湯嘉慧 王新東 董其美
1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院心血管內(nèi)科,江蘇 南京 210028;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心血管內(nèi)科,江蘇 南京 210028
流行病學(xué)表明射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)已成為全球心力衰竭(heart failure,HF)的主流[1],它是指左室射血分?jǐn)?shù)≥50%,以左室等容舒張延長(zhǎng)、左室舒張末壓增加和左室充盈緩慢為特征的HF[2]。目前尚無(wú)確切治療顯示可以降低HFpEF 患者發(fā)病率或病死率,因此降低HFpEF 患者的發(fā)病率或病死率成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。
中醫(yī)古籍中并未記載“射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭”這一病名,參考其臨床表現(xiàn)可歸類于中醫(yī)“心力衰竭病”的范疇。HF 是以氣喘、心悸、水腫等為主癥的一種病證,是許多心系疾病的最終歸宿[3]。中醫(yī)藥因其顯著優(yōu)勢(shì)獲得社會(huì)認(rèn)可,被廣泛應(yīng)用于治療HF。
平陽(yáng)益心飲由白茅根、丹參、枸杞子、紅景天、焦梔子、鹿銜草、路路通、桑葉、絲瓜絡(luò)9 味中藥組成,是南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院治療HFpEF 的經(jīng)驗(yàn)方,已在臨床應(yīng)用多年,但其具體分子機(jī)制尚未明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 的藥效靶點(diǎn)和信號(hào)通路,系統(tǒng)闡述平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 的科學(xué)內(nèi)涵。
通過(guò)HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://herb.ac.cn/)獲得平陽(yáng)益心飲化學(xué)成分和化合物結(jié)構(gòu),將化合物結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss ADME平臺(tái)(http:/www.swissadme.ch/)。設(shè)置納入標(biāo)準(zhǔn):①腸胃吸收(gatrointestinal absortion;GIabsortion)為“ High”;②5 類藥性(Egan、Lipinski、Ghose、Muegge、Veber)中≥2 個(gè)為“ Yes”,將鑒定出的化學(xué)成分分子結(jié)構(gòu)圖上傳至SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/www.swisstargetprediction.ch/),按Probability>0 篩選靶點(diǎn),獲取相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。
在PhamGKB(https://www.pharmgkb.org/)、OMIM(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索“ HFpEF”的相關(guān)靶點(diǎn),去除重復(fù)值,得到HFpEF 的疾病靶點(diǎn)。
運(yùn)用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取藥物和疾病的交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。
以平陽(yáng)益心飲內(nèi)含有的藥物名稱、有效成分及疾病靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn),構(gòu)建“成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。
在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)輸入平陽(yáng)益心飲和HFpEF 的交集靶點(diǎn),構(gòu)建PPI 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用CytoHubba 插件篩查核心靶點(diǎn),篩查條件包括Degree 值、Closeness 值、Network 值、Betweenness 值、Eigenvector 值和LAC 值。
在Metascape 平臺(tái)導(dǎo)入交集靶點(diǎn),分別進(jìn)行京都基因組百科全書通路富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因本體功能富集分析(gene ontology,GO)分析,應(yīng)用微生信平臺(tái)(http://www.Bioinformatics.com.cn)繪制通路富集分析圖和生物功能分析圖。
運(yùn)用HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)平陽(yáng)益心飲相關(guān)的活性成分的作用靶點(diǎn),去重后得到566 個(gè)活性成分和1309 個(gè)靶點(diǎn)。
從OMIM、PhamGKB 及GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取HFpEF 靶點(diǎn),去重后獲得3199 個(gè)HFpEF 靶點(diǎn)。
將上述獲取的成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0中,共得到交集靶點(diǎn)524 個(gè),韋恩圖見圖1。
圖1 平陽(yáng)益心飲藥物-HFpEF 疾病靶點(diǎn)交集韋恩圖
使用Cytoscape 3.9.0 軟件將524 個(gè)候選治療靶點(diǎn)進(jìn)行“成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可視化(圖2)。
圖2 成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖
利用STRING 對(duì)2.3 項(xiàng)中得到的524 個(gè)候選治療靶點(diǎn)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),篩選后得到524 個(gè)節(jié)點(diǎn)和10 371 條邊的互作網(wǎng)絡(luò)(圖3)。
圖3 候選治療靶點(diǎn)的PPI 圖
對(duì)交集靶點(diǎn)做核心靶點(diǎn)篩查:將524 個(gè)蛋白輸入Cytoscape 3.9.0 軟件中,利用CytoHubba 插件進(jìn)行篩選。首先以Betweenness>21.28、Closeness>0.03、Degree>6.56、Eigenvector>833.26、LAC>0.04、Network>9.36,進(jìn)行第一次篩選,由524 個(gè)蛋白篩選至54個(gè),接下來(lái)再以Betweenness>75.85、Closeness>0.11、Degree>18.54、Eigenvector>3543.57、LAC>0.18、Network>34.89 進(jìn)行第2 次篩選,由54 個(gè)蛋白篩選得到12 個(gè),推測(cè)這12 個(gè)蛋白為平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 的核心治療靶點(diǎn),依次為STAT3、SRC、AKT1、MAPK1、MAPK3、HRAS、GRB2、RELA、JUN、FYN、ESR1、EGFR。
借助Metascapes 平臺(tái)進(jìn)行GO 分析及KEGG通路分析。GO 分析中篩選出生物過(guò)程(biological processes,BP)、分子功能(molecular functions,MF)和細(xì)胞成分(cellular components,CC)的前10 位進(jìn)行制圖(圖4)。結(jié)果提示,平陽(yáng)益心飲可能參與細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、系統(tǒng)進(jìn)程調(diào)節(jié)、循環(huán)系統(tǒng)過(guò)程、磷酸化的正調(diào)控等過(guò)程;在膜筏、突觸后、細(xì)胞體、受體復(fù)合物等細(xì)胞組分中起作用;激活了蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、激酶結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等分子功能。KEGG 共富集到235 條通路,前20 條通路用氣泡圖展示(圖5),包括癌癥相關(guān)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等。
圖5 KEGG 通路富集分析氣泡圖
平陽(yáng)益心飲具有平肝潛陽(yáng)、利水消腫的作用,能顯著改善HFpEF 的癥狀。通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析,驗(yàn)證了AKT1、SRC、STAT3 等靶點(diǎn)是平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 的核心靶點(diǎn)。AKT1 的激活證實(shí)其可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,從而強(qiáng)化心臟修復(fù)[4-5]。AKT1 蛋白的缺失可能導(dǎo)致早期收縮功能障礙,進(jìn)而形成HF[6]。SRC 是一種在細(xì)胞黏附、細(xì)胞更迭和細(xì)胞遷移等過(guò)程中發(fā)揮作用的非受體酪氨酸激酶,研究表明,SRC 激酶在糾正心臟肥大及重塑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。SRC 磷酸化能改善細(xì)胞間通訊,降低心律失常誘導(dǎo)性,改善HF 癥狀[8]。STAT3 是一種轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和活性因子,研究發(fā)現(xiàn)STAT3 及其相關(guān)的信號(hào)通路在心血管系統(tǒng)中也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[9-10]。研究表明,STAT3 的激活可以減少心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)心肌分化,從而改善心肌重塑和纖維化[11]。
平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 主要參與調(diào)控癌癥相關(guān)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路等,主要涉及細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、磷酸化的正調(diào)控和循環(huán)系統(tǒng)等生物過(guò)程,膜筏、突觸后和細(xì)胞體是參與反應(yīng)的重要細(xì)胞組分,分子功能主要包括蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性和激酶結(jié)合等。
循證醫(yī)學(xué)證實(shí),癌癥與HF 具有共同的危險(xiǎn)因素和信號(hào)通路,并且相互促進(jìn)發(fā)展[12]。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一,能參與血管內(nèi)皮損傷、心臟結(jié)構(gòu)或功能改變等病理過(guò)程。因此,抗動(dòng)脈粥樣硬化治療有助于修復(fù)血管內(nèi)皮損傷和對(duì)抗心肌重構(gòu),在HF 的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[13]。cAMP 的增加可以維持心肌鈣穩(wěn)態(tài)及心肌收縮舒張功能,減少心肌細(xì)胞凋亡[14]。cGMP-PKG 信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控炎癥、氧化應(yīng)激和鈣離子濃度來(lái)減少血管硬化,從而影響心室重構(gòu),改善HF[15]。
綜上所述,平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 可能是作用于AKT1、SRC、STAT3 等靶點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路和脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路,主要涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等機(jī)制,主要集中于膜筏、突觸后、細(xì)胞體等區(qū)域。這為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制提供了參考依據(jù),目前仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。