邵青意 馮丹峰 虞臻迪 陳丹蕾 計(jì)友棋 程?hào)|慶

具核梭桿菌（F.nucleatum）是梭桿菌門(mén)梭桿菌屬的代表細(xì)菌，目前研究主要聚焦于潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病，尤其是結(jié)直腸癌［1］。消化系統(tǒng)存在口腔-腸道微生物群軸，F(xiàn).nucleatum不僅聚集于結(jié)腸，也大量定居于口腔微環(huán)境［2-3］，是導(dǎo)致牙周病的主要病原體。F.nucleatum在口腔中具有高致病性與強(qiáng)侵襲性，在生物膜結(jié)構(gòu)中作為“組織者”，連接早期定植微生物與晚期定植微生物、共生菌與致病菌［1］。F.nucleatum通過(guò)黏附素RadD、孔蛋白FomA及脂肪酸結(jié)合蛋白2（fattyacid-binding protein 2，F(xiàn)ap2）的介導(dǎo)，與后期病原微生物牙卟啉單胞菌等實(shí)現(xiàn)共聚與黏附，從而幫助其定植［1］。細(xì)菌生物膜是指附著于有生命或無(wú)生命物體表面被細(xì)菌胞外大分子包裹的有一定三維結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)菌群體［4］。在復(fù)雜的口腔微環(huán)境內(nèi)，細(xì)菌生物膜易形成于多種材料表面，人造材料上的口腔生物膜影響假牙和修復(fù)體的使用壽命，還會(huì)導(dǎo)致種植體周?chē)椎燃膊。?］。同時(shí)，不同碳水化合物飲食可以促進(jìn)或預(yù)防齲齒生物膜的發(fā)展［5］。本文探討F.nucleatum在不同口腔材料表面的聚集、黏附與生物膜形成特性，以及常見(jiàn)糖暴露的影響，旨在了解其在復(fù)雜的口腔微環(huán)境中的定植情況，揭示F.nucleatum在不同口腔條件下的致病力。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑與儀器 菌株：F.nucleatum多形亞種（Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum）BNCC336949保存于本實(shí)驗(yàn)室。主要試劑與材料：蔗糖（麥克林）、乳糖（麥克林）、木糖醇（阿拉?。?、牛心腦浸液培養(yǎng)基（海博生物）、瓊脂粉（杭州濱和微生物）、氯化血紅素（源葉生物）、微生物K1注射液（海博生物）、無(wú)菌脫纖維羊血（源葉生物）、厭氧袋（三菱，日本）、鈦片（購(gòu)自淘寶海源科研金屬）、樹(shù)脂義齒（購(gòu)自淘寶丞誠(chéng)口腔材料模具）、24孔板（康寧）等。主要儀器：多功能酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士）、微孔板分光光度計(jì)（Bio Tek，美國(guó)）、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日立，日本）等。

1.2 樣品處理 鈦片使用噴砂機(jī)于不同顆粒大小石英砂45 m、125 m、350 m加工，在100℃下，60%H2SO4、10%HCL和去離子水以1∶1∶2體積比組成的混酸中酸蝕20 min，加工成粗糙度為0.1 m、0.5 m、1.5 m、3.0 m及4.0 m五組微米結(jié)構(gòu)表面鈦片。所有純鈦鈦片試件先用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次，再用無(wú)水乙醇超聲降解15 min，高壓蒸汽滅菌備用。樹(shù)脂義齒用無(wú)水乙醇超聲降解15 min，高壓蒸汽滅菌備用。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)菌懸液制備 將凍存的F.nucleatum接種至含1%維生素K1和氯化高鐵血紅素儲(chǔ)備液（50 mg氯化高鐵血紅素、1 mL微生物K1注射液/100 mL）的BHI血平板，37℃厭氧培養(yǎng)，24～36 h可形成菌落，應(yīng)用革蘭染色進(jìn)行純度鑒定。將上述單菌落接入含10%小牛血清的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，將菌液離心（1,000 r/min，5 min），使用無(wú)菌PBS重懸，并將菌懸液調(diào)節(jié)至A600值為0.8。

1.4 F.nucleatum自聚集 細(xì)菌自聚集是指菌體在培養(yǎng)過(guò)程中，大量并快速繁殖從而導(dǎo)致其自行聚集成團(tuán)的現(xiàn)象。不同載體環(huán)境：將1.2中鈦片、樹(shù)脂義齒分別置于24孔板內(nèi)，設(shè)置聚苯乙烯對(duì)照組，加入實(shí)驗(yàn)菌懸液，37℃培養(yǎng)48 h，形成穩(wěn)定生物膜。參考文獻(xiàn)［6］中方法，應(yīng)用無(wú)菌聚集緩沖液（150 mmol/L NaCl、1 mmol/L Tris-HCL pH 8、0.1 mmol/L CaCl2和0.1 mmol/L MgCl2）將F.nucleatum生物膜超聲（100 Hz，10 min）洗脫、重懸，于A600測(cè)吸光度記作A0，靜置，每30 min離心生物膜懸液（2,000 r/min，2 min），取上清液于A600測(cè)吸光度記作At。不同糖培養(yǎng)基環(huán)境：F.nucleatum于含有1%不同糖（蔗糖、乳糖、木糖醇、空白培養(yǎng)基）的培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48 h，收集生物膜，檢測(cè)方法同上。聚集率計(jì)算：Aggregation %=（A0-At）/A0×100%。

1.5 F.nucleatum黏附作用 細(xì)菌黏附作用是指細(xì)菌可通過(guò)黏附素附著在載體或宿主細(xì)胞表面。不同載體環(huán)境：將1.2中鈦片、樹(shù)脂義齒分別置于24孔板內(nèi)，設(shè)置聚苯乙烯對(duì)照組，加入實(shí)驗(yàn)菌液，37℃厭氧分別培養(yǎng)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h。將試件用PBS沖洗3次，99%甲醇固定15 min，參考文獻(xiàn)［7］，在干燥后用1%結(jié)晶紫溶液染色5 min，PBS洗滌干燥后加入33%乙酸混勻溶解結(jié)晶紫，于A570處測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)吸光度值。不同糖培養(yǎng)基環(huán)境：F.nucleatum于含有不同糖的培養(yǎng)基或原培養(yǎng)基（空白對(duì)照）中37℃培養(yǎng)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h，檢測(cè)方法同上。黏附率（%）=（Ath-A0h）/A0h×100%。

1.6 電鏡表征不同粗糙度鈦與F.nucleatum黏附時(shí)期形態(tài) 菌懸液于每組粗糙度試件表面培養(yǎng)6 h后，取出試件，用PBS沖洗試件3次，立即放入2.5%戊二醛溶液中，4℃過(guò)夜，然后依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇梯度脫水，干燥，噴金，掃描電鏡表征黏附時(shí)期不同粗糙度鈦片表面細(xì)菌形態(tài)。

1.7 F.nucleatum生物膜形成 細(xì)菌生物膜形成通常包含細(xì)菌與底物表面通過(guò)黏附因子相互作用階段，微菌落形成階段，生物膜成熟階段，細(xì)菌脫落或擴(kuò)散階段。不同載體環(huán)境：將不同粗糙度試件、樹(shù)脂牙齒分別置于24孔板內(nèi)，設(shè)置聚苯乙烯對(duì)照組，加入實(shí)驗(yàn)菌懸液，37℃厭氧分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h、96 h，參照1.5中步驟，得到各時(shí)間點(diǎn)生物膜總量。不同糖培養(yǎng)基環(huán)境：F.nucleatum于含有不同糖的培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h、96 h，檢測(cè)方法同上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與繪圖。

2 結(jié)果

2.1 自聚集能力 蔗糖培養(yǎng)基中的生物膜內(nèi)F.nucleatum在30 min時(shí)自聚集率為60.58%，在90 min時(shí)達(dá)到69.43%；其次為乳糖培養(yǎng)基，其中生物膜內(nèi)F.nucleatum在30 min時(shí)自聚集率為43.36%，90 min達(dá)到51.58%；最后為木糖醇與普通培養(yǎng)基組（30 min分別為36.50%、37.00%；90 min分別為34.39%、44.04%）（見(jiàn)圖1A）。蔗糖組F.nucleatum自聚集率大于其他組。載體組F.nucleatum自聚集率除聚苯乙烯組均在30 min達(dá)到最大值，0.1 m、0.5 m、1.5 m、3 m、4 m鈦片、聚苯乙烯、樹(shù)脂義齒組最大自聚集率分別為36.14%、53.76%、46.18%、45.08%、44.83%、50.22%與49.87%（見(jiàn)圖1B）。

圖1 不同載體表面、不同含糖培養(yǎng)基F.nucleatum生物膜細(xì)菌自聚集率

2.2 黏附作用 F.nucleatum具有較好的黏附作用，在8 h內(nèi)能夠黏附在不同粗糙度鈦片、樹(shù)脂義齒、聚苯乙烯板條上，在含不同糖的培養(yǎng)基內(nèi)也能夠黏附于載體表面。不同載體組，8 h時(shí)，聚苯乙烯板條表面F.nucleatum黏附率最高，為548.00%，除4.0 m鈦片組與聚苯乙烯板條組外，其余均在6 h達(dá)到最大黏附率，完成黏附。6 h時(shí)0.1 m鈦片、0.5 m鈦片、1.5 m鈦片、3.0 m鈦片組黏附率分別為98.00%、180.00%、177.00%、40.00%。不同糖培養(yǎng)基組，8 h時(shí)蔗糖組F.nucleatum黏附率最高，為370.00%。除蔗糖組外，其余不同含糖培養(yǎng)基均在6 h達(dá)到最大黏附率，完成黏附。6 h時(shí)乳糖、木糖醇、培養(yǎng)基組黏附率分別為196.00%、144.00%、97.00%。見(jiàn)圖2。

圖2 F.nucleatum黏附時(shí)期不同載體、培養(yǎng)基內(nèi)黏附情況與黏附率

2.3 掃描電鏡表征鈦表面不同粗糙度與鈦表面黏附時(shí)期細(xì)菌形態(tài) 掃描電子顯微鏡下表征不同粗糙度鈦片表面，可見(jiàn)細(xì)微劃痕于光滑鈦片表面，深淺不同的微米凹坑分布于不同粗糙度鈦表面，0.5 m鈦表面多為2 m直徑凹坑，其余粗糙度鈦片表面凹坑大小不一、深淺不一；粗糙度越大，凹坑越致密。鈦片表面F.nucleatum黏附6 h經(jīng)掃描電鏡發(fā)現(xiàn)相同放大倍數(shù)時(shí)隨機(jī)視野下可見(jiàn)隨著鈦表面粗糙度變大，黏附的細(xì)菌數(shù)量增加，F(xiàn).nucleatum菌體變長(zhǎng)。在材料表面凹陷處，細(xì)菌聚集更為顯著。粗糙度大的鈦表面，為細(xì)菌提供容納場(chǎng)所，從而在初期抵抗外界流水沖刷，使其能夠更好黏附于載體表面。見(jiàn)圖3。

圖3 鈦表面F.nucleatum黏附時(shí)期掃描電鏡圖像

2.4 F.nucleatum生物膜形成 F.nucleatum在所有載體表面均能夠形成生物膜。生物膜在2 d時(shí)成熟：除了0.1 m、3 m鈦表面外，其他粗糙度表面與聚苯乙烯表面F.nucleatum生物膜均在2 d時(shí)到達(dá)峰值。聚苯乙烯表面F.nucleatum生物量最大，其次為4 m鈦片、1.5 m鈦片表面，0.1 m鈦片表面生物量最小。F.nucleatum生物量在所有材料表面均于3 d后開(kāi)始減少，生物膜結(jié)構(gòu)逐漸衰老、瓦解。不同含糖培養(yǎng)基組，在蔗糖作用下生物膜含量最大，在48 h為A570=3.75，其次為乳糖組、純培養(yǎng)基組、木糖醇組。所有組內(nèi)生物膜均在2 d時(shí)達(dá)到最大生物量，生物膜成熟，在3 d后開(kāi)始減少，生物膜逐漸瓦解。不同培養(yǎng)條件下48 h生物膜結(jié)晶紫染色后形態(tài)觀察，含蔗糖培養(yǎng)基內(nèi)生物膜生物膜明顯大于其他培養(yǎng)基，且不同載體表面均有生物膜形成。見(jiàn)圖4。

圖4 F.nucleatum生物膜形成時(shí)期生物量

3 討論

F.nucleatum是口腔齦上和齦下生物膜中豐度最高的革蘭陰性厭氧菌之一，是健康和疾病牙周微生物群的重要組成［3，8］。F.nucleatum聚集作用強(qiáng)，介導(dǎo)多種浮游細(xì)菌共聚集，聚集作用促進(jìn)細(xì)菌聚攏成團(tuán)，進(jìn)一步加強(qiáng)其黏附作用［9］。同時(shí)，F(xiàn).nucleatum作為一種“黏附型”微生物，其黏附能力強(qiáng)，在防止唾液沖刷的同時(shí)，還促進(jìn)多微生物交流與代謝互作［10-11］。F.nucleatum與口腔微生物群其他成員有著互惠關(guān)系，與其他口腔微生物互作以驅(qū)動(dòng)疾病發(fā)生，是生物膜形成的關(guān)鍵病原體［12-14］?？谇晃⑸锶簩?duì)口腔健康有重要作用，多微生物形成的生物膜轉(zhuǎn)變?yōu)樯鷳B(tài)失調(diào)狀態(tài)時(shí)，口腔微生物群可能導(dǎo)致多種疾?。?5］。

在復(fù)雜的口腔環(huán)境中，F(xiàn).nucleatum因其黏附、生物膜形成能力被認(rèn)為可能有助于種植體周?chē)膊〉陌l(fā)生和發(fā)展［16］。在種植體周?chē)字?，通過(guò)附著于牙齦和種植體表面的生物膜形成群落，繼而破壞周?chē)M織。F.nucleatum在口腔內(nèi)繁殖，分泌代謝產(chǎn)物，刺激牙齦組織，導(dǎo)致牙齦發(fā)炎和出血［15］。本研究發(fā)現(xiàn)F.nucleatum在大部分載體表面都能夠黏附并形成良好的生物膜。在蔗糖的存在下，相比于其他培養(yǎng)基，該細(xì)菌的黏附與生物膜形成能力均較強(qiáng)。提示臨床對(duì)于潛在F.nucleatum感染的患者應(yīng)該注意減少蔗糖攝入，從而減少牙齒疾病的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).nucleatum在不同載體表面與不同糖暴露下均有良好的聚集、黏附與生物膜形成能力。已有研究發(fā)現(xiàn)，這可能來(lái)源于其黏附素的作用，F(xiàn).nucleatum產(chǎn)生淀粉樣蛋白特性黏附素FadA，介導(dǎo)了良好的種間共聚集能力、黏附能力和多物種生物膜形成，使其在生物膜形成過(guò)程中充當(dāng)支架，同時(shí)賦予其耐酸性使其能夠存活于口腔微環(huán)境［17］。ENGEVIK等［18］發(fā)現(xiàn)F.nucleatum通過(guò)RadD黏附素黏附在艱難梭菌，并增加生物膜形成與胞外多糖的產(chǎn)生，提示F.nucleatum通過(guò)黏附素發(fā)揮良好的黏附能力，增加生物膜形成。各種研究均發(fā)現(xiàn)F.nucleatum在黏附素介導(dǎo)下具有良好的黏附與生物膜形成能力，這也提示后續(xù)可以針對(duì)黏附素進(jìn)行其致病性研究。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).nucleatum在不同載體上與不同糖暴露后均有優(yōu)良的聚集、黏附、生物膜形成能力。電鏡觀察下隨著粗糙度增加，黏附細(xì)菌數(shù)量增加，但黏附率在3 m時(shí)減小，這可能由于電鏡觀察存在選擇偏差。