夏寧,周澤軍,方申存,王尊喬,潘宴青

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的85%[1]。NSCLC起病隱匿,許多患者確診時(shí)已為晚期。晚期NSCLC的治療包括化療、分子靶向治療及免疫治療等,特別是免疫治療是近年來晚期NSCLC的重要治療進(jìn)展[2-3]。纖維蛋白樣因子1(fibrinogen like protein 1,FGL1) 是纖維蛋白原家族成員,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和代謝的生物學(xué)作用[4]。研究證實(shí),FGL1是淋巴細(xì)胞活化基因3的一種新出現(xiàn)的檢查點(diǎn)配體,以FGL1為靶點(diǎn)的免疫治療是下一代免疫檢查點(diǎn)抑制劑研發(fā)的方向[5]。長鏈非編碼RNA SChLAP1(long non-coding RNA SChLAP1, LncSChLAP1)編碼基因位于2q31.3。研究報(bào)道,LncSChLAP1在前列腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤中表達(dá)升高,介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥性形成[6-7]。為此,本研究通過檢測接受免疫治療的晚期NSCLC患者血清FGL1、LncSChLAP1水平,分析兩者對治療療效及預(yù)后的評估價(jià)值,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月—2022年12月南京市胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科診治晚期NSCLC患者98例為NSCLC組,男62例,女36例,年齡34～81(65.24±7.29)歲,有吸煙史35例;病理類型:肺腺癌60例,肺鱗癌38例;TNM分期:Ⅲb期58例,Ⅳ期40例;腫瘤分化程度:高分化30例,中分化44例,低分化24例;免疫治療線數(shù):一線52例,二線30例,三線及以上16例。選取醫(yī)院同期健康體檢者50例作為健康對照組,男30例,女20例,年齡32～79(64.97±8.06)歲;有吸煙史15例。2組入選者性別、年齡及吸煙史比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),具有可比性。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2023-KL003-01),受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡大于18歲;②經(jīng)病理組織學(xué)確診為晚期NSCLC患者,TNM分期為Ⅲb～Ⅳ期;③美國東部腫瘤協(xié)作組體能狀態(tài)評分介于0～2分;④臨床資料完整;⑤有CT或MR可測量的病灶。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他惡性腫瘤;②不能耐受免疫治療;③合并嚴(yán)重肝腎疾病或自身免疫性疾病;④合并驅(qū)動基因突變者,包括表皮生長因子受體基因、間變性淋巴瘤激酶基因及C-ROS原癌基因1等。

1.3 治療方法 晚期NSCLC患者均接受化療聯(lián)合程序性死亡因子1(programmed death-1,PD-1)單抗治療?；?采用順鉑或卡鉑聯(lián)合白蛋白紫杉醇或培美曲塞二鈉化療。(1)培美曲塞二鈉+鉑類:每個(gè)治療周期第1 d,給予順鉑或卡鉑75 mg/m2,培美曲塞二鈉500 mg/m2,21 d為1個(gè)治療周期;(2)白蛋白紫杉醇+鉑類:每個(gè)治療周期第1 d,給予白蛋白紫杉醇175 mg/m2,順鉑或卡鉑75 mg/m2, 21 d為1個(gè)周期。共化療4個(gè)周期后評估療效。PD-1單抗選用納武單抗3 mg/kg,14 d為1個(gè)周期;派姆單抗2 mg/kg,21 d為1個(gè)周期,至少接受2個(gè)周期PD-1單抗治療。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 血清FGL1、LncSChLAP1檢測:患者于入院后次日清晨、健康對照組體檢日采取空腹肘靜脈血5 ml,室溫靜置1 h后,離心留取上層血清,將血清分為2份,一份采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測血清FGL1水平,另一份采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清LncSChLAP1水平。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)步驟按照人FGL1 ELISA試劑盒說明書(購自上海江萊生物科技公司,貨號JL47875-96T)進(jìn)行,終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀(購自美國伯樂公司,型號imark168130)檢測450 nm處的吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的FGL1濃度值;采用TRIzol 法提取血清總RNA,將血清總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng)購自美國ABI公司),SYBR GREEN MIX試劑購自北京素來寶神五谷科技公司,貨號SR1110。引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成。引物序列:LncSChLAP1上游:3’-CATATAACCCCGTCAACGCAG-5’,下游:3’- GCAGCCGCCACAAACATAC- 5’,GAPDH上游:3’-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG- 5’, 下游:3’-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT- 5’。反應(yīng)體系:cDNA 1 μl,上下游引物各1 μl,SYBR GREEN MIX 10 μl,DEPC水7 μl。反應(yīng)程序:預(yù)變性94℃5 min、94℃ 30 s,60 ℃退火 30 s,70℃延伸10 s,共40個(gè)循環(huán)。以2-△△CT法表示LncSChLAP1的相對表達(dá)量。以NSCLC組患者血清FGL1、LncSChLAP1的平均值48.68 μg/L、2.47為臨界值,分為FGL1高表達(dá)亞組(≥48.68 μg/L,n=48)和低表達(dá)亞組(<48.68 μg/L,n=50),LncSChLAP1高表達(dá)亞組(≥2.47,n=47)和低表達(dá)亞組(<2.47,n=51)。

1.4.2 隨訪:晚期NSCLC患者治療結(jié)束后采用電話和門診結(jié)合的方式定期回訪,每月隨訪1次,連續(xù)隨訪1年。隨訪內(nèi)容包括有無腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,死亡及死亡原因等。隨訪終止時(shí)間為2023年1月。隨訪終點(diǎn)為隨訪時(shí)間結(jié)束或患者發(fā)生腫瘤相關(guān)死亡。

1.5 療效評價(jià) 治療前及治療結(jié)束后行胸CT檢查,參考實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1評估療效[8]:完全緩解(CR):所有靶病灶消失;部分緩解(PR):所有靶病灶直徑的總和與基線相比至少減少30%;疾病進(jìn)展(PD):與基線靶病灶直徑和最小值相比,所有靶病灶直徑的總和至少增加20%或出現(xiàn)新病灶;疾病穩(wěn)定(SD):與靶病灶直徑和最小值相比,既達(dá)不到部分緩解標(biāo)準(zhǔn)、也達(dá)不到疾病進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)。將CR+PR+SD者分為有效亞組(n=74),PD者分為無效亞組(n=24)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)/率(%)表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn);多因素Logistic回歸模型分析影響晚期NSCLC患者免疫治療療效的因素;受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)分析血清FGL1、LncSChLAP1水平對免疫治療療效的評估價(jià)值;Kaplan-Meier曲線(Log-Rank檢驗(yàn))比較不同F(xiàn)GL1、LncSChLAP1水平對晚期NSCLC患者預(yù)后的影響。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清FGL1、LncSChLAP1比較 NSCLC組血清FGL1、LncSChLAP1水平分別為(48.68±6.65)μg/L、(2.47±0.36),高于健康對照組的(9.15±2.01)μg/L、(0.94±0.17),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=57.365、28.443,P均<0.001)。

2.2 2亞組患者臨床資料比較 晚期NSCLC患者免疫治療后,CR者0例,PR者34例,SD者40例,PD者24例。無效亞組TNM分期Ⅳ期比例、血清FGL1、LncSChLAP1水平高于有效亞組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。2亞組患者的性別、年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤分化程度、免疫治療線數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 無效亞組、有效亞組患者在臨床/病理特征中的差異比較

2.3 多因素Logistic回歸分析影響晚期NSCLC患者免疫治療療效的因素 以晚期NSCLC患者的免疫治療療效為因變量(1=無效,0=有效),以血清FGL1(原值錄入)、LncSChLAP1(原值錄入)水平為自變量,以TNM分期(1=Ⅳ期,0=Ⅲb期)為協(xié)變量,多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,血清FGL1、LncSChLAP1升高是影響晚期NSCLC患者免疫治療療效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01),見表2。

表2 影響晚期NSCLC患者免疫治療療效因素的多因素Logistic回歸分析

2.4 血清FGL1、LncSChLAP1及兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測晚期NSCLC患者免疫治療療效的價(jià)值 繪制血清FGL1、LncSChLAP1及兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測晚期NSCLC患者免疫治療療效的ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示:血清FGL1、LncSChLAP1及兩項(xiàng)聯(lián)合的AUC分別為0.856、0.792、0.905,兩者聯(lián)合優(yōu)于各自單獨(dú)預(yù)測效能,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z/P=4.258/0.007、5.119/<0.001),見表3、圖1。

圖1 血清FGL1、LncSChLAP1預(yù)測晚期NSCLC患者免疫治療療效的價(jià)值ROC曲線Fig.1 Serum FGL1, LncSChLAP1 value ROC curves for predicting immunotherapy efficacy in patients with advanced NSCLC

表3 血清FGL1、LncSChLAP1及兩項(xiàng)聯(lián)合對晚期NSCLC患者免疫治療療效的預(yù)測價(jià)值

2.5 血清FGL1、LncSChLAP1對晚期NSCLC患者生存預(yù)后的影響 98例晚期NSCLC患者隨訪中死亡57例,無失訪,1年總體生存率為41.84%(41/98)。FGL1高、低表達(dá)組1年總體生存率分別為22.92%(11/48)、60.00%(30/50)。LncSChLAP1高、低表達(dá)組1年總體生存率分別為27.66%(13/47)、54.90%(28/51)。FGL1高表達(dá)組、LncSChLAP1高表達(dá)組晚期NSCLC患者1年累積生存率分別低于FGL1低表達(dá)組、LncSChLAP1低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2/P=14.180/<0.001、17.553/<0.001),見圖2。

圖2 血清FGL1、LncSChLAP1對晚期NSCLC患者生存預(yù)后的影響Fig.2 Effect of serum FGL1, LncSChLAP1 on survival prognosis of patients with advanced NSCLC

3 討 論

晚期NSCLC的治療方式包括放化療、靶向治療及免疫治療等。酪氨酸激酶抑制劑等分子靶向治療延長了驅(qū)動基因突變的晚期NSCLC患者的生存期,但對于多數(shù)驅(qū)動基因突變陰性或攜帶少見突變的晚期NSCLC患者靶向治療獲益有限[9]。近年來以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫治療為驅(qū)動基因陰性的晚期NSCLC患者帶來了機(jī)遇和挑戰(zhàn)。腫瘤組織中PD-1或PD-L1的表達(dá)可作為免疫治療療效的評估指標(biāo),但受癌細(xì)胞異質(zhì)性、動態(tài)進(jìn)化性及組織取樣等的限制,其并不能準(zhǔn)確預(yù)測免疫治療的療效[10]。因此,尋找能夠預(yù)測免疫治療療效的標(biāo)志物,對于鎖定免疫治療獲益最佳的人群,降低免疫相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生,具有重要臨床意義。

FGL1編碼基因位于人染色體8p22區(qū)域,屬于纖維蛋白原家族成員,在肝臟損傷后分泌增多,參與促進(jìn)肝細(xì)胞有絲分裂再生及新陳代謝等過程。近年來發(fā)現(xiàn),FGL1在腎癌、胃癌等惡性腫瘤中表達(dá)升高[11-12],能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸,導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展。本研究中,晚期NSCLC患者血清FGL1升高,提示FGL1與NSCLC的腫瘤發(fā)生有關(guān)。NSCLC中FGL1的表達(dá)升高與轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常有關(guān)。研究表明,肺腺癌中轉(zhuǎn)錄因子YY1能夠結(jié)合FGL1啟動子區(qū)域,促進(jìn)FGL1的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過度增殖[13]。另外,FGL1還能誘導(dǎo)肺腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤血管生成,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[14]。本研究表明,無效亞組血清FGL1水平較高,提示血清FGL1水平有助于評估免疫治療的療效。分析其原因,PD-1單抗治療的機(jī)制是通過阻斷PD-1/PD-L1通路,恢復(fù)CD8+T淋巴細(xì)胞的正常免疫功能,但CD8+T淋巴細(xì)胞表面尚存在如FGL1、TIGIT等其他共抑制分子的配體。研究表明,對于FGL1表達(dá)升高的晚期NSCLC患者,FGL1能夠結(jié)合CD8+T淋巴細(xì)胞表面的LAG3配體,抑制CD8+T淋巴細(xì)胞的腫瘤殺傷效應(yīng),導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[4]。因此,血清FGL1水平升高的晚期NSCLC患者對以PD-1為靶點(diǎn)的免疫抑制劑治療療效較差,對于指導(dǎo)臨床醫(yī)生治療方案具有重要意義。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),以PD-L1和FGL1為雙靶向免疫治療能夠增加腫瘤微環(huán)境中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤,增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤的免疫功能[15]。本研究中,血清FGL1高表達(dá)的晚期NSCLC患者生存預(yù)后較差,提示血清FGL1是新的評估晚期NSCLC患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。分析原因,一方面是FGL1的表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)肺腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力,腫瘤惡性程度高,疾病進(jìn)展快,導(dǎo)致患者不良預(yù)后。另一方面,FGL1還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成,抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對吉非替尼等靶向藥物治療的耐藥性形成,導(dǎo)致患者不良預(yù)后[16]。

LncSChLAP1是一種長鏈非編碼RNA,參與染色質(zhì)重塑和核小體修飾、mRNA的選擇性剪接及轉(zhuǎn)錄激活等多種生物學(xué)過程[17]。研究表明,前列腺癌中LncSChLAP1通過與果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2相互作用,促進(jìn)組蛋白H2K27甲基化修飾,促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移[18]。本研究中,晚期NSCLC患者血清LncSChLAP1升高,提示LncSChLAP1可能參與NSCLC的腫瘤進(jìn)展。研究表明,SChLAP1能與異質(zhì)性胞核核糖核蛋白L結(jié)合,抑制肌動蛋白α4蛋白的蛋白酶體降解,激活核因子κB,促進(jìn)腫瘤惡性增殖及轉(zhuǎn)移[19]。本研究中,免疫治療無效亞組血清SChLAP1水平較高,提示血清SChLAP1水平有助于評估晚期NSCLC患者免疫治療的療效。分析其機(jī)制,SChLAP1能夠直接與AU堿基富集元件RNA結(jié)合因子1相互作用,拮抗其與PD-L1 mRNA 3’非編碼區(qū)結(jié)合,增加PD-L1 mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá),抑制CD8+T細(xì)胞的腫瘤殺傷功能,導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸,另外,PD-L1的異常表達(dá)升高能夠誘導(dǎo)腫瘤特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡及耗竭,免疫效應(yīng)分子如干擾素γ、腫瘤壞死因子α等分泌水平下降,降低PD-1單抗治療的療效[20-22]。另外,SChLAP1的表達(dá)升高還能夠增加腫瘤基因組的不穩(wěn)定性,增加腫瘤組織的異質(zhì)性,進(jìn)而降低化療及免疫治療的療效[23]。本研究中,血清SChLAP1高表達(dá)的晚期NSCLC患者生存預(yù)后較差,表明SChLAP1是新的評估晚期NSCLC患者預(yù)后的血清標(biāo)志物。筆者分析,SChLAP1高表達(dá)的NSCLC腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移能力強(qiáng),對免疫治療、化療等治療敏感性較差,這些因素均會導(dǎo)致患者不良生存預(yù)后。

本研究中,血清FGL1、LncSChLAP1聯(lián)合判斷晚期NSCLC患者免疫治療療效的敏感度和特異度為0.913、0.750,提示FGL1、LncSChLAP1是新的評估NSCLC患者免疫治療療效的血清標(biāo)志物。臨床醫(yī)生可根據(jù)血清FGL1、LncSChLAP1水平,篩選出對免疫治療敏感的晚期NSCLC患者進(jìn)行治療,減少免疫治療的毒副作用,降低醫(yī)療成本,改善患者臨床預(yù)后。另外,本研究中無效亞組TNM分期Ⅳ期比例較高。筆者分析,較高的TNM分期提示晚期NSCLC患者腫瘤負(fù)荷大、腫瘤異質(zhì)性較高,潛在的驅(qū)動基因比例增加,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤對化療耐藥性形成,導(dǎo)致化療療效降低。

綜上所述, 晚期NSCLC患者血清FGL1、LncSChLAP1升高,是影響晚期NSCLC患者免疫治療療效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,兩者聯(lián)合對晚期NSCLC患者免疫治療療效具有較高的預(yù)測價(jià)值。血清FGL1、LncSChLAP1高表達(dá)晚期NSCLC患者生存預(yù)后較差,有助于晚期NSCLC患者生存預(yù)后的評估。本研究的不足在于未能對不同免疫治療療效的晚期NSCLC患者腫瘤微環(huán)境的差異進(jìn)行基礎(chǔ)研究,以FGL1、LncSChLAP1為靶點(diǎn)的臨床治療能否成為改善免疫治療療效的新的治療方案,值得今后深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

夏寧:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;周澤軍:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文撰寫;方申存:課題設(shè)計(jì),論文修改;王尊喬:實(shí)施研究過程,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),資料搜集整理;潘宴青:提出研究思路,論文審核