王潘紅 鄭明 蔡云峰

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要類型，據(jù)2019年美國相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明NSCLC約占所有肺癌患者的85%［1-2］。大黃素是中藥大黃、何首烏和虎杖中的主要有效成分，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗癌抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、保護(hù)器官等多種藥理作用，因其抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的突出作用多用于抗癌的相關(guān)研究中［3-5］。紫杉醇是由紅豆杉中提取出的二萜類植物抗腫瘤藥物，因其抗瘤療效、延緩腫瘤進(jìn)展和過敏反應(yīng)較低等優(yōu)勢(shì)臨床上廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療［6-8］。本研究探討大黃素聯(lián)合紫杉醇治療NSCLC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞株A549購自美國典型生物收藏中心；DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司、MTT粉劑及二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒（TP53批號(hào)：202004，CASP3批號(hào)：202007）購自南京碧云天科技公司；多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices有限公司，型號(hào)：M5。

1.2 方法 （1）大黃素聯(lián)合紫杉醇的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：在研究中藥分子機(jī)制的在線生物信息學(xué)分析工具TCMSP以及醫(yī)藥信息查詢庫藥智數(shù)據(jù)中輸入“大黃素”、“紫杉醇”搜集兩者的所有化學(xué)成分及靶點(diǎn)，將得到的數(shù)據(jù)建立大黃素聯(lián)合紫杉醇的化學(xué)成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，輸入Cytoscape 3.7.0軟件以建立大黃素聯(lián)合紫杉醇的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。（2）大黃素聯(lián)合紫杉醇與NSCLC的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：通過GeneCards（http：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫獲取NSCLC相關(guān)的疾病基因，然后在EXCEL中應(yīng)用“VLOOKUP”函數(shù)篩選出大黃素聯(lián)合紫杉醇與NSCLC的交集靶點(diǎn)。根據(jù)獲得的交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入STRING數(shù)據(jù)庫中，將物種僅限于智人（Homo sapiens），置信度得分＞0.4，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) （PPI），并尋找PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)。（3）靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及通路分析：將1.2中得到的大黃素聯(lián)合紫杉醇-NSCLC交集蛋白靶標(biāo)基因輸入Cytoscape中的ClueGo插件進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，僅考慮P值＜0.05的生物學(xué)功能和富集通路，分析大黃素聯(lián)合紫杉醇作用于NSCLC的潛在生物學(xué)功能及相關(guān)通路。（4）MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：分為空白對(duì)照組、大黃素組、紫杉醇組與聯(lián)合用藥組，待A549細(xì)胞處于生長對(duì)數(shù)期時(shí)接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)過夜貼壁后，空白對(duì)照組加入含胎牛血清（10%）的DMEM培養(yǎng)基處理48 h，大黃素組分別加入30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L 的大黃素溶液處理48 h，紫杉醇組分別加入0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L的紫杉醇溶液處理48 h，聯(lián)合用藥組加入90μmol/L大黃素分別聯(lián)合0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L 的紫杉醇溶液處理48 h。每孔加入20μL 5 mg/mL MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)液，加入150μL DMSO于室溫下振蕩10 min，然后用酶標(biāo)儀選定490 nm波長測(cè)定OD值。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，然后根據(jù)公式計(jì)算抑制率：腫瘤抑制率=（1-藥物組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：分為空白對(duì)照組、大黃素組、紫杉醇組與聯(lián)合用藥組，待A549細(xì)胞處于生長對(duì)數(shù)期時(shí)接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)過夜貼壁后，空白對(duì)照組加入含胎牛血清（10%）的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，大黃素組加入90 μmol/L的大黃素溶液處理48 h，紫杉醇組加入0.2 μmol/L 的紫杉醇溶液處理48 h，聯(lián)合用藥組加入90 μmol/L大黃素聯(lián)合0.2 μmol/L紫杉醇溶液處理48 h。按照上述分組給藥后收集各組細(xì)胞上清液于4 ℃ 3,000 r/min 離心10 min，然后吸取上層清液，按照試劑盒中的步驟用酶標(biāo)儀分別測(cè)定樣品的吸光度，計(jì)算相應(yīng)的CASP3、TNF-α的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò) 從TCMSP和藥智數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫中篩選出大黃素聯(lián)合紫杉醇的41個(gè)靶標(biāo)基因，應(yīng)用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，獲得所示43個(gè)節(jié)點(diǎn)和41個(gè)邊緣的目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

圖1 大黃素聯(lián)合紫杉醇成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 靶點(diǎn)-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫，獲得關(guān)于NSCLC的4,910個(gè)疾病相關(guān)基因，采用EXCEL函數(shù)篩選出大黃素聯(lián)合紫杉醇與NSCLC的共同靶點(diǎn)基因32個(gè)。將32個(gè)共同基因輸入STRING，獲得31個(gè)節(jié)點(diǎn)、149個(gè)邊緣的靶點(diǎn)—靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)（見圖2）。選擇具有高度連接性的前10個(gè)靶基因作為中樞基因。大黃素聯(lián)合紫杉醇在NSCLC發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用的是細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、半胱天冬酶3（CASP3）、腫瘤壞死因子（TNF）、前表皮生長因子（EGF）、前列腺素G / H合酶2（PTGS2）、Myc原癌基因蛋白（MYC）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（KDR）、轉(zhuǎn)化生長因子beta-1（TGFB1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9 （MMP9）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）。

圖2 大黃素聯(lián)合紫杉醇-NSCLC靶點(diǎn)-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)

2.3 GO與KEGG富集分析 GO富集分析由生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）三部分組成。應(yīng)用Cluego將293個(gè)靶點(diǎn)基因上傳到數(shù)據(jù)庫，獲得GO和KEGG通路信息。見圖3-4。GO分析共得到150個(gè)生物學(xué)過程，前10個(gè)生物學(xué)過程見表1。KEGG通路分析得到45條相關(guān)通路，前10個(gè)相關(guān)通路見表2。

表1 GO分析前10個(gè)生物學(xué)過程

表2 KEGG分析前10個(gè)通路

圖3 大黃素聯(lián)合紫杉醇-NSCLC共同靶點(diǎn)GO分析圖

圖4 大黃素聯(lián)合紫杉醇-NSCLC共同靶點(diǎn)KEGG分析圖

2.4 大黃素聯(lián)合紫杉醇對(duì)A549增殖的影響 90 μmol/L大黃素+0.1μmol/L紫杉醇與90μmol/L大黃素+0.2 μmol/L紫杉醇對(duì)A549的抑制率明顯高于其他各組（P＜0.05）。見表3。

表3 不同濃度大黃素及大黃素聯(lián)合紫杉醇對(duì)A549增殖的比較

2.5 ELISA檢測(cè)CASP3、TNF-α水平 由上述結(jié)果可知90μmol/L大黃素和0.2μmol/L紫杉醇這兩個(gè)濃度效果最好，因此選取這兩個(gè)濃度分成單用與聯(lián)用三組。與空白對(duì)照組相比，大黃素組、紫杉醇組與聯(lián)合組CASP3含量明顯增加（P＜0.05），聯(lián)合組CASP3含量高于大黃素組和紫杉醇組（P＜0.05）。與空白對(duì)照組相比，大黃素組、紫杉醇組與聯(lián)合組TNF-α含量明顯降低（P＜0.05），紫杉醇組TNF-α含量低于大黃素組，聯(lián)合組TNF-α含量低于大黃素組和紫杉醇組（P＜0.05）。見表4。

表4 大黃素、紫杉醇以及兩藥聯(lián)合對(duì)CASP3、TNF-α水平的影響（±s）

表4 大黃素、紫杉醇以及兩藥聯(lián)合對(duì)CASP3、TNF-α水平的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與大黃素組比較，#P＜0.05；與紫杉醇組比較，△P＜0.05

組別nCASP3（ng/L）TNF-α（ng/L）空白對(duì)照65.96±0.36101.25±3.35 90μmol/L大黃素67.75±0.65*79.57±2.78*0.2μmol/L紫杉醇67.99±0.31*70±2.69*#90μmol/L大黃素+0.2μmol/L紫杉醇610.91±0.43*#△52.01±1.98*#△

3 討論

目前臨床上針對(duì)NSCLC的治療方法主要有手術(shù)治療、放化療、分子靶向藥治療、中藥治療等，其中約80%的患者診斷時(shí)即為晚期無法接受手術(shù)治療，放化療及分子靶向藥物存在耐藥現(xiàn)象和毒副作用等問題，中藥治療NSCLC具有多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，且毒性較低，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注［9］。紫杉醇是一種廣譜抗癌藥物，已被證實(shí)對(duì)于多種癌癥如NSCLC、卵巢癌、乳腺癌等均有明顯作用，但因其耐藥性及毒副作用的問題使紫杉醇在臨床應(yīng)用方面受到限制［7］。有研究表明大黃素能夠有效抑制NSCLC細(xì)胞增殖，在減少化療藥物耐藥性方面具有較好的應(yīng)用前景［10］。

MTT結(jié)果表明，大黃素聯(lián)合紫杉醇有抑制A549細(xì)胞增殖的作用，且聯(lián)合用藥抑制率高于大黃素及紫杉醇單獨(dú)用藥，提示大黃素聯(lián)合紫杉醇治療NSCLC具有一定潛力。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，大黃素聯(lián)合紫杉醇作用于NSCLC的潛在靶基因主要有TP53、CASP3、TNF等。研究表明腫瘤抑制基因TP53突變狀態(tài)作為NSCLC治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)標(biāo)志和生存預(yù)后標(biāo)志起到一定作用，同時(shí)與NSCLC患者總體存活率較低有關(guān)［11］。有研究表明CASP3基因表達(dá)降低的NSCLC患者總體存活率明顯較低，其中CASP3（-1337C＞G）多態(tài)性可能參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展［12］。有研究結(jié)果顯示，TNF-α在NSCLC患者癌組織中高表達(dá)，表明TNF-α與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13］。ELISA結(jié)果表明，大黃素與紫杉醇聯(lián)合能明顯增加A549細(xì)胞CASP3含量，降低TNF-α含量，提示大黃素聯(lián)合紫杉醇可能通過調(diào)控CASP3、TNF-α水平作用于NSCLC。從GO富集分析結(jié)果可知，大黃素聯(lián)合紫杉醇是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡、調(diào)控基因表達(dá)等多個(gè)生物學(xué)過程發(fā)揮抗NSCLC作用，這也體現(xiàn)在機(jī)制研究所涉及的信號(hào)通路中。KEGG 分析結(jié)果涉及MAPK 信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等，可能與 NSCLC的生長和抑制密切相關(guān)。

綜上所述，大黃素聯(lián)合紫杉醇可能通過調(diào)控CASP3、TNF-α等多個(gè)靶點(diǎn)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡、調(diào)控腫瘤抑制基因表達(dá)、炎癥反應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)功能或途徑對(duì)NSCLC起到治療作用。