梁浩威 徐純依 關旸 張卓文 張芮芹 吳成 王輝

中醫(yī)藥治療糖尿病歷史悠久，研究表明，天花粉主清熱瀉火、生津止渴，可用于預防和治療內熱消渴的糖尿病，對應癥狀以用藥劑量治療無毒副作用，常見于古今糖尿病方劑［1］。天花粉化學成分較為復雜，難以解析，在防治疾病過程更是涉及多種成分、靶點及途徑，致使研究天花粉活性成分及作用機制存在較大難度［2］。液質聯(lián)用作為一種先進的成分分析方法，憑借高分辨率和靈敏度可快速標記中藥內化合物組成，廣泛應用于中藥化學領域［3］。而網絡藥理學在復雜成分和多個靶點的中藥藥理研究中具有獨特的優(yōu)勢，可以系統(tǒng)研究中藥防治疾病機制［4］。因此，本研究通過液質聯(lián)用技術解析天花粉防治糖尿病的活性成分，并結合網絡藥理學和分子對接技術系統(tǒng)性探究其作用機制，以期為天花粉等中藥防治糖尿病的臨床應用提供科學依據和研究思路。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 超純水系統(tǒng)（Milli-Q IQ 7000，Merck KGaA）；500 mL套式恒溫器（TC-15，新華醫(yī)療器械廠）；高分辨四級飛行時間串聯(lián)液質聯(lián)用儀（SYNAPT G2-Si，Waters）；旋轉蒸發(fā)儀（RE-5298，上海榮亞生化儀器廠）。

1.2 實驗材料 天花粉（批號220824）購自杭州方回春堂國藥館有限公司，為葫蘆科栝樓屬植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根。甲醇（批號l1116707042）、乙腈（批號JB092530）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。甲酸（批號H1913009）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。CORTECS UPLC T3 column色譜柱（2.1×100 mm，1.6 μm）和BEH C18 Van Guard保護柱（2.1×50 mm，1.7 μm）購自沃特世科技（北京）有限公司。

1.3 實驗網站 SwissADME（www.swissadme.ch/）；Swiss Target Prediction（www.swisstargetprediction.ch/）；GeneCards數(shù)據庫（www.genecards.org/）；STRING（cn.string-db.org/）；Metascape（metascape.org/）；UniProt（www.uniprot.org/）。

1.4 方法 （1）天花粉水提物制備：精密稱取天花粉30.0 g，置于500 mL圓底燒瓶內，加入300 mL超純水浸泡30 min。冷凝回流加熱，煮沸1 h過濾，重復1次。冷卻后合并2次濾液，濃縮至1.0 g生藥/mL立即使用。天花粉水提液5.0 mL，超純水和甲醇稀釋為10 mg生藥/mL（甲醇含量50%）的供試液，50%甲醇水溶液為對照液，3,000 r/min離心5 min取上清，0.22 μm濾膜過濾后用于液質聯(lián)用檢測。（2）色譜與質譜條件：①色譜條件：流動相：A溶劑（乙腈）；B溶劑（0.1%甲酸溶液）；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫，柱溫：25℃；進樣量：2 μL。②質譜條件：電噴霧離子源（ESI）分別采用正負離子掃描模式；離子源溫度：120℃；錐孔電壓：20.0 V；毛細管電壓：3.0 kV（+）、2.5 kV（-）；鎖定質量溶液：Lockspray在線校正，亮氨酸-腦啡肽（Leueine-Enkephalin，［M+H］+=556.2771，［M-H］-=554.2615）；掃描模式為MSe；質量掃描范圍：m/z 50～1,200 Da，掃描時間0.2 s；工作站：MassLynx V4.1工作站。（3）成分分析：將數(shù)據導入Unifi數(shù)據處理工作站，使用軟件UNIFI 2.0分析色譜圖及各色譜峰的質譜信息，分析天花粉水提物組分及結構，得到天花粉成分。（4）天花粉成分篩選：SwissADME為全面藥物代謝性質分析網站，可依據藥物代謝信息對活性成分進行篩選。將天花粉成分導入SwissADME網站，以腸胃道的吸收“GI absorption”為“High”，類藥性“Druglikeness”中的Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge等5項根據Lipinski五原則，依據Yes的數(shù)量≥2個作為限制條件，篩選得到天花粉潛在活性成分。（5）藥物靶點預測：將天花粉潛在活性成分導入Swiss Target Prediction中進行靶點預測，選擇Probability不為0的靶點作為天花粉相關的藥物靶點。（6）疾病靶點收集：在GeneCards數(shù)據庫中以“diabetes”為檢索詞，檢索得到糖尿病相關靶點，以中位數(shù)篩選法獲取候選糖尿病相關的疾病靶點。（7）蛋白質互作（PPI）網絡構建及核心靶點的篩選：將藥物和疾病靶點做交集可得天花粉防治糖尿病潛在靶點。將交集靶點輸入STRING網站中構建蛋白互作網絡，設置物種為“Homo species”，置信度設置最高為0.90，導入Cytoscape 3.7.1軟件中，篩選獲得主要靶點，可視化繪制PPI蛋白互作網絡圖。采用Cytoscape軟件的cytohubba插件以MCC算法篩選核心靶點。（8）相關靶點GO功能分析及KEGG通路富集分析：將潛在靶點導入Metascape網站中進行GO功能富集分析包括生物過程（biology process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成（cellular component，CC）及KEGG富集分析，選擇“Homo species”，P value設置為0.01。獲得富集分析結果后，用R 4.1.2軟件的ggplot2包實現(xiàn)可視化，GO富集采用柱狀圖形式展示，KEGG富集以氣泡圖形式展示。（9）“成分-靶點-通路”網絡圖構建：根據蛋白靶點與KEGG信號通路之間的相互關系，選取關鍵通路，構建“成分-靶點-通路”網絡，并用Cytoscape軟件可視化為網絡圖。（10）分子對接：結合AutoDock Vina通過分子精細對接進一步研究天花粉與核心靶點的相互作用。根據Cytoscape軟件預測的核心靶點在UniProt數(shù)據庫下載相應的pdb文件，進行去除配體、去除水分子、加氫等常規(guī)處理后作為對接受體。以天花粉中主要成分為配體，用半柔性對接的方法進行分子對接。并用Pymol 2.5.0軟件對結合能＜-8 kcal/mol的“分子-蛋白”結合進行可視化。

2 結果

2.1 天花粉成分鑒定結果 將天花粉分別在正負離子模式下進行檢測。經unifi軟件鑒定得到的化學成分共15種，主要包括氨基酸、四環(huán)三萜類、脂肪酸酯類、烯酮類、芳香醛類等化合物。見表1、圖1。

圖1 天花粉液質聯(lián)用的總離子流圖

表1 天花粉成分表

2.2 天花粉活性成分及靶點篩選結果 將天花粉15種化學成分經SwissADME篩選后得到Benzaldehyde、L-Citrulline、Dibutyl Phthalate、Cucurbitacin D、Geranylacetone、Methyl Pentadecanoate等6種潛在活性成分。將潛在活性成分導入SwissTarget Prediction網站預測得329個蛋白靶點。以“diabetes”為關鍵詞檢索GeneCards數(shù)據庫并以Score值的8倍中位數(shù)篩選得到1,339個糖尿病高相關靶點。通過R軟件運行ggvenn包分析得到93個天花粉防治糖尿病靶點，并可視化為Venn圖，見圖2。

圖2 天花粉與糖尿病相關靶點Venn圖

2.3 蛋白質互作（PPI）網絡構建與分析 將藥物和疾病交集靶點導入STRING網站進行蛋白質互作分析，獲得61個高置信度蛋白靶點，經Cytoscape軟件可視化為PPI網絡圖，見圖3。根據PPI網絡拓撲學分析篩選得到相關度較高的STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK14、AR、MAPK14、NR3C1、MAPK1、TNF、EGFR、PPARA等10個核心靶點。

圖3 天花粉和糖尿病共同作用靶點PPI及核心靶點圖

2.4 GO富集分析 GO功能富集通過天花粉61個高置信度靶點得到523個生物過程、77個分子功能、34個細胞組成等功能進程。其中多涉及細胞對化學應激反應（cellular response to chemical stress）等細胞應激反應、脂肪酸代謝過程（fatty acid metabolic process）等脂質代謝相關的生物過程部分以及氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）為代表的氧化應激類分子的分子功能部分，并包含細胞膜上的膜筏（membrane raft）細胞膜組成類的細胞組成部分，見圖4。

圖4 GO富集分析二級分類柱狀圖

2.5 KEGG富集分析 將天花粉61個高置信度靶點進行KEGG 通路富集，得到顯著相關（P＜0.01）的通路共126條，其中與糖尿病相關通路有38條，可視化得到KEGG富集分析氣泡圖，見圖5。主要涉及Insulin resistance（胰島素抵抗）、Endocrine resistance（內分泌抵抗）、TNF signaling pathway（腫瘤壞死因子信號通路）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路）、Non-alcoholic fatty liver disease（非酒精性脂肪肝）、Apoptosis（細胞凋亡）、HIF-1 signaling pathway（缺氧誘導因子-1信號通路）、Pancreatic cancer（胰腺癌）、Insulin signaling pathway（胰島素信號通路）、VEGF signaling pathway（VEGF信號通路）等糖尿病相關通路。

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

2.6 “藥物-成分-靶點-通路-疾病”網絡圖構建 將篩選得到天花粉的活性成分、靶點及KEGG富集通路前10條通路導入Cytoscape構建“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網絡圖，見圖6。

圖6 “成分-靶點-通路”網絡圖

2.7 分子對接 分子對接結合能若≤-7.0 kcal/mol表明有較好的結合能力。通過分子對接發(fā)現(xiàn)Cucurbitacin D僅與TNF結合能＞-7.0 kcal/mol，與STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK14、AR、MAPK14、NR3C1、MAPK1、EGFR、PPARA等9個核心蛋白的結合度均較強。其中，Cucurbitacin D與PIK3CA的結合能高達-9.2 kcal/mol。此外，Geranylacetone與MAPK14的結合度也較高，擁有較好的結合能力。見圖7。

圖7 分子對接熱圖及高結合度“分子-蛋白”結合圖（TOP 3）

3 討論

糖尿病屬于中醫(yī)學“消渴病”范疇，《黃帝內經》有論及糖尿病具有內熱消渴的特點［5］。天花粉，又名栝樓根，《神農本草經》中有對其作用的描述“主消渴，身熱，煩滿，大熱，補虛安中，續(xù)絕傷”，可見天花粉治療內熱消渴的糖尿病由來已久?！秱s病論》中也提及天花粉養(yǎng)陰止渴法治療糖尿病的經方，如栝樓牡蠣散、栝樓瞿麥丸等［6］。

研究表明，天花粉和多數(shù)中藥一樣通過多種組分、多個靶點和多條通路發(fā)揮高效低毒的預防和治療作用［7］。中藥擁有整體性、系統(tǒng)性多點作用治療帶來優(yōu)越性，但所涉及復雜的化學成分和多樣的藥理作用的問題，也為進一步研究其作用機制帶來了巨大的難度［8-9］。網絡藥理學建立在高通量數(shù)據基礎上，使用算法計算和統(tǒng)計分析結合網絡數(shù)據庫檢索，生成“藥物-成分-靶點-通路-疾病”相互作用關系網絡圖，進而闡述藥物治療疾病的具體途徑，為傳統(tǒng)中藥研究提供新的思路［10］。液質聯(lián)用則從整體的角度出發(fā)，系統(tǒng)解析天花粉的化學成分組成，為網絡藥理學藥物靶點的預測提供更為精準的分析數(shù)據，為通路作用機制的探索打下堅實的基礎。

本研究通過液質聯(lián)用技術結合數(shù)據庫快速解析得到天花粉存在以Benzaldehyde、L-Citrulline、Dibutyl Phthalate、Cucurbitacin D、Geranylacetone、Methyl Pentadecanoate等為代表的活性成分。其中Cucurbitacin D通過調節(jié)JAK/STAT3、PI3K/Akt/mTOR和MAPK信號傳導途徑誘導凋亡，這可能是其發(fā)揮作用的機制［11］。L-Citrulline通過胰島素介導的細胞信號通路影響血壓調節(jié)、降脂和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，在糖尿病和相關并發(fā)癥的防治中發(fā)揮重要作用［12］。

PPI網絡拓撲學分析得到STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK14、AR、MAPK14、NR3C1、MAPK1、TNF、EGFR、PPARA等可能為天花粉發(fā)揮作用的核心靶點。研究表明，STAT3是一種轉錄因子，可調節(jié)與細胞存活、增殖、激活和分化相關的基因的表達，并在胰島發(fā)育和胰島素分泌中發(fā)揮重要作用［13］。AKT1是PI3K/AKT/mTOR信號通路的重要組成部分，參與遷移、增殖、生長和存活的細胞過程，并在葡萄糖代謝中起到重要作用［14］。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)，天花粉可能主要通過氧化還原酶等潛在分子功能以調節(jié)細胞的氧化應激生物學過程，作用于涉及細胞膜等細胞組分方面以及脂質代謝等生物學進程，從而發(fā)揮防治作用。為進一步探究天花粉防治糖尿病的分子機制，實現(xiàn)精準靶向用藥和新藥的開發(fā)，采用KEGG通路富集分析，結果發(fā)現(xiàn)高置信度的相關靶點主要集中在胰島素抵抗、內分泌抵抗、胰島素信號通路、胰腺癌等以胰島素為核心的通路，這些通路被證實和糖尿病具有高相關性［15］。天花粉防治糖尿病亦與TNF信號通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路等氧化應激通路和細胞凋亡通路相關。此外還與非酒精性脂肪肝、VEGF信號通路等關聯(lián)性疾病通路存在一定的聯(lián)系。較多研究表明，HIF-1通路與糖尿病有關，HIF-1α對于維持胰腺β細胞的功能和存活很重要，且T1DM患者中HIF-2β的mRNA表達降低［16］。通過分子對接研究發(fā)現(xiàn)，天花粉可能主要通過Cucurbitacin D作用STAT3、MAPK14、PIK3CA等關鍵靶點實現(xiàn)改善糖尿病的效果。后續(xù)可結合分子動力學模擬、人工智能等方法進一步探究其機制［17-18］。

通過液質聯(lián)用聯(lián)合網絡藥理學發(fā)現(xiàn)，天花粉可能通過Cucurbitacin D等活性成分調控以AGE-RAGE信號通路（在糖尿病并發(fā)癥中）、胰島素抵抗為代表的胰島素相關通路，提升胰島素的分泌和敏感性，從而作用于機體的細胞以調節(jié)血糖，預防糖尿病的發(fā)生或延緩糖尿病的發(fā)展，平衡機體血糖等重要組分以形成穩(wěn)態(tài)，達到防治糖尿病的作用。