據(jù)后獲得植物器官邊界關鍵轉錄因子BES1家族基因VvBES1-1，對其進行生物信息學分析及同源克??；利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析VvBES1-1組織表達與時空表達模式；在煙草中異源表達VvBES1-1明確其生物學功能，以期為后續(xù)開展紅藍光調控設施紅地球葡萄花芽分化的機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗以11 年生紅地球葡萄為供試材料，種植于寧夏大學試驗基地賀蘭園藝產(chǎn)業(yè)園（38°20′N，106°16′E）15 號陰陽結合型日光溫室陰棚。本研究以課題組前期試驗篩選獲的最佳復合光比例，紅光∶藍光=4∶1（R4B1）處理葡萄，以溫室自然光（CK）為對照，處理間以反光膜相隔。共24株葡萄，分2個小區(qū)，每小區(qū)12 株，每處理設補光燈10 盞，在每組試驗行樹體上方30 cm 處安置補光燈補光，從葡萄萌芽期開始直至成熟期結束，每天8∶00—22∶00 進行補光，補光的光照強度為200 μmol·m-2·s-1，進行常規(guī)肥水管理。

參照劉鑫等［6］對葡萄花芽分化時期的劃分進行采樣，隨機采集新生根、花序、卷須、莖、葉片以及健壯枝條的飽滿花芽。樣品采集后立即用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱，用于RNA 提取及后續(xù)研究。為減少晝夜節(jié)律對基因表達差異帶來的干擾，將采樣時間固定于早上9點。

轉基因煙草（本氏煙草NicotianabenthamianaDomin）種植于22 ℃光照培養(yǎng)室（光照16 h/黑暗8 h）培養(yǎng)，相對濕度為75%～80%。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 合成 參考總RNA 提取試劑盒（Omega，美國）說明書提取紅地球葡萄不同組織，不同時期花芽的總RNA。用Nano Drop 微量紫外檢測儀（Thermo Scientific，美國）測定提取的RNA 樣品濃度，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。并以不同時期花芽RNA 混樣為模板，參照HisScriptR ⅢReverse Transcriptase 試劑盒（Vazyme，南京）獲得第一鏈cDNA。反轉錄后的cDNA保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 基因克隆與生物信息學分析 根據(jù)前期轉錄組數(shù)據(jù)用Primer 8.0 軟件對獲得基因的基因編碼序列（coding sequence，CDS）設計特異性擴增引物VvBES1-1-F/VvBES1-1-R（表1）。以紅地球葡萄花芽的cDNA為模板擴增目的片段，PCR 體系共25 μL：cDNA 2 μL，VvBES1-1-F/VvBES1-1-R 各1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，南京）12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，29 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA 凝膠回收試劑盒（TIANGEN，北京）回收目的片段。

表1 紅地球葡萄VvBES1-1克隆、亞細胞定位、自激活及過表達載體構建引物Table 1 VvBES1-1 subcellular localization，autoactivation analysis and overexpression vector construction primers in Red Globe grape

使用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam）在線分析VvBES1-1 理化性質；利用ExPASy Prot Scale 分析VvBES1-1蛋白疏水性；亞細胞定位預測用在線分析工具PSORT Ⅱ Prediction（http：//www.genscript.com/posort.html）和Plant-PLOC（https：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant）進行亞細胞定位分析；使用在線工具cNLS Mapper（https：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）、Nuc Pred（https：//nucpred.bioinfo.se/cgi-bin/single.cgi）預測VvBES1-1核定位信號（nuclear localization signal sequence，NLS）序列；在NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載所需序列，利用MEGA 11 軟件的近鄰相接法（Neighbor-Joining，NJ） 構建進化樹分析 （Boot strap檢驗重復值設置為1 000）；并用DNAMAN 9進行多序列比對。

1.2.3 酵母載體構建和自激活活性檢測 采用誘餌載體pGBKT7（BD），去掉目的基因序列的終止密碼子后，利用BamHI 和EcoRI 雙酶切BD 載體，隨后利用同源重組試劑盒將回收的PCR 產(chǎn)物與酶切后的線性載體連接，連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌［Escherichiacoli（Mig.） Cast.&Chalm.］ DH5α 感受態(tài)細胞后涂布于加有硫酸卡那霉素（kanamycin，kana）抗性的固體溶菌肉湯（luria-bertani，LB）培養(yǎng)基，37 °C 倒置培養(yǎng)12 h。挑取陽性克隆送生工生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序正確的誘餌載體質粒含kan 抗性的固體LB 培養(yǎng)基上活化，根據(jù)質粒提取試劑盒說明書提取質粒（TIANGEN，北京）。通過PEG/LiAc 法將其轉入釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Y2H Gold 感受態(tài)細胞，涂于SD/-Trp 營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基后放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。3 d 后挑取單菌落并稀釋后點樣于含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃半乳糖苷（Xα-Gal） 和金擔子素（aureobasidin A，AbA）的SD/-Trp培養(yǎng)基上，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，并觀察其生長情況。

1.2.4VvBES1-1遺傳轉化煙草及陽性株系篩選鑒定構建過表達載體（同1.2.3）后電擊法轉化農(nóng)桿菌并采用農(nóng)桿菌介導的葉盤轉化法［22］異源轉化本氏煙草：將5 周苗齡無菌煙草葉片用手術刀切成小塊接種于預培養(yǎng)基，預培養(yǎng)2～3 d 后置于OD600=0.2 的農(nóng)桿菌懸浮液侵染10～15 min。已侵染的葉片用無菌濾紙吸干殘留的菌液，接種于共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)48～72 h。依次轉至篩選培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每隔14 d更換一次培養(yǎng)基?？蛰d體遺傳轉化煙草的步驟同上。

1.2.5 qRT-PCR 分析 將1.2.1 中提取的總RNA 濃度統(tǒng)一調整為0.5 μmol·L-1，每個反轉錄反應使用1 μmol·L-1RNA。qRT-PCR 參考QuantiNova?SYBR?PCR 試劑盒（QIAGEN，德國）說明書；反應在qTOWER 2.2 （Analytik Jena，德國）上按照說明書進行，數(shù)據(jù)用2-△△CT法［23］進行數(shù)據(jù)處理。用SPSS 26 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并利用單因素方差分析（ANOVA）進行顯著性分析。所有試驗均設3 次重復，選用VvActin作為內參。

轉基因植株光照處理和激素處理所用材料為5 周齡轉基因煙草和野生型煙草（光照培養(yǎng)箱中）光照處理分為R4B1、自然光及暗處理（遮光）；在0、2、4、6 h共4個時間點采集試驗樣品；激素處理以5 mmol·L-1BR 處理2 h，DMSO溶劑處理2 h作對照，采集試驗樣品（同1.1）。利用總RNA提取試劑盒分別提取處理后煙草及野生型煙草總RNA 并反轉錄，通過qRT-PCR 檢測煙草中VvBES1-1的表達量，以煙草Actin作為內參，方法同上。

2 結果與分析

2.1 VvBES1-1基因克隆

參考本課題組前期轉錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)目的基因CDS 序列設計特異性引物（表1），以紅地球葡萄花芽反轉錄的cDNA 為模板擴增，電泳結果顯示擴增條帶大小與目的基因大小一致（圖1）。將目的片段擴增產(chǎn)物回收后送上海生工測序，測序結果比對完全正確，VvBES1-1的CDS序列長度為1 026 bp，分別編碼342個氨基酸。

圖1 紅地球葡萄VvBES1-1基因擴增產(chǎn)物Fig.1 Amplification product of VvBES1-1 gene of Red Globe grape

2.2 VvBES1-1生物信息學分析

采用ExPASy 分析VvBES1-1 蛋白分子量和理論等電點，VvBES1-1 分子量為3.629 628 kDa，理論等電點（pI）為8.53（表2），可見VvBES1-1 蛋白屬于堿性氨基酸（pI＞7），其次VvBES1-1 平均疏水性為-0.611。綜上，該蛋白為堿性親水性蛋白。

表2 紅地球葡萄VvBES1-1蛋白理化性質Table 2 Physicochemical properties of VvBES1-1 protein in Red Globe grape

利用在線SOPMA 程序對VvBES1-1 蛋白二級結構進行預測，結果表明：VvBES1-1 蛋白的二級結構主要包括α 螺旋、延伸鏈、無規(guī)卷曲和β 轉角種類型（圖2-A），無規(guī)則卷曲和α 螺旋是VvBES1-1蛋白多肽鏈的主要結構元件，比例分別為68.91%、18.48%，其次為延伸鏈8.21%、β轉角4.40%。

圖2 紅地球葡萄VvBES1-1蛋白二、三級結構Fig.2 The secondary and tertiary structure of Red Globe grape VvBES1-1 protein

為進一步了解VvBES1-1蛋白的結構，利用SWISSMODEL 對VvBES1-1 蛋白進行三維結構的建模分析，結果如圖2-B 所示。VvBES1-1 蛋白的主要結構是無規(guī)則卷曲和α螺旋，與二級結構預測的結果一致。

利用MEGA11.0 軟件中的鄰接法，將紅地球葡萄VvBES1-1 序列與其他17 個物種的BES1 蛋白構建系統(tǒng)進化樹，Boot strap 值為1 000 （圖3）。結果表明，VvBES1-1 與河岸葡萄［XP 034698454.1］氨基酸序列相似度為99.71%，同高粱BES1［XP 002454981.1］蛋白相似性最低，為60.29%。經(jīng)聚類分析后，發(fā)現(xiàn)可聚類為2個分支，第一分支包括開心果［XP 031269808.1］、棗［XP 015875603.1］、茶［XP 028056898.1］等；第二分支包括海棗［XP 008796066.1］、姜［XP 042398453.1］、高粱［XP 002454981.1］等。綜上，VvBES1-1與河岸葡萄親緣關系最近。

圖3 紅地球葡萄VvBES1-1與其他植物中BES1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Red Globe grape VvBES1-1 and BES1 protein in other plants

多重序列比對結果顯示，5 種果樹的BES1 蛋白序列相似性較高，均包含一個完整的BES1_N 結構域，表明VvBES1-1 是一個典型的BES1_N 型BES1 轉錄因子。功能域分析表明，VvBES1-1在雙子葉植物中均含有BES1_N 功能域，但序列存在不保守情況，表明該基因在不同物種中存在進化差異（圖2-C、圖4）。

圖4 紅地球葡萄VvBES1-1與其他植物中BES1蛋白多序列比對結果和NLS序列預測Fig.4 Red Globe grape VvBES1-1 multi-sequence alignment and NLS sequence prediction results of BES1 protein in other plants

通過在線工具cNLS Mapper和Nuc Pred對VvBES1-1的NLS序列預測發(fā)現(xiàn)，VvBES1-1在高度保守的BES1_N結構域序列中包含一段預測的NLS（圖4），其活性評分為5.7。Nuc Pred 在線工具預測發(fā)現(xiàn)該段NLS 活性得分為0.65。

2.3 VvBES1-1轉錄因子自激活活性分析

以酵母菌菌株Y2H Gold 為試驗材料，將VvBES1/BD分別轉化至酵母菌體內，并對其進行自激活活性分析。結果表明，含VvBES1-1的菌株能在一缺培養(yǎng)基（SD/-Trp）上正常生長，并且將單克隆菌株在SD/-Trp/AbA培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，菌株生長也未受到抑制，能正常生長。在SDO/A/X培養(yǎng)基上陽性對照（PGADT7-T+p53/BD）正常生長并且變藍，而雙陰性對照（PGADT7-T+Lam/BD 和BD 空載體）單克隆菌株均不能正常生長（圖5），證明VvBES1-1有自激活活性，表明該轉錄因子被激活后可能通過識別特異的核苷酸序列啟動和調控下游靶基因的表達從而調節(jié)紅地球葡萄花芽分化進程。

圖5 紅地球葡萄VvBES1-1自激活活性分析Fig.5 Detection of autoactivation activity of VvBES1-1 receptor binding bait protein in Red Globe grape

2.4 VvBES1-1時空表達分析

如圖6 所示，在R4B1 處理下VvBES1-1基因在紅地球葡萄花芽分化過程中表達量均低于對照組，圖6顯示紅地球葡萄花芽在6 月15 日處于始分化期，對照組花芽中VvBES1-1基因在6 月15 日前表達量逐漸增加，顯著高于R4B1，在此期間表明前期VvBES1-1基因表達量降低促進花芽分化進程。6月30日—7月15日，葡萄花芽始原基開始分化并決定能否形成花原基，在該階段VvBES1-1基因表達水顯著低于對照。觀察整個分化時期內對照組VvBES1-1基因的表達趨勢，發(fā)現(xiàn)VvBES1-1在6 月15 日的表達量最高，進一步說明VvBES1-1可能在花芽分化中起作用。7月15日—8月30 日花芽分化階段處于花序主軸發(fā)育和花序二級軸發(fā)育，R4B1 處理下VvBES1-1基因的表達水平顯著低于對照組，并且維持在一個低表達水平狀態(tài)，表明VvBES1-1表達量低有利于花芽后期分化。VvBES1-1基因在R4B1 處理下較對照組均顯著下調表達，推測紅藍光下VvBES1-1基因在紅藍光介導紅地球葡萄的花芽分化的過程中表達量下調。

圖6 R4B1下紅地球葡萄VvBES1-1基因時空表達模式Fig.6 Spatiotemporal expression pattern of VvBES1-1 gene in Red Globe grape under light of R4B1

2.5 VvBES1-1組織特異性表達分析

為明確R4B1處理下VvBES1-1在紅地球葡萄不同組織器官中的表達情況，選取紅地球葡萄的根、莖、葉、花芽、花及卷須進行組織特異性表達分析。結果表明，VvBES1-1在各組織器官中均有表達（圖7）。在溫室自然光中VvBES1-1在葉片和花芽中的表達量較高，其中溫室自然光葉片中的表達量是R4B1處理葉片中的6倍，而根中的表達量最低；R4B1 處理下，VvBES1-1在莖和花芽中的表達量最高，花中的表達量最低。VvBES1-1基因在葉片和花芽中的表達量顯著下降，而R4B1 處理下BRs上調表達同成花率正相關，這說明R4B1處理下BR信號通路中VvBES1-1表達量下降。

圖7 R4B1下VvBES1-1基因在紅地球葡萄不同組織中的表達水平Fig.7 The expression level of VvBES1-1 gene in different tissues of Red Globe grapeunder light of R4B1

2.6 轉煙草陽性鑒定及表型分析

在本氏煙草中構建過表達載體并利用農(nóng)桿菌通過葉盤法進行遺傳轉化，采用十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取轉基因煙草基因組DNA后進行陽性植株鑒定，鑒定結果顯示，轉化的陽性植株能夠擴增出與VvBES1-1大小一致的條帶，野生型煙草中則未鑒定出目的條帶（圖8-A），由此可以確定目的基因成功整合到煙草基因組中。對T3代表型觀察發(fā)現(xiàn)，過表達VvBES1-1煙草相比野生型開花時間較晚且葉片數(shù)增加，節(jié)間縮短（圖8-B、C），這表明VvBES1-1過表達可能推遲煙草開花時間。根據(jù)陽性鑒定結果，隨機選擇其中2株開展后續(xù)功能研究驗證。

圖8 轉VvBES1-1煙草陽性鑒定及表型Fig.8 Positive identification and phenotyping of trans- VvBES1-1 tobacco

2.7 光參與調控BR信號通路

為進一步明確光是否參與調控BR 信號通路，研究了不同光處理下外源激素噴施前后VvBES1-1基因的表達水平。研究結果顯示，不同光處理下VvBES1-1在轉基因和野生型煙草中均有表達，由圖9-A可看出，自然光下煙草中VvBES1-1基因表達量最高，顯著高于其他材料，約為暗處理下煙草中的20 倍，R4B1 處理下轉基因煙草中VvBES1-1的表達量比野生型多，約為野生型煙草中基因表達量的3 倍。暗處理下轉基因煙草和野生型煙草中VvBES1-1基因表達量較少，同其他兩處理相比未發(fā)生較大變化。圖9-B顯示在激素信號處理后，隨著濃度的變化，VvBES1-1的表達量發(fā)生明顯變化。在5 mmol·L-1處理后，紅藍光下轉基因煙草中VvBES1-1的表達量顯著上升，日光下野生型煙草處理組的表達水平趨勢同轉基因煙草中的一致均高于對照組。由此表明，光參與BR 信號通路，VvBES1-1基因可能在光調控轉基因煙草生長發(fā)育過程中下調表達。

圖9 不同光處理下外源激素噴施前后VvBES1-1基因的表達水平Fig.9 The expression level of VVBES1-1 gene before and after exogenous hormone spraying under different light processing

2.8 VvBES1-1基因表達依賴光

前人在擬南芥中的研究表明，BES1蛋白積累模式依賴于光［9］，為驗證葡萄中光是否能夠誘導VvBES1-1基因表達，本研究通過qRT-PCR 進行分析。結果顯示，與暗處理相比，R4B1 和自然光顯著誘導了VvBES1-1基因的表達，且在自然光下VvBES1-1的表達量更高（圖10）。自然光下，VvBES1-1基因表達水平呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。轉基因煙草在不同光處理2 h 時，VvBES1-1表達量均低于0.5 達到最低，表達水平呈現(xiàn)自然光＞R4B1＞暗處理的模式；但在不同光處理4 h時，R4B1下轉基因煙草中VvBES1-1的表達量有所升高，并高于自然光處理；在處理6 h 后又恢復之前的表達模式。由此表明，暗處理下，VvBES1-1基因表達量較低且相對穩(wěn)定，而在光和R4B1 誘導下VvBES1-1基因表達量整體顯著升高，表達水平呈現(xiàn)先減后增的模式；并且R4B1處理4 h后VvBES1-1的表達量顯著高于自然光，但在其他時間段剛好相反，這表明葡萄花芽中光誘導VvBES1-1基因表達。

圖10 R4B1、自然光、黑暗處理不同時間后轉基因煙草中VvBES1-1基因的表達水平Fig.10 The expression level of VvBES1-1 gene in transgenic tobacco after R4B1，natural light and dark treatment for different time

3 討論

花芽形成同光質具有相關性，光可以通過信號傳導和調節(jié)激素水平來調節(jié)植物生長。BR被譽為“第六激素”，BR 信號的關鍵成分調控多種植物生長發(fā)育過程和脅迫響應［24-27］。對豌豆、擬南芥、黃瓜和水稻中內源BR 水平的研究發(fā)現(xiàn)，BR 在光形態(tài)建成中發(fā)揮積極作用［28-29］。BES1 及其家族成員經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在調控花器官邊界形成具有重要作用［16，19，24］，但BR 信號的這些關鍵成分參與光調控葡萄花芽分化的分子機制還不清楚。本研究從紅地球葡萄中克隆獲得BES1 轉錄因子VvBES1-1，該基因CDS 全長為1 026 bp，編碼342 個氨基酸。

近年來對BR 信號的研究不斷深入，BR 信號的關鍵因子在其他植物中也得到了一定的研究。辣椒（CapsicumannuumL.）CaBES1［30］和荔枝（LitchichinensisSonn.）LcBES1［31］等都含有BES1_N結構域。本研究結果顯示VvBES1-1 也含有家族保守的BES1_N 結構域，是典型的BES1 家族蛋白，BES1_N 是該基因行使功能的主要基序。VvBES1-1與擬南芥中BES1家族基因結構類似，暗示VvBES1-1基因功能可能跟擬南芥中的相似，上述研究結果同前人一致。擬南芥中對于BES1定位于細胞核還是細胞質存在爭議，Jiang 等［32］提出BES1蛋白在BES1-S形式（含BES1_N結構域且在該結構域中存在NLS）之外還有一種新的形式BES1_L，并闡明此種形式在N 端多出一段肽段，多出的肽段具有NLS功能，它不僅能促進自身的細胞核定位，還能促進BES1-S 和BZR1 的細胞核定位。本研究結果顯示，VvBES1-1 在高度保守的BES1_N 結構域存在的情況下，存在一段NLS 促使VvBES1-1 蛋白定位于細胞核中。亞細胞定位預測該蛋白定位于細胞核的可能性較大，表明該基因可能在細胞核中調控BR 信號通路下游基因，但其在細胞中的具體位置需進一步試驗證明。葡萄為果樹，系統(tǒng)進化分析結果顯示VvBES1-1 和河岸葡萄在同一分支，同芒果、開心果、碧根果、棗等果樹的親緣關系較近，表明該基因在進化過程中保守性較高。

同源基因間因物種不同而表現(xiàn)出不同的組織表達差異，此種差異可能與生理功能、區(qū)域化分布及物種特異性相關［33］。LcBES1在檢測的各荔枝組織和器官中均有表達，各組織中的表達量存在差異［31］；GhBES1基因家族成員表達量具有組織特異性［34］；苦蕎FtBES1在各器官中也具有組織特異性［35］。本研究中，VvBES1-1基因在葡萄不同組織中均有表達，并呈現(xiàn)明顯的組織表達特異性，與前人研究結果類似。Zhang等［4］發(fā)現(xiàn)光照條件下，擬南芥核因子C 亞基蛋白（NUCLEAR FACTOR-Y Subunit C，NF-YC）直接負調控BR 合成基因BR6ox2的表達，抑制BR 途徑調控下胚軸伸長。本研究結果顯示，在R4B1 處理下VvBES1-1基因下調表達，受光信號調控顯著，與上述前人研究結果一致，說明在補光后葡萄中的VvBES1-1的表達可能受到抑制。

植物對光能的吸收是光合作用及生長發(fā)育的基礎，光和BR 拮抗調控植物發(fā)育從黑暗條件下暗形態(tài)建成向光照條件下光形態(tài)建成的轉換，許多參與光信號和BR 信號的突變體具有相似表型，表明光和BR 之間聯(lián)系密切［4］。外源噴施BR 結果顯示，VvBES1-1響應BR 信號；暗處理下轉基因煙草及野生型煙草VvBES1-1表達量較穩(wěn)定，R4B1 及自然光下VvBES1-1表達量極顯著，表明VvBES1-1響應光信號。擬南芥中，BR 信號負調控光信號介導的植物下胚軸抑制作用［4，23］。本研究中對轉基因株系表型分析發(fā)現(xiàn)VvBES1-1過表達植株具有花期延遲、節(jié)間縮短、植株矮化等特征，同時對轉基因煙草進行不同時間補光處理后發(fā)現(xiàn)，VvBES1-1基因在R4B1 處理下較對照組表達量顯著下降，推測BR 信號途徑中VvBES1-1基因可能在光信號介導轉基因煙草生長發(fā)育過程中下調表達。綜上，VvBES1-1在光信號介導的紅地球葡萄花芽分化過程中可能發(fā)揮重要作用，本研究為深入分析BES1蛋白在紅地球葡萄花芽分化過程中的調控功能提供理論依據(jù)，并為VvBES1-1基因參與光介導BR 信號調控紅地球葡萄花芽分化機理的研究提供參考。

4 結論

本研究從紅地球葡萄中克隆獲得VvBES1-1基因，經(jīng)生物信息學分析可知，VvBES1-1 可能為BES1-S 型蛋白，同河岸葡萄聚為一類。該轉錄因子具有轉錄激活活性和組織特異性，時空表達模式顯示VvBES1-1在花序二級軸發(fā)育期表達量達到最高，R4B1抑制該基因表達。在煙草中的異源轉基因試驗表明，VvBES1-1響應BR 信號，VvBES1-1在光介導BR 信號調控花芽分化的過程中呈倒“V”形表達，轉基因植株具花期延遲、節(jié)間縮短等表型特征。綜上所述，VvBES1-1參與光介導BR信號調控紅地球葡萄花芽分化，但其表達量不是決定花芽分化與否的主要因素，后續(xù)還需檢測開花基因的表達量，并對其互作機制進行深入研究。