摘要：為促進(jìn)大豆蛋白品質(zhì)改良，采用SDSPAGE凝膠電泳對(duì)4份不同大豆品種種子發(fā)育過(guò)程中的蛋白亞基變化規(guī)律進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在種子發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)蛋白含量高的品種中吉601（44.82%）在S4時(shí)期β亞基積累明顯高于其他蛋白含量低的品種；不同大豆品種的11S組分的亞基在各個(gè)時(shí)期的積累明顯不同，11S/7S比值低的兩個(gè)品種中吉601（1.059）和吉林小粒豆（1.022），其11S組分中的Basic亞基在S3-S9時(shí)期的含量低于其他亞基的含量，而11S/7S比值高的兩個(gè)品種黑河23（1.324）和綏農(nóng)28（1.401），其11S組分中的Basic亞基和Acidic亞基在S3-S9時(shí)期含量高于其他亞基的含量，推測(cè)不同品種的11S/7S比值高低與Basic亞基在種子發(fā)育過(guò)程中的積累相關(guān)。

關(guān)鍵詞：大豆; 蛋白; 11S/7S; 蛋白亞基; SDSPAGE

收稿日期：20240111

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃中國(guó)和烏拉圭聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室合作項(xiàng)目（2018YFE0116900）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃戰(zhàn)略性科技創(chuàng)新合作專項(xiàng)（2022YFE0203300）。

第一作者：閆曉娟（1997-），女，碩士研究生，從事大豆遺傳育種研究。Email：320804483@qq.com。

通信作者：張福順（1965-），男，碩士，副研究員，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督與營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)研究。Email：bill6141@163.com。大豆起源于我國(guó)，已有5 000年以上的栽培歷史，且大豆蛋白的氨基酸構(gòu)成較為合理，是我國(guó)重要的食用油和植物蛋白來(lái)源[12]。目前，國(guó)產(chǎn)大豆主要是食用，進(jìn)口大豆主要用于榨油和飼料，亟需通過(guò)提高產(chǎn)量與品質(zhì)以增強(qiáng)國(guó)產(chǎn)大豆的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[3]。如今，我國(guó)食品加工業(yè)對(duì)大豆蛋白的營(yíng)養(yǎng)性要求越來(lái)越高，大豆貯藏蛋白引起生產(chǎn)者和研究者越來(lái)越多的關(guān)注。

根據(jù)蛋白離心沉降系數(shù)一般將貯藏蛋白分為2S、7S、11S和15S等不同類型的球蛋白，其中7S和11S約占大豆球蛋白總量的70%左右，是大豆種子貯藏蛋白的主要成分[4]。7S組分由α亞基、β亞基、α′亞基組成，11S亞基由A3亞基、Acidic亞基、Basic亞基組成。由于氨基酸組成和結(jié)構(gòu)不同，大豆貯藏蛋白11S和7S球蛋白的相對(duì)含量不僅影響蛋白的營(yíng)養(yǎng)特性也會(huì)影響其加工特性[57]。7S球蛋白中賴氨酸含量較高，而11S球蛋白中蛋氨酸等含硫氨基酸含量較高，是7S球蛋白中的5～6倍[811]。相對(duì)于7S球蛋白，11S球蛋白中含有豐富的巰基和二硫鍵，而疏水性氨基酸較少，導(dǎo)致11S球蛋白含量高的蛋白所形成凝膠的拉伸強(qiáng)度、剪切力和保水性較好[1214]。因此，11S/7S的比值不僅與大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有很大關(guān)系而且決定了大豆的加工品質(zhì)。

鑒于11S和7S球蛋白在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和加工品質(zhì)等方面的重要價(jià)值，前人對(duì)蛋白亞基進(jìn)行了鑒定和相關(guān)優(yōu)異種質(zhì)篩選。趙現(xiàn)偉等[15]篩選鑒定出3個(gè)11S/7S比值大于4.0和4個(gè)7S亞基含量較低的優(yōu)異大豆種質(zhì)資源。張明俊等[16]從298份EMS誘變株系和610份大豆品種中，篩選出亞基明顯變異材料6份，11S/7S值大于3.0的材料10份。目前研究多針對(duì)成熟種子以及大豆胚軸中亞基積累的研究，Sugimoto等[17]發(fā)現(xiàn)，大豆下胚軸富含7S，而11S蛋白含量較低。Ladin等[18]發(fā)現(xiàn)7S組分中的β亞基是在大豆胚軸中合成的，但會(huì)迅速降解。

為了揭示蛋白亞基積累規(guī)律，本研究以4個(gè)東北地區(qū)大豆品種為材料，采用SDSPAGE電泳檢測(cè)方法，分析了種子發(fā)育過(guò)程中各亞基含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，比較了不同大豆品種間7S組分與11S組分的亞基在不同發(fā)育時(shí)間的積累異同，為大豆蛋白品質(zhì)改良提供了重要理論參考。

黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)4期4期閆曉娟等：大豆種子蛋白亞基及11S/7S隨種子發(fā)育的變化規(guī)律1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試大豆本研究選用中吉601、黑河23、吉林小粒豆、綏農(nóng)28為試驗(yàn)材料，種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.1.2主要儀器本研究所用儀器主要包括高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、高壓電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、層析柜（北京德天佑科技發(fā)展公司）、電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）和凝膠透射燈（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)2018年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所溫室外進(jìn)行盆栽，采用上口直徑32 cm， 下口直徑21 cm， 高28 cm，便于排水透氣的圓型塑料盆缽。每個(gè)品種每盆播種8粒種子， 3次重復(fù)，盆缽按重復(fù)隨機(jī)排列，后期出苗間苗每盆留4株，掛牌，正常管理水、肥，成熟后每盆單獨(dú)收獲，種子保存于風(fēng)干室。

1.2.2S3-S9時(shí)期種子的大豆球蛋白制備及SDSPAGE電泳不同取樣時(shí)期的大豆籽粒狀態(tài)如圖 1所示，大豆種子在S1-S6時(shí)期淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等貯藏物質(zhì)逐漸積累，種子體積不斷增大；在S7-S9時(shí)期種子的含水量逐漸降低，種子體積開(kāi)始不斷縮小；S1-S9時(shí)期種子顏色由綠色轉(zhuǎn)為黃色。4個(gè)品種的大豆試驗(yàn)材料按表 1標(biāo)準(zhǔn)取樣，每個(gè)時(shí)期取3次重復(fù)。采用王顯生等[19]的方法提取種子的大豆球蛋白，將S3-S9時(shí)期種子用液氮研磨（防止水化和降解），分別稱取5 mg的豆粉并及時(shí)加入500 μL蛋白提取液。采用Laemmli[20]的方法，抽取5 μL蛋白提取液進(jìn)行SDSPAGE電泳（濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%），通過(guò)高清相機(jī)采集膠片圖像。用Quantity one軟件對(duì)膠片進(jìn)行分析，獲取各亞基條帶含量，計(jì)算11S/7S等數(shù)據(jù)。

1.2.3成熟種子的大豆球蛋白制備及SDSPAGE凝膠電泳將盆栽收獲的成熟大豆種子各取5粒，每個(gè)品種取3次重復(fù)。采用陳振家等[21]的方法制備脫脂豆粉，去除種皮后研磨取足量豆粉，加乙醚脫脂過(guò)夜制備脫脂豆粉。稱取5 mg脫脂豆粉于2 mL離心管中，加500 μL（蛋白提取液50 mL+1 mL β巰基乙醇混合液），混勻，靜置于4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。抽取5 μL蛋白提取液采用高壓電泳儀進(jìn)行SDSPAGE電泳，獲得大豆貯藏蛋白的各亞基條帶。用Quantity one軟件測(cè)定各亞基含量，并進(jìn)行11S/7S等數(shù)據(jù)分析。

1.2.4成熟種子蛋白、脂肪含量測(cè)定用MPA近紅外光譜分析儀測(cè)定大豆籽粒的蛋白、脂肪含量。每次測(cè)量，均先測(cè)定中品661的蛋白含量，以此確定儀器狀況是否良好。每份材料，測(cè)3次重復(fù)，取平均值。

1.2.5數(shù)據(jù)分析利用R（v.3.2.3）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1成熟種子品質(zhì)分析

2.1.1蛋白質(zhì)和脂肪含量由表 2可知，中吉601蛋白含量最高，為44.82%，脂肪含量最低，為18.99%。黑河23的蛋白含量最低，為36.98%，同時(shí)脂肪含量最高，為21.61%。

2.1.2貯藏蛋白亞基含量由圖2可知，4個(gè)品種大豆的貯藏蛋白各亞基條帶清晰且組份一致。

由表3可知，通過(guò)Quantity one軟件掃描每個(gè)SDSPAGE泳道，對(duì)4個(gè)品種的成熟種子亞基含量進(jìn)行分析，計(jì)算11S/7S比值。結(jié)果顯示中吉601的比值為1.059，吉林小粒豆的比值為1.022，黑河23和綏農(nóng)28的11S/7S比值較高，分別為1.324和1.401。

A.中吉601； B.黑河23； C.吉林小粒豆； D.綏農(nóng)28。

2.2不同亞基隨種子發(fā)育積累變化規(guī)律

由圖3可知，從整體來(lái)看，各亞基在種子發(fā)育過(guò)程中均呈逐漸積累趨勢(shì)，但是品種間又存在明顯差異。中吉601、黑河23、綏農(nóng)28的Lox亞基含量在S3-S9時(shí)期的積累呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而吉林小粒豆的Lox含量在S3-S9時(shí)期的變化并不明顯，其中在種子發(fā)育后期（S7-S9）黑河23的Lox含量上升趨勢(shì)最為明顯（圖3A）。

中吉601、黑河23和綏農(nóng)28，三個(gè)品種的α′亞基在S3-S9時(shí)期的積累整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。吉林小粒豆始終高于這3個(gè)品種，在S4期最高，為340.714（圖3B）。

綏農(nóng)28的α亞基含量在S7時(shí)期出現(xiàn)峰值，且除了在S6期與其他3個(gè)品種α亞基含量差異不明顯外，其他時(shí)期均較其他3個(gè)品種高（圖3C）。

生育前期（S3-S5），中吉601的β亞基含量在S4時(shí)期出現(xiàn)峰值，而其他3個(gè)品種的β亞基含量在S4時(shí)期降低，后期（S6-S9），黑河23的β亞基相較于其他品種大量積累，且中吉601的β亞基含量始終最低（圖3D）。

中吉601、黑河23、吉林小粒豆的A3亞基在S3時(shí)期已有積累，而綏農(nóng)28 的A3亞基在S3-S4時(shí)期才開(kāi)始積累，雖然綏農(nóng)28 的A3亞基開(kāi)始積累的時(shí)間較晚，但是相較于其他3個(gè)品種在S5-S9時(shí)期的積累水平較高。黑河23的A3亞基含量除了S3期外的各時(shí)期均最低（圖3E）。

綏農(nóng)28的Acidic亞基含量在S5期出現(xiàn)第1個(gè)峰值，在S6-S9時(shí)期Acidic亞基含量都保持在一個(gè)較高水平且仍有上升趨勢(shì)（圖3F）。

黑河23的Basic亞基含量在S3-S5時(shí)期上升明顯，且在S3-S9時(shí)期黑河23和綏農(nóng)28的Basic亞基含量明顯高于中吉601和吉林小粒豆。綏農(nóng)28在各時(shí)期Basic亞基含量呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)（圖3G）。

2.311S、7S以及11S/7S的比值隨大豆種子發(fā)育積累變化2.3.111S、7S組分亞基隨種子發(fā)育積累變化由圖4A可知，中吉601的7S亞基（α亞基、β亞基、α′亞基）在種子發(fā)育S3-S9時(shí)期逐步積累；而11S組分的亞基（Acidic亞基、A3亞基和Basic亞基）在S3-S9時(shí)期相比于7S組分的亞基，上升趨勢(shì)更為明顯，但是Basic亞基的積累在種子發(fā)育S3-S9時(shí)期過(guò)程中相較于11S組分的其他亞基是最低的。

由圖4B可知，黑河23的7S組分的α亞基、α′亞基的含量在S3-S9時(shí)期呈緩慢上升趨勢(shì)，但β亞基的積累在種子發(fā)育S3-S9時(shí)期上升幅度比α亞基、α′亞基更大，并在S8-S9時(shí)期達(dá)到最大值。11S組分的Acidic亞基、Basic亞基整體上升趨勢(shì)與A3亞基相比均較為明顯，在S8時(shí)期達(dá)到最大值，A3亞基在種子發(fā)育S3-S9時(shí)期呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，是11S組分中含量最低的亞基。11S組分的Basic亞基在S3時(shí)期還未開(kāi)始積累，而7S組分的亞基在S3時(shí)期已有積累。

由圖4C可知，吉林小粒豆在種子發(fā)育S3-S9時(shí)期的亞基中除Basic亞基含量最低，且積累不明顯外，7S組分（α亞基、β亞基、α′亞基），以及11S組分的Acidic亞基和A3亞基的積累均有明顯上升的趨勢(shì)。

由圖4D可知，綏農(nóng)28的7S組分的α亞基、β亞基、α′亞基，以及11S組分的A3亞基和Basic亞基在種子發(fā)育S3-S9時(shí)期積累趨勢(shì)緩慢， A3亞基在S3時(shí)期還未開(kāi)始積累，而7S組分的亞基在S3時(shí)期已有積累， Acidic亞基在S4-S9時(shí)期的積累趨勢(shì)與其他亞基相比上升更為明顯，在S9時(shí)期出現(xiàn)峰值。

A.中吉601；B.黑河23；C.吉林小粒豆；D.綏農(nóng)28。

4個(gè)品種7S組分的亞基在不同時(shí)期的變化趨勢(shì)相同。但是，11S組分亞基在各個(gè)時(shí)期明顯不同，中吉601、吉林小粒豆的Basic亞基在S3-S9時(shí)期含量相對(duì)其他亞基較低，而黑河23、綏農(nóng)28中11S組分的Basic亞基和Acidic亞基在S3-S9時(shí)期含量相對(duì)其他亞基較高。

2.3.211S/7S比值隨種子發(fā)育積累變化由圖5可知，各個(gè)品種在S3-S9時(shí)期的11S/7S曲線變化不同。中吉601、綏農(nóng)28的變化呈現(xiàn)升降升降的趨勢(shì)，中吉601的11S/7S比值在S8時(shí)期達(dá)到最大值，為1.71，綏農(nóng)28的11S/7S比值在S5時(shí)期達(dá)到最大值，為2.19。黑河23的變化呈現(xiàn)升降的趨勢(shì)， 11S/7S比值在S4時(shí)期達(dá)到最大值，為1.43。吉林小粒豆的變化呈現(xiàn)升降升的趨勢(shì)， 11S/7S比值在S5時(shí)期達(dá)到最大值，為1.16。蛋白含量較高的中吉601和吉林小粒豆在S9時(shí)期（即成熟種子中）11S/7S比值偏低。

3討論

張恒善等[22]研究表明多數(shù)大豆品種的蛋白相對(duì)含量呈“前急、后緩”的下降曲線，少數(shù)品種下降后又稍有回升；同熟期品種，發(fā)育初期蛋白質(zhì)含量較高的品種種子成熟時(shí)也比較高。林忠平等[23]利用免疫熒光標(biāo)記法研究大豆發(fā)現(xiàn)7S蛋白在子葉的沉積始于開(kāi)花后15 d，11S蛋白的積累是開(kāi)花后20～30 d。鄭易之等[24]也得出同樣的結(jié)論，7S球蛋白積累時(shí)間略早于11S球蛋白。本研究通過(guò)SDSPAGE電泳試驗(yàn)分析大豆種子不同發(fā)育時(shí)期的7S組分與11S組分的亞基發(fā)現(xiàn)，黑河23與綏農(nóng)28 中11S組分的Basic亞基、A3亞基相較于7S組分的其他亞基合成較晚，說(shuō)明11S球蛋白的積累略晚于7S球蛋白的積累時(shí)間，與前人的研究結(jié)果相同。Meinke等[25]通過(guò)SDSPAGE電泳發(fā)現(xiàn)，11S球蛋白Acidic亞基、Basic亞基以及7S球蛋白的α亞基在授粉后18～20 d，即子葉細(xì)胞分裂終止后不久開(kāi)始積累，而7S 球蛋白的β亞基和11S組分的 A3亞基則在發(fā)育成熟期7～14 d后才開(kāi)始積累。但是本研究通過(guò)SDSPAGE電泳試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑河23與綏農(nóng)28 中11S組分的Basic亞基、A3亞基相較于7S組分的其他亞基合成較晚，不同品種11S組分的Acidic亞基以及7S組分的α亞基，合成時(shí)間沒(méi)有明顯的差別，可能是取樣方式造成的差異。許守民等[26]用兩個(gè)蛋白含量不同的品種觀察7S與11S的差異發(fā)現(xiàn)，在子葉發(fā)育過(guò)程中，蛋白含量高的品種“公交80593”與蛋白含量低的品種“GD1515”相比，蛋白質(zhì)及7S 和11S 亞基積累的時(shí)期較早，尤其7S的β亞基。而本研究發(fā)現(xiàn)蛋白含量高的品種中吉601與其他3個(gè)蛋白含量低的品種相比，7S組分的β亞基在S3-S5時(shí)期明顯高于3個(gè)蛋白含量低的品種，蛋白含量的高低是否與β亞基在前期的積累有關(guān)，還有待研究。本研究結(jié)果與前人有所不同，以未區(qū)分大豆子葉和胚軸對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的大豆籽粒進(jìn)行研究，并以大豆籽粒發(fā)育過(guò)程的籽粒重為標(biāo)準(zhǔn)分別取9個(gè)時(shí)期（S1-S9）籽粒進(jìn)行研究。本研究中蛋白含量較高的中吉601和吉林小粒豆S9時(shí)期11S/7S比值偏低，其可能原因是7S球蛋白的積累提升了蛋白含量同時(shí)降低了11S/7S比值。前人研究表明11S球蛋白含量與7S球蛋白含量呈負(fù)相關(guān)，調(diào)節(jié)11S/7S的比值，可提高大豆的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與加工品質(zhì)[2728]。因此需要通過(guò)擴(kuò)大資源鑒定規(guī)模挖掘高蛋白且11S/7S比值高的優(yōu)異種質(zhì)，同時(shí)挖掘與高蛋白且11S/7S比值高有關(guān)的優(yōu)異基因，為改良大豆育種提供理論支撐。

4結(jié)論

通過(guò)SDSPAGE電泳試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)品種的同一亞基在種子發(fā)育S3-S9時(shí)期，積累速率各有不同，蛋白含量高的品種中吉601（44.826%）與其他蛋白含量低的品種的β亞基積累在S3-S5時(shí)期明顯高于其他品種；4個(gè)品種的7S組分亞基在S3-S9時(shí)期積累沒(méi)有明顯差異，而11S組分的亞基在S3-S9時(shí)期明顯不同，11S/7S比值低的品種中吉601（1.059）與吉林小粒豆（1.022），11S組分的Basic亞基在S3-S9時(shí)期含量相比其他亞基是最低的，而11S/7S比值高的品種黑河23（1.324）與綏農(nóng)28（1.401），11S組分中Basic亞基和Acidic亞基在S3-S9時(shí)期含量相比其他亞基含量較高，這表明不同品種11S/7S的比值高低與Basic亞基在種子發(fā)育過(guò)程中的積累相關(guān)。本研究揭示了11S和7S在不同品種間積累速率存在明顯差異，7S組分的亞基在不同品種不同時(shí)期的變化趨勢(shì)基本相同，11S組分的亞基在各個(gè)時(shí)期明顯不同，中吉601、吉林小粒豆的Basic亞基在S3-S9時(shí)期含量相對(duì)其他亞基是最低的，而黑河23、綏農(nóng)28中11S組分的Basic亞基和Acidic亞基在S3-S9時(shí)期含量相比其他亞基含量較高，為通過(guò)雜交創(chuàng)制高11S/7S優(yōu)異種質(zhì)提供了重要線索。

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