張?zhí)?，宋萌萌，賈文文，喬元勛

1 山東中醫(yī)藥大學(xué) 山東濟(jì)南 250014

2 山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院 山東泰安 271000

癌性厭食（cancer-related anorexia，CA）是指與癌癥或抗癌治療相關(guān)的食欲減少甚至喪失，伴或不伴體重下降[1]。CA按照病因分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。原發(fā)性厭食的具體臨床機(jī)制尚不清晰。繼發(fā)性厭食多由于抑郁、便秘、疼痛和接受抗腫瘤治療等導(dǎo)致[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療，尚存在一定的不良反應(yīng)[3-4]，而CA是癌癥患者不容忽視的一大癥狀。

丹參性苦，微寒，歸心、肝二經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的作用。莪術(shù)辛苦溫，入肝、脾經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛之功。大量臨床研究表明丹參[5-7]、莪術(shù)[8-9]具有抗腫瘤的作用。同時丹參[10]、莪術(shù)[11-13]作為復(fù)方藥物的組成之一，具有改善進(jìn)食情況的作用，但機(jī)制尚不明確。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接預(yù)測丹參與莪術(shù)治療CA的靶點(diǎn)，明確其作用機(jī)制，了解其作用原理，為進(jìn)一步研究丹參—莪術(shù)治療CA提供具體的理論依據(jù)。

資料與方法

1 藥物成分獲取

以“丹參、莪術(shù)”為關(guān)鍵詞，檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），按照ADME參數(shù)設(shè)置化合物分子的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18進(jìn)行篩選，獲得丹參、莪術(shù)的化合物分子，結(jié)合文獻(xiàn)[14-17]對莪術(shù)的化學(xué)成分進(jìn)行補(bǔ)充。

2 藥物基因靶點(diǎn)獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對獲得的丹參、莪術(shù)的化合物進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白獲取，結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）獲取對應(yīng)的基因。文獻(xiàn)中獲取得到的莪術(shù)成分使用PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html），設(shè)定條件為物種Human Protein、Norm Fit>0.9，篩選得出對應(yīng)靶點(diǎn)基因。

3 藥物基因可視化分析

去重后利用cytoscape3.8.2軟件實(shí)施網(wǎng)絡(luò)可視化分析。

4 疾病基因靶點(diǎn)的獲取

以“cancer-related anorexia”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https： //www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https： //omim.org/）中篩選，合并去重后得到CA相關(guān)的基因靶點(diǎn)。

5 疾病和藥物交集基因獲取

將疾病基因與藥物交集基因輸入“微生信”（http：//www.bioinformatics.com.cn/），獲取韋恩圖。

6 疾病—藥物蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（PPI）及可視化分析

將疾病和藥物交集基因?qū)С龅絊tring數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），并設(shè)定物種為“Homo spanies”，將最低相互作用評分（minimum required interaction score）設(shè)置為medium confidence（0.400），并勾選隱藏游離的蛋白質(zhì)。將結(jié)果導(dǎo)出到cytoscape3.8.2軟件進(jìn)行調(diào)整。

7 GO富集分析與KEGG富集通路分析

將潛在的基因靶點(diǎn)上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/）中，選擇物種為“H.sapiens”，進(jìn)行custom analysis。分別得到GO富集分析及KEGG富集通路分析結(jié)果。KEGG富集通路分析按照P值進(jìn)行升序排列；GO分析按logP值進(jìn)行升序排列，結(jié)果利用“微生信”（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化展示。

8 核心活性成分-靶點(diǎn)分子對接分析

利用PDB數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶蛋白，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載核心活性成分的mol2結(jié)構(gòu)，利用Autodock Tools進(jìn)行去水、加氫、設(shè)置旋轉(zhuǎn)鍵、盲對接等操作，再進(jìn)行分子對接，最終結(jié)果通過pymol進(jìn)行可視化處理。

結(jié)果

1 丹參、莪術(shù)化學(xué)成分的篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，經(jīng)ADME篩選（OB≥30%，DL≥0.18）、文獻(xiàn)補(bǔ)充、篩選后共得到丹參58個有效成分，莪術(shù)8個有效成分。見表1。

2 丹參、莪術(shù)化學(xué)物預(yù)測靶點(diǎn)

通過Uniprot數(shù)據(jù)庫、PharmMaper數(shù)據(jù)庫檢索對應(yīng)的基因，丹參58個化合物共有833個基因，莪術(shù)8個化合物共有90個基因，利用cytoscape3.8.2軟件建立基因靶點(diǎn)與化合物的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見圖1。

圖1 丹參—莪術(shù)基因靶點(diǎn)—化合物

3 疾病-藥物交集基因

將丹參、莪術(shù)的基因靶點(diǎn)去重后得到丹參126個基因，莪術(shù)54個基因，并將疾病基因輸入微生信網(wǎng)站得到交集基因，丹參-莪術(shù)交集基因?yàn)?5個，CA與丹參-莪術(shù)的交集基因?yàn)?4個。見圖2。

圖2 藥物-疾病交集基因

4 蛋白互作圖

基于String數(shù)據(jù)庫分析“丹參-莪術(shù)”與CA靶點(diǎn)之間的交互作用，使用cytoscape3.8.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析，一個節(jié)點(diǎn)代表一個蛋白質(zhì)，邊則代表蛋白相互之間的作用關(guān)系，其中1個游離的蛋白質(zhì)被舍棄，共13個點(diǎn)，22條邊。利用Analyse network進(jìn)行度的分析，度值越大則節(jié)點(diǎn)越大，顏色越紅，表示“丹參-莪術(shù)”通過此靶點(diǎn)治療CA的可能性越大。邊按照combined score進(jìn)行顏色、粗細(xì)調(diào)節(jié)，顏色越紅，線條越粗，表示得分越高，蛋白互作關(guān)系越強(qiáng)。見圖3、圖4。

圖3 string原圖

圖4 可視化后的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

5 GO富集分析

GO分析中按logP值進(jìn)行升序排列，結(jié)果顯示生物過程（BP）有83個條目，細(xì)胞組分（CC）有4個條目，分子功能（MF）有18個條目。其中BP、MF展示前10個條目，CC展示全部條目。BP主要涉及細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、類固醇激素反應(yīng)等；CC主要涉及膜小凹、膜微區(qū)、膜筏、質(zhì)膜筏；MF主要涉及核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、核類固醇受體活性、類固醇結(jié)合等。見圖5。

圖5 GO富集分析結(jié)果

6 KEGG富集通路分析

KEGG富集通路分析結(jié)果共得到20條信號通路，包括化學(xué)致癌-受體激活通路、癌癥信號通路、雌激素信號通路、乳腺癌信號通路、催乳素信號通路、內(nèi)分泌耐藥的信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等，按照P值進(jìn)行升序排列，并將該結(jié)果通過微生信網(wǎng)站進(jìn)行可視化分析。見圖6。

圖6 KEGG富集通路分析結(jié)果

7 分子對接

通過cytoscape3.8.2軟件進(jìn)行degree篩選，將PPI得出的前2個核心靶點(diǎn)（MAPK1、ESR1）通過PDB數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為受體（3SA0、1XPC），分別與前3個核心成分丹參新醌（dan-shexinkum d，MOL007093）、二氫丹參內(nèi)酯（dihydrotanshinlactone，MOL007100）、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮（2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3，4-dione，MOL007041）進(jìn)行分子對接，對接次數(shù)設(shè)置為50次。通常認(rèn)為當(dāng)結(jié)合能＜-5kcal/mol時，靶點(diǎn)與藥物成分結(jié)合較好，具體結(jié)合能見表2，其中MOL007100與3SA0、 MOL007093與1XPC、MOL007093與3SA0可見氫鍵連接。見圖7-圖9。

圖7 MOL007100-3SA0

圖8 MOL007093-1XPC

圖9 MOL007093-3SA0

表2 分子對接結(jié)合能（kcal/mol）

討論

CA具有發(fā)病率高的特點(diǎn)，是癌癥患者常見的伴發(fā)癥狀。但其出現(xiàn)的機(jī)制尚不明了，影響因素較多。針對CA，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)可采用糖皮質(zhì)激素、大麻素、醋酸甲地孕酮等藥物[18]。而目前中醫(yī)治療上主要應(yīng)用經(jīng)方、驗(yàn)方、中成藥注射劑及中醫(yī)外治法[19]，但缺少指南統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充，篩選得出丹參—莪術(shù)的活性成分，再由GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中得到CA的疾病靶點(diǎn)，后利用String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互作分析，并通過cytoscape3.8.2軟件進(jìn)行可視化分析，篩選得到核心靶點(diǎn)，最終進(jìn)行富集分析及分子對接。結(jié)果表明丹參新醌、二氫丹參內(nèi)酯、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮與MAPK1、ESR1有較強(qiáng)的結(jié)合能力，在丹參、莪術(shù)治療CA過程中具有重要作用。

MAPK是絲裂原活化蛋白激酶，也是CXC趨化因子的靶標(biāo)之一[20]，趨化因子可結(jié)合相應(yīng)受體，參與腫瘤形成、免疫反應(yīng)等過程[21]，CXCL14作為趨化因子家族成員，參與了體重控制過程，并且可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控攝食行為活動中起到重要作用[22]。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是由腸道L細(xì)胞所產(chǎn)生的激素，具有刺激胰島素分泌、利尿、減少胃排空、減少炎癥和細(xì)胞凋亡等作用[23]，研究表明GLP-1受體激活能夠增加MAPK磷酸化達(dá)到抑制食物攝入的目的[24]。同時MAPK1是GATA3轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，去泛素化酶USP21可以通過與GATA3結(jié)合來調(diào)節(jié)MAPK1的表達(dá)[25]。當(dāng)血管緊張素Ⅱ1型受體與血管緊張素Ⅱ結(jié)合后可激活細(xì)胞內(nèi)MAPK途徑以觸發(fā)鈉攝入[26]。另外，通過果蠅實(shí)驗(yàn)證明Dop1R2/Raf/MAPK通路是多巴胺信號在食欲嗅覺記憶穩(wěn)定過程中的關(guān)鍵下游效應(yīng)子[27]，能夠以此來穩(wěn)定食欲和嗅覺的記憶。

ESR1作為編碼雌激素受體α（estrogen receptor，ERα）的基因，對于乳腺癌[28]、子宮內(nèi)膜癌[29]、肝內(nèi)膽管癌[30]等具有臨床意義。ERα作為重要的雌激素受體之一，是調(diào)節(jié)正常攝食行為、維持正常的能量消耗和脂肪分布必不可少的[31]。ESR1能夠調(diào)節(jié)SLC2A4基因的表達(dá)，改變組織胰島素敏感型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）含量，最終調(diào)節(jié)血糖[32]。也有研究表明ESR1與限制性神經(jīng)性厭食有關(guān)，但相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性還沒有已知的功能，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)[33]。

KEGG通路富集分析表明丹參、莪術(shù)治療CA可能與雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等有關(guān)。雌激素信號通路有助于對抗腫瘤免疫的異常調(diào)節(jié)，還可能逆轉(zhuǎn)出現(xiàn)免疫抑制的腫瘤微環(huán)境[34]。雌激素可以與GLP-1結(jié)合形成GLP-1-雌激素偶聯(lián)物，其存在可以將雌激素特異性遞送到表達(dá)胰高血糖素樣肽-1受體（GLP-1R）的區(qū)域[35]，而SIM1神經(jīng)元中的ERα可以部分介導(dǎo)GLP-1-雌激素偶聯(lián)物，從而發(fā)揮減重作用[36]。此外，在已被切除卵巢的大鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，證實(shí)雌二醇（E2）具有抑制食物攝入的效力[37]。癌癥患者的免疫系統(tǒng)會釋放細(xì)胞因子，TNF-α作為其中之一，可通過血腦屏障，與大腦內(nèi)皮細(xì)胞管腔表面相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致影響食欲下降的物質(zhì)的釋放[13]。在腫瘤惡病質(zhì)患者中，血液TNF-α水平也出現(xiàn)顯著增高，且與體重穩(wěn)定組的腫瘤患者相比，腫瘤惡病質(zhì)患者的皮下脂肪組織中TNF-αmRNA呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[38]。

綜上所述，本研究針對丹參、莪術(shù)治療CA的機(jī)制、作用靶點(diǎn)、通路進(jìn)行預(yù)測，并運(yùn)用分子對接進(jìn)行驗(yàn)證，可知丹參、莪術(shù)的前3個核心成分為丹參新醌、二氫丹參內(nèi)酯、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮并通過MAPK1、ESR1核心靶點(diǎn)入手，調(diào)節(jié)Estrogen signaling pathway、TNF signaling pathway等信號通路，達(dá)到改善患者食欲的目的。后續(xù)可繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究丹參、莪術(shù)治療CA的臨床效果，提供一定的指導(dǎo)意義。