夏愛曉 賈宇 林群 曹明 蔣正立

嬰幼兒血管瘤是常見的良性腫瘤，由胚胎時期血管增生形成，好發(fā)皮膚和皮下組織，60%發(fā)生在頭頸部［1］，其次四肢和軀干［2］，發(fā)病率為3%～10%［3］。臨床上嬰幼兒血管瘤治療，一般以外科手術(shù)較多，但手術(shù)需麻醉，且激光治療有嚴重的副作用等缺點［3］。藥物治療相對患者依從性較高，目前主要還是β受體阻滯劑，如口服普萘洛爾，局部用噻嗎洛爾等［4］。CHONG等［5］首先報道伊曲康唑有抗血管生成作用，發(fā)現(xiàn)伊曲康唑可體外抑制血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）分裂，使其阻滯在G1期，同時在體內(nèi)抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和纖維上皮生長因子（FGF）依賴的血管生成作用，作用靶點可能為羊毛甾醇14-去甲基化酶。在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，伊曲康唑通過與Niemann-PickC蛋白結(jié)合抑制細胞內(nèi)膽固醇向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運，導致膽固醇耗竭［6］。但目前伊曲康唑?qū)θ搜芰鰞?nèi)皮細胞（human hemangioma endothelial cells lines，HemECs）作用機制尚未明確［7］，故本實驗探究不同濃度伊曲康唑?qū)emECs的抑制作用和細胞凋亡的影響，為后期伊曲康唑治療血管瘤研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 CKX41生物顯微鏡（奧林巴斯）； SC-3616低速離心機（安徽中科中佳）；CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾）；OptiMair垂直流超凈工作臺（新加坡藝思高Esco）；5424R小型高速冷凍離心機（艾本德）；Multiskan FC帶孵育器酶標儀（賽默飛世爾）；-80℃超低溫冰箱（賽默飛世爾）；CytoFlex S流式細胞儀（貝克曼庫爾特）。

1.2 材料 人血管瘤內(nèi)皮細胞（HemECs）（華山醫(yī)院中心實驗室），伊曲康唑（武漢夢奇科技有限公司，批號：190801，純度：99.2%），胎牛血清（HAKATA，S201905），DMEM高糖完全培養(yǎng)基（HAKATA，批號：WP20201124），細胞凍存液（BioFlux，批號：20180602），胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）（索萊寶，批號：20210201），青-鏈霉素混合液（雙抗）（Gibco，批號：01750），CCK-8試劑盒（Bioss ANTIBODIES，批號：BJ05203090），Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒（北京四正柏，F(xiàn)XP023）。

1.3 HemECs培養(yǎng) 人血管瘤內(nèi)皮細胞（HemECs）用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

1.4 細胞形態(tài)觀察 將適量的細胞接種于6孔板上，體外培養(yǎng)的HemECs經(jīng)不同濃度（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL）伊曲康唑干預（12 h、24 h、48 h）后，不同濃度不同時間倒置顯微鏡觀察伊曲康唑?qū)emECs形態(tài)和凋亡的影響。

1.5 CCK-8法實驗檢測細胞活力和抑制率 取對數(shù)生長期HemECs細胞接種于96孔板中，每孔5×103個細胞，每孔100 μL，貼壁后分別給予10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL伊曲康唑完全培養(yǎng)基混合液，繼續(xù)培養(yǎng)至12 h、24 h、48 h。對照組加入無藥物的DMEM完全培養(yǎng)基。每組均設(shè)置5個復孔。分別在每孔100 μL細胞懸液中加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)至2 h，酶標儀檢測，酶標儀測波長450 nm吸光度A值。實驗組與對照組均減去空白組吸光度A值，各組取去掉最大值和最小值的平均數(shù)，代入下列公式，即得細胞抑制率。抑制率= ［（Ac-As］/（Ac-Ab）］×100%；As：實驗孔（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK8、伊曲康唑）；Ac：對照孔（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK8）；Ab：空白孔（不含細胞和伊曲康唑的培養(yǎng)基、CCK8）。

1.6 流式細胞術(shù)檢測HemECs細胞凋亡 將HemECs制成單細胞懸液接種于6孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1～2 d換液，待細胞鋪滿瓶底80%以上，將HemECs分為實驗組、對照組。實驗組伊曲康唑濃度（30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL）干預后（12 h、24 h），收集細胞培養(yǎng)液，并用不含EDTA的胰酶消化細胞，離心（1,000 r/min，5 min）。加入約1 mL 4 ℃預冷的PBS漂洗，重懸細胞，再次離心沉淀細胞（直至上清液無色）。加入100 μL 1×BindingBuffer重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為1～5× 106/mL［8］；將需要加碘化丙錠溶液（PI）的組別中加入10 μL的PI，需要加Annexin V/FITC的組別中加入5μL的Annexin V/FITC，混勻后于室溫避光下孵育5 min，立即上機檢測［9］?？瞻坠埽宏幮詫φ战M細胞，不加Annexin V/FITC和PI；單染管：陽性對照組細胞，只加Annexin V/FITC；PI單染管：陽性對照組細胞，只加PI；雙染管（檢測管）：處理的細胞，加Annexin V/FITC和PI。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)觀察 伊曲康唑各作用時間的HemECs形態(tài)結(jié)果顯示，當伊曲康唑濃度為10 μg/mL、20 μg/mL與空白組比較變化較小，對HemECs影響較小。在12 h、24 h、48 h結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)從30 μg/mL至50 μg/mL HemECs的數(shù)量和密度顯著減小，且在50 μg/mL中大部分HemECs均已經(jīng)成為凋亡小體。結(jié)果表明30 μg/mL伊曲康唑的作用最適合。見圖1、2、3。

圖1 伊曲康唑各濃度作用12 h后HemECs形態(tài)（光鏡×100）

圖2 伊曲康唑各濃度作用24 h后HemECs形態(tài)（光鏡×100）

圖3 伊曲康唑各濃度作用48 h后HemECs形態(tài)（光鏡×100）

2.2 CCK-8法實驗檢測細胞活力和抑制率 與空白組比較，伊曲康唑可以顯著抑制HemECs的增殖。且在伊曲康唑分別干預12 h、24 h、48 h后，CCK-8對HemECs細胞增殖抑制具有伊曲康唑濃度依賴性，且抑制率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。且在30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL間抑制率差異最顯著。伊曲康唑作用24 h后各濃度梯度的抑制率變化趨勢（k=0.1038）比12 h（k=0.0054）和48 h（k=0.0617）更明顯。干預48 h的抑制率最高、細胞活力最低，24 h比12 h的抑制率顯著。在伊曲康唑為40 μg/mL、50 μg/mL的情況下，干預12 h、24 h、48 h的HemECs抑制率明顯增強、細胞活力降低。篩選12 h和24 h濃度為30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的伊曲康唑為流式細胞術(shù)的條件。見圖4。

圖4 伊曲康唑各濃度作用不同時間后對HemECs細胞抑制率影響

2.3 流式細胞術(shù)檢測HemECs細胞凋亡 HemECs細胞凋亡有伊曲康唑濃度依賴性，干預12 h后，濃度30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL細胞總凋亡率分別為2.65%、7.27%、9.83%；干預24 h后，濃度30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL細胞總凋亡率分別為4.61%、13.09%、17.95%。結(jié)果顯示，干預12 h隨著濃度的提高，細胞凋亡率的增加；且在相同濃度下，干預24 h的細胞凋亡率比12 h高，抑制更有效，見圖5-6。

圖5 伊曲康唑作用12 h后HemECs細胞凋亡散點圖

圖6 伊曲康唑作用24 h后HemECs細胞凋亡散點圖

3 討論

伊曲康唑是一種廣譜抗真菌藥物，半衰期較長、分布容積高、組織濃度穩(wěn)定；臨床應用相對較安全，也具一些罕見的副作用，包括中性粒細胞減少，肝和心臟功能衰竭；通常被用于治療真菌感染，近幾年伊曲康唑?qū)ρ芰?、非小細胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、膽道癌和急性白血病作用逐漸被報道，如伊曲康唑聯(lián)合化療可逆轉(zhuǎn)紫杉烷耐藥性，提高生存率［10］。冉玉平［11］研究認為伊曲康唑具有抗血管瘤作用，6位患有血管瘤的嬰兒口服伊曲康唑5 mg/（kg·d），給藥約3個月，治療結(jié)束時改善80%～100%；1例局部濕敷馬來酸噻嗎洛爾滴眼液3個多月無效，后改為口服伊曲康唑口服液，療程68 d，總用量2300 mg，停藥時血管瘤已有消退征象，停藥4個月后血管瘤幾乎消退，表明伊曲康唑治療有后效應；這明顯快于血管瘤自然消退速度，也短于普萘洛爾療程。YANG等報道［12］，2個月男孩，左側(cè)陰囊血管瘤上有潰瘍40 d，ITZ口服液治療嬰兒血管瘤潰瘍，治療60 d，血管網(wǎng)大部分消退，停藥3個月后有明顯改善。LI等［13］報道普萘洛爾和伊曲康唑?qū)胗變貉芰黾毎饔?，伊曲康唑治療（有效?4.4%）高于普萘洛爾組（有效率22.2%），血清血管生成素Ⅱ水平均有下降，其抗血管瘤機制與誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡和自噬有關(guān)，使血管瘤緩慢消退。

綜上所述，伊曲康唑?qū)emECs細胞增殖的抑制作用和細胞凋亡促進作用與濃度、作用時間呈正相關(guān)，當伊曲康唑濃度≥30 μg/mL時，作用效果顯著增強，且呈濃度依賴性。伊曲康唑濃度≥30μg/mL、干預時間為24 h，作用效果最為適合。