馬克鶴，鄭 凱，陳全家

（新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830000）

傳統(tǒng)的作物生產(chǎn)中，使用除草劑進行田間雜草處理已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)不可缺少的一部分，除草劑雖能防除雜草，但也會對作物生長產(chǎn)生影響[1]。隨著轉基因抗蟲棉培育成功，通過轉基因技術將抗病、抗除草劑、品質優(yōu)異的相關基因導入到棉花中的研究越來越多[2-3]，并大規(guī)模投入生產(chǎn)。

農(nóng)桿菌介導法是目前應用最廣泛的遺傳轉化方法，能夠將完整的基因片段導入到受體中，且在后代中穩(wěn)定遺傳[4]。本試驗前期通過將抗性標記基因、目的基因與表達載體重組構建，將重組載體轉化至農(nóng)桿菌中，經(jīng)過擴大培養(yǎng)后，將菌液通過授粉的方式把外源基因導入至受體中，已有研究人員通過該方法經(jīng)除草劑篩選以及PCR 分子鑒定獲得了轉基因植株[5-6]，但所用的除草劑為草甘膦，而草銨膦除草劑見效快，在除草速度、除草范圍、除草效果及雜草再生期等田間表現(xiàn)方面均優(yōu)于草甘膦。Bar基因可使植物抵抗以PPT 為活性的草銨膦除草劑，此類除草劑能夠使植株葉綠體解體，導致葉片干枯，最終死亡。HCT 是一種木質素合成酶，在木質素單體的合成中起著上下游調(diào)節(jié)作用。調(diào)控HCT基因的表達量進而調(diào)節(jié)植物中木質素含量，由此可以證實HCT 可促進纖維發(fā)育。本試驗將目的基因與抗除草劑基因一同導入到棉花受體的轉基因后代通過草銨膦除草劑篩選及PCR 鑒定，能夠快速篩選出目的基因成功整合的單株，研究轉基因材料的遺傳穩(wěn)定性，分析GbHCT基因的導入對棉花的農(nóng)藝性狀產(chǎn)生的表型影響，初步探討GbHCT基因在棉花發(fā)育中的作用，為后續(xù)該轉基因材料的環(huán)境安全釋放、篩選更為優(yōu)異的品種提供了可靠的分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉基因材料是前期采用農(nóng)桿菌介導噴花法將目的基因GbHCT13、GbHCT15導入到陸地棉Y1169，轉GbHCT13、GbHCT15基因棉花表達載體均由本課題組實驗室構建，本試驗所用的受體品種為Y1169，其目的基因GbHCT來自海島棉新海21。本研究所用引物（見表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；PCR 反應試劑Taq DNA 聚合酶為MBI Fermentas公司產(chǎn)品；DNA Marker、dNTP Mix 為天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

本試驗前期利用BglⅡ與BstE Ⅱ對pCAMBIA3301載體雙酶切，然后將帶有pCAMBIA3301-GbHCT13/GbHCT15重組載體的農(nóng)桿菌菌液通過農(nóng)桿菌介導噴花法轉化到棉花中，其中載體所含標記基因bar基因（草銨膦除草劑抗性基因）長為475 bp，GbHCT13基因長為1 311 bp，GbHCT15基因長為1 248 bp。

1.2 試驗時間

大田試驗于2021 年在新疆維吾爾自治區(qū)塔城地區(qū)沙灣市新疆農(nóng)業(yè)大學棉花育種基地進行；室內(nèi)試驗于2022 年在新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院實驗室進行。

1.3 試驗方法

1.3.1 除草劑篩選

大田試驗將草銨膦原液Basta 600、700、800μL，與表面活性黏附劑吐溫20 1 600μL 和純凈水1 L 配制成3 個體積分數(shù)，分別對大田轉基因棉花進行噴灑，3～9 d 后觀察變色葉片及死亡植株，標記未變色植株，依據(jù)變色程度將葉片反應分為3 種類型（見圖1），收集大田中轉基因抗性植株并經(jīng)PCR 鑒定為陽性的植株種子，記錄編號，確定單株株系，在室內(nèi)按株系種植。室內(nèi)試驗同樣按照大田適用體積分數(shù)將除草劑涂抹于幼苗植株的葉片上，連續(xù)3 d 相同葉片，3 d后統(tǒng)計棉花葉片枯萎情況（見圖2），拔除葉片干枯的植株。

圖1 不同體積分數(shù)草銨膦除草劑噴灑3 d 后棉花葉片的反應

圖2 室內(nèi)涂抹體積分數(shù)為800μL/L 的草銨膦除草劑

1.3.2 PCR鑒定

1)取新鮮的棉花嫩葉，參照改良的DNA 提取技術提取轉基因棉花的基因組，所提取的DNA 取1μL 放置核酸濃度檢測儀上進行檢測。

2)取適量DNA 樣品稀釋，稀釋至200 ng/μL，PCR反應體系25μL，取上下游引物各1μL、ddH2O 10μL、DNA 樣品1μL、Mix 混合液（含Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×Reaction buffer）12.5μL。

3)按照PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，經(jīng)過35 個循環(huán)后72 ℃終延伸10 min，將所獲得的PCR 產(chǎn)物于4 ℃保存；隨后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，照膠顯影，觀察目的條帶。

1.3.3 轉基因棉花農(nóng)藝性狀分析

對PCR 檢測為陽性的T2代轉基因棉花進行農(nóng)藝性狀調(diào)查，在棉花吐絮時期，每個轉基因品系隨機測取5 株的株高、果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)和有效鈴數(shù)等農(nóng)藝性狀，用SPSS 軟件對所測得的農(nóng)藝性狀進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 除草劑篩選轉基因品系棉花

通過圖1 可以看出，由于除草劑產(chǎn)生藥害需3 d左右，當除草劑體積分數(shù)為600μL/L 時，3 d 后未轉基因棉花葉片無明顯變化，6 d 后植株葉片出現(xiàn)淺黃色斑點，9 d 后葉片干枯；當除草劑體積分數(shù)為700μL/L時，未轉基因棉花葉片3 d 后有淺黃色斑點，6 d 后葉片干枯；當除草劑體積分數(shù)為800μL/L 時，3 d 后未轉基因棉花葉片明顯黃化，且莖尖生長點干枯，第6 天時整株棉花死亡。轉基因植株葉片經(jīng)3 個體積分數(shù)除草劑噴灑后葉片均無變化。為能夠高效快速進行篩選，選擇體積分數(shù)為800 μL/L 的除草劑作為篩選體積分數(shù)，噴灑后第3 天進行觀察。

由圖2 可以明顯看出，在幼苗期對每株植株的同一葉片涂抹大田適用的草銨膦除草劑，編號為1 的植株涂抹除草劑后葉片未有任何反應，初步鑒定為陽性，而編號為2、3、4 的植株涂抹除草劑后出現(xiàn)了變化，未轉基因植株葉片不僅明顯黃化且生長受到抑制。

2.2 轉基因棉花農(nóng)藝性狀分析

對農(nóng)藝性狀進行分析（見表2），得出轉GbHCT13品系的株高與對照Y1169 相比顯著增加，而轉GbHCT15品系的株高與對照Y1169 相比略有增加；轉GbHCT15品系的果枝數(shù)與對照Y1169 相比顯著增加，在有效果枝數(shù)方面，轉GbHCT15品系相比對照Y1169也顯著增加，而轉GbHCT13品系在果枝數(shù)與有效果枝數(shù)方面比對照組略有升高；鈴數(shù)方面，轉GbHCT15品系的掛鈴數(shù)更多，與對照差異達到極顯著水平；轉GbHCT13品系和轉GbHCT15品系的有效鈴數(shù)與對照相比顯著增加。由以上結果得出，目的基因導入到受體后，其各性狀都發(fā)生了顯著變化，各項農(nóng)藝性狀均有提高。綜上，轉GbHCT15品系和其他轉基因材料在與對照相比時，在果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)和有效鈴數(shù)方面差異顯著。

表2 轉基因品系農(nóng)藝性狀與對照之間的比較

3 討論與結論

在2 片真葉期噴灑大田體積分數(shù)適宜的除草劑，非抗性材料真葉受傷無法進行光合作用，生長點受到抑制最終芽尖枯死，而轉基因抗除草劑材料葉雖會表現(xiàn)出水浸狀，但子葉與生長點未受影響。在幼苗期利用適宜體積分數(shù)的除草劑既可去除田間雜草，也不影響棉花正常生長，還能在田間大規(guī)模篩選出轉基因抗性植株。此篩選方法雖然簡單，但容易出現(xiàn)假陽性及誤篩，可作為轉基因植株的初步篩選，獲得更為準確的結果還需進行分子水平的鑒定。

根據(jù)草銨膦除草劑抗性基因bar同時也可作為標記基因對兩代轉基因抗性植株進行PCR 鑒定，試驗結果表明，T3代轉基因抗性植株有部分存在目的基因的缺失，研究表明，推測在子代遺傳的減數(shù)分裂過程中，外源Bar基因與目的基因插入早期沒有在染色體中穩(wěn)定，從而呈現(xiàn)不規(guī)律分離，但隨著代數(shù)的增加，轉化的目的基因大多能夠穩(wěn)定遺傳給子代。因此，如何穩(wěn)定地將外源基因遺傳給下一代，仍是當前轉基因技術的難題之一。本次試驗中，T2代陽性植株的農(nóng)藝性狀表明，外源基因的插入使農(nóng)藝性狀發(fā)生了明顯改變，其中轉GbHCT15品系的棉花在果枝數(shù)、鈴數(shù)等方面與對照相比顯著增加，以往研究中，HCT基因在莖稈的纖維發(fā)育中具有重要作用，能夠促進纖維細胞的生長與分化。因此本試驗推測HCT基因的導入促使棉花植株生長發(fā)育，使轉基因品系株高均高于對照組，同時2 個轉基因品系的結鈴數(shù)均明顯高于對照組，HCT基因的導入具有提高棉花產(chǎn)量的潛力。