張夏桐,吳文治,陳 卓

隨著生物信息學(xué)、材料科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的飛速發(fā)展,高通量測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)了巨大的進(jìn)步。傳統(tǒng)的RNA-seq測(cè)序(bulk RNA-seq)通過從組織或細(xì)胞中提取RNA,將所有的RNA混合進(jìn)行測(cè)序,所獲得的是整個(gè)細(xì)胞群體中基因表達(dá)水平,無法研究組織內(nèi)細(xì)胞的異質(zhì)性;單細(xì)胞RNA測(cè)序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行高通量和高分辨率的組學(xué)分析,能夠鑒定異質(zhì)細(xì)胞群體、重建細(xì)胞發(fā)育軌跡、模擬基因轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)以及推斷基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。但是單細(xì)胞RNA測(cè)序的數(shù)據(jù)不能反映細(xì)胞的空間信息,而空間轉(zhuǎn)錄組(spatial transcripto-mics,ST)技術(shù)能將組織內(nèi)不同細(xì)胞的基因表達(dá)信息定位到組織的原始空間位置上,進(jìn)而能直觀觀測(cè)到組織中不同部位基因表達(dá)的差異?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)通過成像和測(cè)序的結(jié)合,能夠彌補(bǔ)單細(xì)胞測(cè)序的不足。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有很多研究,其與空間轉(zhuǎn)錄組的結(jié)合也逐漸受到關(guān)注。本文主要綜述了單細(xì)胞測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究應(yīng)用及主要進(jìn)展。

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)概況

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)首先由Tang等[1]報(bào)道,對(duì)單個(gè)細(xì)胞遺傳物質(zhì)均勻擴(kuò)增、標(biāo)記建庫后進(jìn)行測(cè)序,主要步驟為單細(xì)胞分選、核酸提取、文庫構(gòu)建、高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析等,包括單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、基因組、表觀組和代謝組測(cè)序等,目前已在生命科學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。近年來,以單組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)[2]能在同一細(xì)胞中捕獲多個(gè)組學(xué)信息,從而更全面地反映細(xì)胞特性及其分子機(jī)制。如聯(lián)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表觀組的雙組學(xué)技術(shù),包括scM&T-seq技術(shù)[3]、SNARE-seq技術(shù)[4]、scCAT-seq技術(shù)等[5],從而進(jìn)一步揭示細(xì)胞遺傳信息及基因表達(dá)變異對(duì)細(xì)胞變化的影響;聯(lián)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的雙組學(xué)技術(shù),包括REAP-seq技術(shù)[6]、CITE-seq技術(shù)等[7],提供了更為精確的蛋白表達(dá)差異。相比較于單組學(xué)數(shù)據(jù),多組學(xué)技術(shù)提供了更為全面、準(zhǔn)確的生物信息,也是單細(xì)胞分析技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

2 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)概況

2016年,Joakim Lundeberg課題組[8]首次提出了空間轉(zhuǎn)錄組的概念,空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)[9]能夠獲得組織樣本中不同空間位置的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息,在單細(xì)胞測(cè)序的基礎(chǔ)上進(jìn)一步鑒定和區(qū)分功能基因在不同的空間位置上的表達(dá),2020年被Nature Methods評(píng)為年度技術(shù)[10]。當(dāng)前,根據(jù)空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)獲取空間信息的原理不同,主要分為基于原位捕獲和測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),基于顯微切割的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)和基于原位雜交的空間轉(zhuǎn)錄學(xué)技術(shù)等。其中,激光捕獲顯微切割術(shù)(laser capture microdissection,LCM)利用激光束切除識(shí)別組織區(qū)域,其精確性高便捷性好,被廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞、新鮮冷凍組織等。Chen等[11]將激光捕獲顯微切割術(shù)與單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合,通過整合與優(yōu)化單細(xì)胞測(cè)序和激光顯微切割技術(shù),構(gòu)建了一種能夠獲得少量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息、同時(shí)保留細(xì)胞原有位置信息的測(cè)序方法,這一技術(shù)又稱為Geo-seq(geographical position sequencing)。此外,原位雜交技術(shù)常用的包括MERFISH[12](multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization)和seqFISH等技術(shù)[13]。Eng等[14]基于原有的seqFISH技術(shù),設(shè)計(jì)了一種可以檢測(cè)到單個(gè)細(xì)胞內(nèi)10 000個(gè)基因的超高成像技術(shù),被稱為seqFISH+。與seqFISH技術(shù)相比,其成像效率提高了8倍,具有高通量、高精度和亞衍射極限分辨率的特點(diǎn),是揭示基因空間信息的重要研究技術(shù)。

3 單細(xì)胞測(cè)序與空間轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合應(yīng)用

隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展成熟,空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在分辨率和通量上也得到了大幅度提升。如表1所示,空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)能夠捕獲細(xì)胞的空間位置信息及相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù),但是目前無法達(dá)到單細(xì)胞分辨率,而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠在單個(gè)細(xì)胞水平構(gòu)建各個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜及其基因表達(dá),卻丟失了細(xì)胞的原始空間分布及通信網(wǎng)絡(luò)。兩者的結(jié)合實(shí)現(xiàn)互補(bǔ),能夠在單細(xì)胞水平描繪組織的空間圖譜及細(xì)胞的空間交互。目前,將單細(xì)胞數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合的方法主要包括兩種:去卷積[15](deconvolution)和映射[16](mapping)。去卷積是指從單個(gè)空間捕獲點(diǎn)中根據(jù)單細(xì)胞數(shù)據(jù)分離出離散的細(xì)胞亞型,而映射是指將單細(xì)胞數(shù)據(jù)定位到HPRI(high-plex RNA imaging)圖譜上或組織的特定區(qū)域中。隨著空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的更迭與發(fā)展,可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要整合各種空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)與單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù),在空間上揭示組織單細(xì)胞水平的全轉(zhuǎn)錄組信息,以進(jìn)一步描繪組織發(fā)生發(fā)育與疾病微環(huán)境中的特定細(xì)胞亞群及其空間位置上的通信網(wǎng)絡(luò)。

表1 單細(xì)胞測(cè)序與空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的原理與特點(diǎn)

4 單細(xì)胞測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀

口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)y(cè)序技術(shù)的要求具有特殊性,主要表現(xiàn)為口腔組織如牙周、牙髓組織量較小,在傳統(tǒng)測(cè)序背景下,組織樣本量及樣本活性較難達(dá)到要求,且口腔微生物菌群較復(fù)雜、難以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、對(duì)微生物的測(cè)序分析尚存在困難。而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能突破傳統(tǒng)測(cè)序的局限,使口腔組織的測(cè)序更為精確便捷。目前,隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展,常將單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)與空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)結(jié)合,以獲得高通量水平的單細(xì)胞分子信息及空間位置信息。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,主要應(yīng)用于口腔間充質(zhì)干細(xì)胞、口腔微生物、口腔組織發(fā)生發(fā)育和多種口腔疾病的研究中。

4.1 口腔間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有自我更新能力的基質(zhì)細(xì)胞[17]。口腔間充質(zhì)干細(xì)胞包括牙周干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙齦干細(xì)胞、來源于脫落乳牙的干細(xì)胞以及牙乳頭干細(xì)胞等[18]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有異質(zhì)性,表現(xiàn)在不同供體、不同組織來源、克隆亞群以及單細(xì)胞水平,而傳統(tǒng)的bulk測(cè)序難以區(qū)分出細(xì)胞亞群、揭示細(xì)胞的異質(zhì)性。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序作為研究干細(xì)胞異質(zhì)性的重要手段,在口腔間充質(zhì)干細(xì)胞領(lǐng)域已有初步應(yīng)用。牙周膜干細(xì)胞及牙髓干細(xì)胞是口腔間充質(zhì)干細(xì)胞的重要組成部分,Pagella等[19]通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩者具有極相似的分子特性,相比于其他亞群更高表達(dá)MYH1和THY1。而兩者的主要差別表現(xiàn)在牙周MSCs中高表達(dá)CCL2和編碼膠原蛋白的基因及SPARC/Osteonectin,這表明牙周微環(huán)境有利于MSCs向成纖維細(xì)胞樣分化,而牙髓MSCs中高表達(dá)CXCL14和RARRES1及KRT18,表明牙髓微環(huán)境中有利于MSCs的成骨分化。此外,Lee等[20]發(fā)現(xiàn)人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)主要表現(xiàn)為具有成骨分化潛能及成神經(jīng)分化潛能的亞群,并且高表達(dá)神經(jīng)和內(nèi)源系統(tǒng)相關(guān)基因;而人牙周膜干細(xì)胞(human dental periodontal ligament cells,hPDLSCs)主要為具有成肌分化潛能和成骨分化潛能的亞群,高表達(dá)成骨和成軟骨基因。

除了對(duì)牙髓、牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分析外,單細(xì)胞測(cè)序也應(yīng)用于頜骨骨髓干細(xì)胞及其與骨免疫微環(huán)境的相關(guān)研究。Lin等[21]發(fā)現(xiàn)與長骨相比,牙槽骨中的免疫微環(huán)境更為活躍,免疫細(xì)胞的占比也更高。在牙槽骨的免疫細(xì)胞亞群中,單核/巨噬細(xì)胞亞群與間充質(zhì)干細(xì)胞亞群的聯(lián)系最為密切,在長骨中,單核/巨噬細(xì)胞更高表達(dá)抑瘤素M以促進(jìn)MSCs的成骨分化且抑制MSCs的成脂分化。

目前,單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在口腔間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用主要集中在干細(xì)胞亞群的區(qū)分及生物信息分析,值得注意的是,在疾病微環(huán)境下,干細(xì)胞的異質(zhì)性是否會(huì)發(fā)生變化,干細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的通信是否會(huì)受到影響,尚需要進(jìn)一步的研究。

4.2 口腔微生物

口腔微生物群是僅次于腸道微生物群的第二復(fù)雜的人體微生物群落,包含700種細(xì)菌,也包括真菌、病毒等[22]?？谇晃⑸锶号c宿主的口腔健康及全身健康或疾病密切相關(guān)。研究表明口腔微生物與齲齒、牙周病、口臭等口腔問題關(guān)系密切,同樣也和心血管疾病、糖尿病等全身系統(tǒng)性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。傳統(tǒng)的口腔微生物測(cè)序方法主要是以16S核糖體核糖核酸基因特征區(qū)域測(cè)序和宏基因組測(cè)序?yàn)橹?但是其提供的生物學(xué)信息有限,尚難以對(duì)不易培養(yǎng)的微生物進(jìn)行測(cè)序。

近年來,隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,其在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用也日益普遍。Cross等[23]應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序和反向基因組學(xué)的方法培養(yǎng)了人口腔Sacchari bacteria菌門(TM7)的三個(gè)不同菌種,發(fā)現(xiàn)其均為放線菌的體表寄生物種,并且利用相同的方法,分離并培養(yǎng)出了一種先前無法培養(yǎng)的人口腔細(xì)菌SR1。Campbell等[24]通過單細(xì)胞基因組學(xué)測(cè)序首次從牙周炎患者口內(nèi)分離出綠灣菌。Beall等[25]通過單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)了與福賽坦納菌親緣關(guān)系相近的坦納菌BU063和坦納菌BU045,其中坦納菌BU063主要存在于健康牙周組織中,而坦納菌BU045則和牙周炎的發(fā)展密切相關(guān),為慢性牙周炎發(fā)病機(jī)制提供了新依據(jù)?？谇幻摿蚓鳛橐环N新的牙周致病菌,屬于難以分離培養(yǎng)的口腔微生物,傳統(tǒng)方法是通過硫酸鹽還原生理學(xué)的原理,在純培養(yǎng)中富集并隨后分離而得,而Cross等[26]根據(jù)單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)分析微生物的生理特性分離出了口腔脫硫菌,并發(fā)現(xiàn)口腔脫硫菌主要依賴梭桿菌產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)生長,其毒性及促炎特性也是由其他的口腔微生物轉(zhuǎn)移獲得。

由于微生物的體積較小、存在細(xì)胞壁且mRNA缺乏polyA尾等因素,使得對(duì)細(xì)菌等微生物的測(cè)序存在一定的局限性。目前,針對(duì)原核細(xì)胞RNA的測(cè)序方法包括Split-pool[27]和BacDrop[28]等,分別刊登在Science和Cell上。隨著微生物單細(xì)胞測(cè)序(MsRNA-seq)的更新及應(yīng)用,細(xì)菌群體耐藥、細(xì)菌與宿主相互作用及微生物時(shí)序表達(dá)等研究在未來會(huì)取得新的突破。特別在口腔微生物領(lǐng)域,可應(yīng)用于如單個(gè)牙周致病菌與宿主之間的相互作用機(jī)制、齲病致病菌的時(shí)序表達(dá)差異等,進(jìn)一步揭示口腔微生物的致病機(jī)制及其與宿主之間的相互作用關(guān)系。雖然目前尚無口腔微生物的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,新的高通量空間轉(zhuǎn)錄組成像方法已能觀察銅綠假單胞菌生物膜在微尺度上的空間信息[29]。

4.3 口腔組織發(fā)生發(fā)育

牙發(fā)育依賴于來自顱神經(jīng)嵴的間充質(zhì)細(xì)胞和來源于外胚層的上皮細(xì)胞相互作用,原發(fā)性上皮帶增厚向結(jié)締組織內(nèi)增生,其周圍的間充質(zhì)聚集形成上皮芽最終發(fā)育成釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙髓和牙周膜。在這一過程中,大量信號(hào)分子參與形成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[30]。

目前,單細(xì)胞測(cè)序已被廣泛應(yīng)用于揭示牙發(fā)育的軌跡以及發(fā)育過程中的細(xì)胞間通信。Shi等[31]通過對(duì)未成熟恒牙牙胚進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序,發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞占大多數(shù),并通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β、腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞介素-1調(diào)節(jié)其他細(xì)胞。Matsubara等[32]借助成像技術(shù),在單細(xì)胞水平上可視化牙齒血管系統(tǒng)的3D結(jié)構(gòu),鑒定出一種獨(dú)特牙周尖樣內(nèi)皮細(xì)胞,其參與牙本質(zhì)生成及牙齒礦化過程。在成牙本質(zhì)細(xì)胞的控制下,牙周尖樣內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出較高的血管生成活性和可塑性,正反饋促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的成熟。以上研究表明,單細(xì)胞測(cè)序有助于探究牙發(fā)育過程中牙本質(zhì)分泌礦化與血管、神經(jīng)和免疫細(xì)胞發(fā)育的耦聯(lián)。

此外,單細(xì)胞測(cè)序也有助于進(jìn)一步揭示調(diào)控牙發(fā)育的關(guān)鍵基因及信號(hào)通路。Chiba等[33]結(jié)合使用單細(xì)胞RNA測(cè)序及CAGE-seq技術(shù)鑒定參與牙齒發(fā)育的基因,發(fā)現(xiàn)成釉細(xì)胞新標(biāo)記基因FXYD4和ACPP,在成釉細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮重要的功能。神經(jīng)嵴細(xì)胞是頜面部生長發(fā)育的基礎(chǔ),但是其遷移分化等具體機(jī)制尚不清楚,Jing等[34]選取不同發(fā)育階段的小鼠磨牙進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)IGF信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用擾亂了牙周膜細(xì)胞的發(fā)育,并且發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Foxp4的缺失可導(dǎo)致牙周膜細(xì)胞的發(fā)育缺陷。Takada等[35]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Mkx通過調(diào)節(jié)特定細(xì)胞群和基因表達(dá)來維持牙周膜內(nèi)的平衡,并且在Mkx缺失的牙周膜中間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的骨化相關(guān)基因表達(dá)增高且巨噬細(xì)胞和炎癥介質(zhì)數(shù)量增加。

目前空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)尚未應(yīng)用于牙發(fā)育的研究,主要是由于當(dāng)前的空間轉(zhuǎn)錄組以基于新鮮的超薄冷凍組織切片為主,牙和骨等硬組織的冷凍切片和組織透明化存在難度,導(dǎo)致分辨率和基因檢測(cè)效率不足。然而隨著針對(duì)石蠟組織切片的空間轉(zhuǎn)錄測(cè)序技術(shù)的突破[36],未來這一方面的研究將獲得更多的關(guān)注。

4.4 口腔疾病

4.4.1 牙周炎

在牙周炎發(fā)生發(fā)展的過程中,宿主的免疫炎癥反應(yīng)是決定其嚴(yán)重程度的重要因素。Lee等[37]通過構(gòu)建牙周炎患者及健康對(duì)照組外周血單核細(xì)胞表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)在牙周炎疾病狀態(tài)下,CRIP1可作為特異性全身炎癥指標(biāo)在各細(xì)胞類型中明顯增加,同時(shí)BTLA和IFNG信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在疾病狀態(tài)下也明顯增強(qiáng)。Qian等[38]通過對(duì)牙周炎患者及健康人群的牙周組織進(jìn)行單細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)HLA-DR的內(nèi)皮細(xì)胞和CXCL13+的成纖維細(xì)胞與宿主免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān),而促炎性NLRP3+巨噬細(xì)胞在牙周炎進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。Chen等[39]構(gòu)建了牙周骨免疫微環(huán)境的細(xì)胞圖譜以進(jìn)一步觀察在牙周炎疾病背景下骨免疫細(xì)胞類型的改變,發(fā)現(xiàn)牙周炎患者中高表達(dá)趨化因子的TNFRSF21+成纖維細(xì)胞富集,而隨著牙周基礎(chǔ)治療的進(jìn)行,CD55+間充質(zhì)干細(xì)胞、APOE+前成骨細(xì)胞和IBSP+成骨細(xì)胞逐漸降低。此外,Caetano等[40]發(fā)現(xiàn)在牙周炎環(huán)境中巨噬細(xì)胞比其他細(xì)胞表達(dá)更高的相關(guān)易感基因,如IL1B、PTGS2/COX2、FCGR2A、IL10 和IL1A等在巨噬細(xì)胞亞群中有更為特異性的表達(dá)。而對(duì)于患有全身系統(tǒng)性疾病的牙周炎患者,其機(jī)體的免疫應(yīng)答也有所不同。Agrafioti等[41]通過研究患有或不患有2型糖尿病的牙周炎患者,發(fā)現(xiàn)患有2型糖尿病的牙周炎患者巨噬細(xì)胞中高表達(dá)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物亞單位RELA,這表明巨噬細(xì)胞在牙周炎中的異質(zhì)性和過度活化可能與牙周炎的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)展相關(guān),并可能在2型糖尿病患者中進(jìn)一步增強(qiáng)。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)雖能鑒別健康及炎癥牙周組織中的基因表達(dá)差異,但是尚不能將基因表達(dá)定位到特定的細(xì)胞區(qū)域。Lundmark等[42]聯(lián)合應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序與空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù),在高通量的水平定量且定位了牙周炎時(shí)牙齦組織中的基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)上皮及結(jié)締組織炎性浸潤區(qū)和非浸潤區(qū)三個(gè)區(qū)域的基因表達(dá)差異,其中在結(jié)締組織炎性浸潤區(qū)中IGLL5、SSR4、M2B1、XBP1四個(gè)基因表達(dá)上調(diào)最為明顯。

4.4.2 口腔癌

腫瘤異質(zhì)性普遍存在于腫瘤細(xì)胞間,同一腫瘤內(nèi)存在不同的細(xì)胞亞型,表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)、增殖和轉(zhuǎn)移潛力不同,其通過與腫瘤微環(huán)境相互作用促使腫瘤分化形成不同細(xì)胞亞型并發(fā)生轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。因此,了解腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性及腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤的診斷、明確腫瘤性質(zhì)以及針對(duì)性治療均有重要影響。

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)作為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中最常見的亞型,其診斷及防治是口腔癌診療的關(guān)鍵。單細(xì)胞技術(shù)已被應(yīng)用于探究OSCC中的腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性。已知在上皮癌發(fā)生發(fā)展過程中,部分上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(partial epithelial-mesenchymal transition,p-EMT)是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的中間狀態(tài),此時(shí)癌細(xì)胞同時(shí)表現(xiàn)出間充質(zhì)和上皮特征[43]。Huynh等[44]通過整合分析OSCC的單細(xì)胞數(shù)據(jù),探究腫瘤微環(huán)境中p-EMT亞群以及與其密切相關(guān)的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞亞群間的細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)兩者之間的靶向性受配體交互作用與OSCC的轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)。Puram等[45]通過對(duì)比分析未治療的OSCC原發(fā)性腫瘤以及已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤的單細(xì)胞數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞在表達(dá)與細(xì)胞周期、應(yīng)激、缺氧、上皮分化和部分上皮-間充質(zhì)(p-EMT)轉(zhuǎn)化相關(guān)的信號(hào)方面有所差異,這進(jìn)一步提示p-EMT可作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分級(jí)和不良病理特征的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。Chen等[46]從OSCC患者的腫瘤和鄰近正常組織中分離出T細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序鑒定并描繪了它們的發(fā)育軌跡,發(fā)現(xiàn)在OSCC腫瘤中可見耗竭CD8+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞富集,且TOX是腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞功能障礙的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子并參與介導(dǎo)腫瘤免疫抑制。Hsieh等[47]發(fā)現(xiàn)在白念珠菌感染的情況下OSCC的癌變機(jī)制與未感染者不同,在無白念珠菌感染的OSCC中,IL2/STAT5、TNFα/NFκB和TGFβ信號(hào)通路是其主要癌變機(jī)制,而有白念珠菌感染的情況下可發(fā)現(xiàn)KRAS信號(hào)通路和E2F下游靶基因,Stratifin是感染白念珠菌OSCC的特異性標(biāo)志物。因此,單細(xì)胞測(cè)序不僅為理解OSCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供了新策略,還為OSCC的檢測(cè)、分類和預(yù)后分析提供了新依據(jù)。

口腔鱗狀細(xì)胞癌具有神經(jīng)周浸潤(perineural invasion,PNI)特性,但尚未有明確的PNI診斷標(biāo)準(zhǔn)。Schmitd Ligia等[48]利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了PNI陽性與PNI陰性患者神經(jīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)與腫瘤之間的距離不同其基因表達(dá)也有差異,這進(jìn)一步證明了PNI是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子,且神經(jīng)-腫瘤距離越近預(yù)后越差,這些結(jié)果也支持基于神經(jīng)-腫瘤距離對(duì)PNI的分類。單細(xì)胞測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用為挖掘時(shí)空特異性的口腔癌標(biāo)志物和治療靶標(biāo)提供了可行性。

4.4.3 口腔黏膜病

口腔黏膜由上皮及上皮下結(jié)締組織構(gòu)成,作為人體的第一道防線,主要功能是屏障、感覺及分泌功能,其中,黏膜的保護(hù)屏障功能尤為重要。口腔黏膜屏障包括理化屏障和免疫屏障,主要由上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞維持,同時(shí),基質(zhì)細(xì)胞也發(fā)揮著重要功能。因此,口腔黏膜內(nèi)各細(xì)胞間的平衡及通信對(duì)維持口腔黏膜微環(huán)境的穩(wěn)定及口腔黏膜疾病的發(fā)生發(fā)展極為重要,特定口腔黏膜位置單細(xì)胞水平的高通量測(cè)序能更進(jìn)一步揭示其內(nèi)在聯(lián)系。

Zhao等[49]描繪了人正?？谇火つさ膯渭?xì)胞圖譜,發(fā)現(xiàn)其中一半為免疫細(xì)胞,其次為基質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)和上皮細(xì)胞,通過亞群分析發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞構(gòu)成免疫細(xì)胞的主要成分,其中主要是γδ T細(xì)胞,而巨噬細(xì)胞包括有兩種不同的激活狀態(tài)及靜息狀態(tài);此外,成纖維細(xì)胞作為主要的基質(zhì)細(xì)胞,其與其他細(xì)胞間的通信最為頻繁,這也進(jìn)一步表明了上皮-基質(zhì)-免疫細(xì)胞間通信在維持黏膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要作用。而當(dāng)牙周炎存在時(shí),口腔黏膜(牙齦)出現(xiàn)炎癥表現(xiàn),Williams等[50]通過構(gòu)建健康人和牙周炎患者口腔黏膜的單細(xì)胞圖譜(圖1),發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞在牙周炎中過度活化,進(jìn)而招募免疫細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞,從而促進(jìn)炎癥發(fā)生,揭示了基質(zhì)細(xì)胞-免疫細(xì)胞軸在疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用。在機(jī)體疾病狀態(tài)下,細(xì)胞間的平衡同樣被打亂,Wang等[51]發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病(T2DM)的背景下,口腔黏膜的屏障功能發(fā)生障礙,上皮/基質(zhì)比率降低,成纖維細(xì)胞中的炎性因子增加。這種具有轉(zhuǎn)錄多樣性及與中性粒細(xì)胞、γδ T細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞相互作用的成纖維細(xì)胞亞群被定義為“免疫樣”基質(zhì)細(xì)胞。這也從上皮-基質(zhì)-免疫軸的角度闡明T2DM與口腔黏膜疾病及牙周損害之間的潛在聯(lián)系。而在特定的口腔黏膜疾病中,也存在不同的免疫微生態(tài),Li等[52]發(fā)現(xiàn)口腔黏膜扁平苔蘚(oral lichen planus,OLP)組織中的免疫激活狀態(tài),主要表現(xiàn)為以Trm和Tem細(xì)胞為主的T細(xì)胞富集以及表現(xiàn)出的更高的細(xì)胞毒性,同時(shí)淋巴細(xì)胞遷移相關(guān)通路也被激活。成纖維細(xì)胞通過促進(jìn)免疫細(xì)胞向結(jié)締組織外滲參與到免疫過程中,這為OLP的診斷及干預(yù)提供了新的見解。

A:口腔黏膜組織的示意圖,E:上皮,LP:固有層;B:通過單細(xì)胞測(cè)序鑒定的主要細(xì)胞類型的UMAP圖示(左)和按組織類型排列的相對(duì)細(xì)胞比例條形圖(右)。

為進(jìn)一步揭示口腔黏膜疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,Caetano等[53]將單細(xì)胞測(cè)序與空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)結(jié)合(圖2),研究細(xì)胞間的空間交互作用,并且聯(lián)合高分辨率多重?zé)晒怆s交技術(shù),發(fā)現(xiàn)了一群位于高度免疫原性區(qū)的成纖維細(xì)胞亞群,其通過CXCL8和CXCL10招募淋巴細(xì)胞,這也進(jìn)一步表明了基質(zhì)細(xì)胞在局部免疫反應(yīng)中的作用,揭示疾病狀態(tài)下口腔黏膜細(xì)胞的區(qū)域異質(zhì)性。

A:人類口腔黏膜的示意圖,顯示不同的上皮區(qū)域,口腔上皮(OE),口腔溝內(nèi)上皮(OSE)和連接上皮(JE);B:典型的口腔黏膜炎癥切面的H&E圖像,顯示了上皮和結(jié)締組織區(qū)域之間的界限;C:使用BayesSpace分析切片中人類口腔黏膜區(qū)域。

5 未來展望

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)使生命科學(xué)領(lǐng)域中各學(xué)科的研究取得巨大進(jìn)步,通過單細(xì)胞水平的高通量測(cè)序分析能夠揭示新的細(xì)胞亞群、識(shí)別細(xì)胞分化軌跡、鑒別不同疾病背景下的細(xì)胞信號(hào)通路。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)目前已經(jīng)能夠檢測(cè)幾乎所有的組學(xué),包括全基因組、代謝組、蛋白組等,多組學(xué)研究也更深入地揭示組織細(xì)胞基因表達(dá)。然而,在單細(xì)胞懸液制備過程中其組織空間信息也會(huì)丟失,空間位置信息也是決定細(xì)胞命運(yùn)的重要因素。在2022年空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)入選為Nature值得關(guān)注的七大技術(shù)之一,空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)與單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用也逐漸受到關(guān)注。目前,單細(xì)胞測(cè)序與空間轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合已應(yīng)用于研究不同領(lǐng)域的基因表達(dá)差異對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的影響,包括肝病的病理生理機(jī)制研究[54]、結(jié)直腸癌病理機(jī)制[55]、腸道發(fā)育[56]、心血管疾病發(fā)生發(fā)展等[57]。

在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用已日漸普遍,在口腔組織的發(fā)育與口腔疾病的發(fā)展研究中發(fā)揮了重要作用,但空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)相關(guān)的口腔研究仍在起步階段。通過聯(lián)合兩種技術(shù),未來可用于構(gòu)建口腔組織發(fā)育的動(dòng)態(tài)表達(dá)圖譜與口腔疾病的分子差異表達(dá)的空間圖譜;探索口腔組織發(fā)生過程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué),分子特性的差異,以及在不同發(fā)育階段的空間分布及基因表達(dá);研究牙周炎癥微環(huán)境下不同細(xì)胞之間的相互作用,探究炎癥區(qū)域與正常組織的細(xì)胞構(gòu)成及基因表達(dá)特征;研究口腔癌的腫瘤內(nèi)空間分布異質(zhì)性,通過分析鄰近腫瘤區(qū)域的基因表達(dá)分布對(duì)腫瘤進(jìn)行重新分層并識(shí)別診斷標(biāo)志物等。

未來,隨著單細(xì)菌測(cè)序、石蠟組織切片空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等技術(shù)的突破和測(cè)序分辨率的提高,探究組織、細(xì)胞和微生物的空間位置信息及不同空間位置的基因表達(dá)差異將成為研究的熱點(diǎn),也將為臨床疾病的診斷治療帶來新的參考。