陳孟瑤，肖曉燕，蘇聯(lián)麟，王雅慧，顏帥

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院 江蘇蘇州 215009

2 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江蘇南京 210023

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的常見(jiàn)癌癥之一，手術(shù)治療聯(lián)合化療是結(jié)直腸癌的目前主流治療方法[1]。晚期患者輔助化療殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，亦導(dǎo)致正常上皮細(xì)胞損傷，產(chǎn)生嚴(yán)重的胃腸道毒性，從而出現(xiàn)結(jié)構(gòu)、功能和免疫學(xué)改變黏膜損傷——化療性腸黏膜炎（Chemotherapy-induced intestinal mucositis，CIM）[2]，嚴(yán)重影響腫瘤的治療進(jìn)程及預(yù)后。目前針對(duì)CIM的管理以支持性護(hù)理為主，輔助用藥，治療效果欠佳，且部分藥物價(jià)格高昂，即使遵循指南聯(lián)合用藥，化療性腸黏膜炎的總體控制率有限，臨床上缺乏行之有效的方法[3]。因此，研究影響CIM發(fā)生的因素，尋求高效低毒、經(jīng)濟(jì)、患者接受度高的輔助干預(yù)手段，抑制或阻斷CIM產(chǎn)生的根本必要途徑，有助于改善結(jié)直腸癌化療患者的預(yù)后，對(duì)其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療和提高生活質(zhì)量有重大的意義。中醫(yī)認(rèn)為，CIM臨床癥狀屬于“泄瀉”“痢疾”等范疇，病位主要在脾胃和大小腸，主要病機(jī)為機(jī)體受濕熱、疫毒、寒濕結(jié)于腸腑，氣血壅滯，大腸傳導(dǎo)失司，屬寒熱并存、虛實(shí)夾雜證，因此，以清上溫下、平調(diào)寒熱、扶正祛邪為主要治法[4]。

半夏瀉心湯作為《傷寒論》經(jīng)典類(lèi)方，2018年選入《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[5]。臨床應(yīng)用廣泛，它由半夏、黃連、黃芩、干姜、甘草、人參、大棗7味藥組成[6]。該方具有調(diào)和肝脾、平調(diào)寒][熱、消痞散結(jié)之功效，主治寒熱錯(cuò)雜之痞證，現(xiàn)代常用于治療胃腸炎、胃潰瘍等胃強(qiáng)脾弱、寒熱錯(cuò)雜癥[7-8]以及胃癌術(shù)后狀態(tài)[9]等，是極具潛在開(kāi)發(fā)意義的經(jīng)典名方。半夏瀉心湯的適應(yīng)癥與CIM的典型癥狀相對(duì)應(yīng)，且已有研究表明半夏瀉心湯能夠有效防治炎癥性腸病，增強(qiáng)免疫活性，降低炎癥，保護(hù)胃腸黏膜[10-11]。

基于半夏瀉心湯治療CIM的相關(guān)研究匱乏，本文篩選獲得半夏瀉心湯的潛在活性成分，并預(yù)測(cè)活性成分的潛在治療CIM靶點(diǎn)，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，挖掘潛在活性成分的治療CIM的核心靶點(diǎn)并預(yù)測(cè)作用機(jī)制。最后運(yùn)用分子對(duì)接驗(yàn)證半夏瀉心湯治療CIM機(jī)制，為挖掘半夏瀉心湯治療CIM有效成分及作用機(jī)制提供參考。

方法

1 半夏瀉心湯活性成分和靶標(biāo)篩選

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），對(duì)半夏瀉心湯中的7味組成藥物（半夏、黃連、黃芩、干姜、甘草、人參、大棗）進(jìn)行檢索，初步篩選獲取口服利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥0.18的成分及其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。利用Uniprot蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）獲得靶蛋白對(duì)應(yīng)的靶基因名稱(chēng)，刪除沒(méi)有靶點(diǎn)的活性成分與重復(fù)的靶基因，獲得活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)。

2 半夏瀉心湯治療CIM靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及藥物與疾病共同靶點(diǎn)獲取

以“Chemotherapy-induced intestinal mucositis”為關(guān)鍵詞對(duì)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www. genecards.org）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca/）進(jìn)行檢索，篩選相關(guān)靶點(diǎn)。整合各數(shù)據(jù)庫(kù)篩選結(jié)果，刪除重復(fù)的靶點(diǎn)，即得到CIM的相關(guān)靶點(diǎn)。將半夏瀉心湯活性成分靶點(diǎn)與CIM靶點(diǎn)取交集，通過(guò)venny 2.1.0繪制韋恩圖，得到半夏瀉心湯與疾病CIM的共同靶點(diǎn)。

3 化學(xué)成分與疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用CytoScape 3.6.1構(gòu)建化學(xué)成分、疾病、靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。采用軟件內(nèi)置工具分析成分和靶點(diǎn)的連接度、介度、緊密度等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，以網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析關(guān)鍵靶點(diǎn)和主要藥效成分。為了進(jìn)一步研究半夏瀉心湯的作用機(jī)制，利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org）構(gòu)建交集靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。

4 化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

生物功能注釋包括基因本體（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書(shū)富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）兩部分。將半夏瀉心湯治療CIM的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程和KEGG富集分析。結(jié)果利用微生信（http：//www. bioinformatics.com.cn/?p=1）實(shí)現(xiàn)可視化。

5 分子對(duì)接

利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）檢索半夏瀉心湯治療CIM的關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)并下載，使用AutoDock 4.2在線平臺(tái)對(duì)蛋白及化合物進(jìn)行去加氫、加電荷處理后，進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證。

結(jié)果

1 半夏瀉心湯活性成分篩選和靶標(biāo)預(yù)測(cè)

經(jīng)篩選后共獲得275種活性成分，其中人參86種，半夏13種，黃芩36種，黃連14種，干姜5種，甘草92種，大棗29種，包括山萘酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、黃芩素（wogonin）和豆甾醇（Stigmasterol）等。半夏瀉心湯中不同的中藥里面存在相同的化合物的情況。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)找出各藥物作用靶點(diǎn)，人參94個(gè)，半夏80個(gè)，黃芩92個(gè)，黃連162個(gè)，干姜31個(gè)，甘草214個(gè)，大棗181個(gè)，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點(diǎn)254個(gè)。半夏瀉心湯的主要化合物及靶標(biāo)見(jiàn)表1。結(jié)果表明半夏瀉心湯發(fā)揮療效可能與多種有效成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)密切相關(guān)。

2 半夏瀉心湯治療CIM潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用Genecards、OMIM、TTD、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)，最終得到694個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。韋恩圖結(jié)果顯示，半夏瀉心湯與CIM共同靶點(diǎn)有99個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 半夏瀉心湯化學(xué)成分和疾病靶點(diǎn)韋恩圖

3 半夏瀉心湯治療CIM“化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

CytoScape 3.6.1構(gòu)建的藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中總共包括445個(gè)節(jié)點(diǎn)和3372條邊，各藥物的化合物分子分別用不同顏色表示，見(jiàn)圖2。在網(wǎng)絡(luò)中，與節(jié)點(diǎn)連接的路線條數(shù)越多，度值越大，選擇較大度值的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，這些節(jié)點(diǎn)可能是關(guān)鍵的化合物或者靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)圖中表明，各化學(xué)成分平均與7.56個(gè)靶點(diǎn)相互作用，即半夏瀉心湯中一個(gè)化學(xué)成分與多個(gè)靶點(diǎn)相互作用，同時(shí)也存在多個(gè)成分作用于一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象。以上結(jié)果體現(xiàn)了半夏瀉心湯多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制。

圖2 藥物-疾病-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

利用STRING 11.0初步繪制的半夏瀉心湯靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3中（1）部分，并分析獲得12個(gè)核心作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3中（2）部分，包括TNF、IL-10、IL-1B、IL-6、ALB、ERBB2、EGF、EGFR、ERBB3、PLAU、PTEN、TP53，可能是半夏瀉心湯治療過(guò)程中的核心靶點(diǎn)。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

4 富集分析

GO功能富集分析得到了701個(gè)與CIM疾病密切相關(guān)的條目，包括564個(gè)生物過(guò)程（Biological Process，BP）條目，主要涉及無(wú)配體時(shí)的外源性凋亡信號(hào)通路，基因表達(dá)的正向調(diào)控，細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)，對(duì)缺氧的反應(yīng)等；46個(gè)細(xì)胞組成（Cellular Component，CC）條目，主要涉及細(xì)胞核，胞漿，核質(zhì)，細(xì)胞外空間等；91個(gè)分子功能（Molecular Function，MF）條目，主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合，相同的蛋白質(zhì)結(jié)合，酶結(jié)合，蛋白質(zhì)均二聚活性等。BP、CC和MF所占比例為80.46%、6.56%和12.98%，見(jiàn)圖4。KEGG通路富集分析得到與半夏瀉心湯治療CIM作用機(jī)制相關(guān)的115條信號(hào)通路（P＜0.05），富集程度較高的通路包括結(jié)腸直腸癌，TNF，HIF-1，NOD，VEGF等，見(jiàn)圖5。

圖4 GO分析

圖5 KEGG分析

5 有效成分及核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾跋嚓P(guān)文獻(xiàn)，選取EGFR、TNF、IL6與半夏瀉心湯的主要活性成分山奈酚、槲皮素、黃芩素進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)合能小于-5.0 kcal·mol-1，表明成分與靶點(diǎn)的結(jié)合活性良好[12]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，半夏瀉心湯中的主要活性成分與核心靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，尤其是EGFR與山奈酚、槲皮素、黃芩素具有強(qiáng)結(jié)合力。結(jié)果見(jiàn)表2。利用PyMOL軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果可視化分析，展現(xiàn)其構(gòu)象關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖6。

表2 成分與靶點(diǎn)結(jié)合能

討論

從中醫(yī)基礎(chǔ)理論來(lái)講，CIM的發(fā)生是由于機(jī)體受濕熱、疫毒、寒濕結(jié)于腸腑，氣血壅滯，大腸傳導(dǎo)失司所致，屬寒熱并存、虛實(shí)夾雜證，因此主要以清上溫下、平調(diào)寒熱、扶正祛邪為治則[13]。現(xiàn)代臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便秘、麻痹性腸梗阻、消化道潰瘍、甚至胃腸出血等[14]。半夏瀉心湯味辛、苦、甘，能夠?qū)雇?，和胃氣，散寒滯，清膽泄熱，健脾益氣[15]。臨床廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)潰瘍[16]、慢性胃炎[17]等脾胃消化系統(tǒng)疾病的治療，又因其能調(diào)寒熱、升降，能補(bǔ)能瀉等，臨床應(yīng)用廣泛，療效顯著，是具有重大潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值的經(jīng)典名方[18]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探析半夏瀉心湯治療CIM的潛在作用機(jī)制，研究結(jié)果顯示：半夏瀉心湯中共有275個(gè)活性成分，集中在甘草、人參、黃芩3味中藥，槲皮素、山柰酚、黃芩素為主要的活性成分。槲皮素是廣泛存在的黃酮類(lèi)化學(xué)物，具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用，涉及Mincle/Syk/NFκB、NF-κB/i NOS/NO、Nrf2/HO-1、TGF-β1、PI3k/Akt等多個(gè)信號(hào)通路[19]。山柰酚在抗氧化、抗炎等方面有一定的作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6相關(guān)信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)[20]。黃芩素具有抗炎、抗菌以及抗腫瘤活性等，研究表明黃芩素對(duì)CIM有治療作用，可以降低血清的IL-6和TNF-α含量，顯著調(diào)節(jié)腸道菌群[14]，與本研究驗(yàn)證結(jié)果一致。

基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)體現(xiàn)了半夏瀉心湯多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制。PPI結(jié)果表明IL-6、TNF、EGF、EGFR、IL-10等12個(gè)靶點(diǎn)為半夏瀉心湯治療CIM的關(guān)鍵靶點(diǎn)。炎癥因子IL-6作為C反應(yīng)蛋白上游的炎癥因子參與炎癥和免疫反應(yīng)，在腸黏膜炎的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[21]。TNF具有炎癥介質(zhì)作用，與非特異性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其可能涉及的腸道免疫調(diào)節(jié)、腸黏膜屏障缺陷等多個(gè)病理生理過(guò)程對(duì)臨床評(píng)估CIM具有重要價(jià)值[22]。EGFR的表達(dá)可使損傷腸黏膜細(xì)胞增殖，從而修復(fù)受損組織[23]。

GO富集分析結(jié)果表明，半夏瀉心湯治療CIM的生物過(guò)程主要包括無(wú)配體時(shí)的外源性凋亡信號(hào)通路，基因表達(dá)的正向調(diào)控，細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)，對(duì)缺氧的反應(yīng)等，與炎癥的形成與發(fā)展密切相關(guān)。KEGG通路富集結(jié)果表明，半夏瀉心湯治療CIM的信號(hào)通路主要有結(jié)腸直腸癌，TNF，HIF-1，NOD，VEGF等，集中在炎癥反應(yīng)、腸道疾病等方面。

將核心靶點(diǎn)TNF、EGFR、IL-6與活性成分槲皮素、山奈酚、黃芩素對(duì)接后獲得的結(jié)合能均遠(yuǎn)小于參考值-5.0kcal/mol，表明半夏瀉心湯活性成分能與CIM的核心靶點(diǎn)受體蛋白穩(wěn)定結(jié)合，并發(fā)揮顯著作用，驗(yàn)證結(jié)果表明基于此得到的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果可信度高，具有重要的參考意義。

綜上所述：通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，分析其潛在的核心靶點(diǎn)、生物學(xué)功能和信號(hào)通路，揭示其潛在的分子生物學(xué)機(jī)制。本研究為半夏瀉心湯治療CIM的臨床研究提供了理論依據(jù)和參考。本研究仍存在一定的局限性。僅采用現(xiàn)代生物信息學(xué)方法，通過(guò)使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法來(lái)探討半夏瀉心湯在CIM中的作用。但目前的網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)還有待進(jìn)一步完善，數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和及時(shí)性有待科學(xué)驗(yàn)證。同時(shí)，那些未經(jīng)證實(shí)和未記錄的化合物或靶點(diǎn)可能不包括在我們的分析中。雖然槲皮素、山奈酚、黃芩素在本研究中被確定為半夏瀉心湯治療CIM的三個(gè)最重要的生物活性成分，但它們不能完全代表半夏瀉心湯。因此，需要考慮藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證目前的研究結(jié)果。