張雨潔 胡珊珊 史元元 朱青梅 李東鋒

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830011

柴胡注射液（Chaihu Injection，CI）是北柴胡（Bupleurum chinense DC.）經(jīng)水蒸氣蒸餾法制成的注射劑，主成分為柴胡揮發(fā)油[1-2]。2020 版《中華人民共和國藥典》收載的北柴胡為傘形科植物柴胡的干燥根。該藥在1941 年研制，1954 年實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[3]。2022 年8 月至2023 年1 月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診有273 例發(fā)熱患者使用該藥，單用者119 例，聯(lián)合萘普生片者79 例，聯(lián)合安痛定注射液者65例，聯(lián)合萘普生片及安痛定注射液者10例。期間不良反應(yīng)上報(bào)0 起，其退熱效果好且較為安全。既往研究中柴胡主要含三萜皂苷類、揮發(fā)油、黃酮類等成分，具有解熱、抗炎、抗病毒、保肝、抗腫瘤、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等作用[2]。但對其退熱機(jī)制的研究尚存在一定空缺，本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探究該機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 CI活性成分篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[4]中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-like，DL）≥0.18 檢索柴胡活性成分，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充。從PubChem 數(shù)據(jù)庫[5]中收集分子結(jié)構(gòu)。

1.2 CI活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白篩選

從UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[6]中查詢活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)，并進(jìn)行整理。

1.3 發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“ fever”為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫[7]、DurgBank 數(shù)據(jù)庫[8]、人類在線孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（online Mendelian inheritance in man，OMIM）[9]中檢索、去重。

1.4 CI退熱靶點(diǎn)篩選及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction network，PPI）網(wǎng)絡(luò)的建立

使用Venny 2.1 平臺(tái)對1.2 和1.3 的結(jié)果取交集。使用STRING 數(shù)據(jù)庫[10]對交集靶點(diǎn)進(jìn)行互作分析。

1.5 構(gòu)建“ CI-活性成分-靶點(diǎn)基因-發(fā)熱”網(wǎng)絡(luò)

把1.4 的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件[11]，并進(jìn)行分析獲得“ CI-活性成分-靶點(diǎn)基因-發(fā)熱”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

1.6 基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫[12]獲取GO、KEGG 信號通路信息（P≤0.01），取前20 位結(jié)果進(jìn)行分析解讀。

1.7 分子對接

從PDB 數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)信息，使用PyMOL 軟件對結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理。利用AutoDock 軟件處理靶蛋白，AutoDock Vina 模擬分子對接。

2 結(jié)果

2.1 藥物成分靶點(diǎn)

將數(shù)據(jù)庫中的活性成分與文獻(xiàn)報(bào)道[2，13]的檸檬烯（limonene）、α-姜黃烯（α-curcumene）等12 個(gè)成分進(jìn)行整合，見表1。有17 個(gè)柴胡活性成分對應(yīng)210 個(gè)靶點(diǎn)。

表1 柴胡注射液活性成分

2.2 Venn圖

將210 個(gè)藥物靶點(diǎn)與1208 個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集，獲得102 個(gè)CI 退熱的關(guān)鍵靶點(diǎn)，使用Venny 2.1 作圖，見圖1。

圖1 CI 和發(fā)熱交集靶點(diǎn)Venn 圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)

PPI 網(wǎng)絡(luò)中有101 個(gè)點(diǎn)存在相互關(guān)系，點(diǎn)之間有1634 條連線，平均節(jié)點(diǎn)度值為32.4，平均局部聚類系數(shù)值為0.676，表明這些蛋白質(zhì)之間有較多相互作用且在生物學(xué)上是部分相連的。見圖2。

圖2 柴胡注射液退熱靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

以鄰近中心度數(shù)值>中位數(shù)0.5824、中介中心性數(shù)值>中位數(shù)0.0037、度值>中位數(shù)37 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，獲得核心靶點(diǎn)17 個(gè)，包括IL-6、TNF、AKT1 等，見表2。

表2 CI退熱核心靶點(diǎn)

2.5 “ CI-活性成分-靶點(diǎn)基因-發(fā)熱”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

用Cytoscape 3.9.1 軟件建立關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，點(diǎn)與點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)以線條進(jìn)行連接，連線越多表明存在的相互作用關(guān)系密切，核心作用的可能性越大，見圖3。

圖3 “ CI-活性成分-靶點(diǎn)基因-發(fā)熱”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO功能富集

GO 分析獲得生物過程（biological process，BP）條目584 個(gè)，涉及對外來刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、血管生成、缺氧反應(yīng)等過程；得到細(xì)胞成分（cellular component，CC）條目60 種，涉及細(xì)胞外隙、細(xì)胞表面、小窩等；獲得分子功能（molecular function，MF）條目103 項(xiàng)，涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等。選取P值排序選前10 位條目作圖，見圖4。

圖4 GO 功能富集分析

2.7 KEGG通路富集

通過分析獲得156 條通路信息（P< 0.01），涉及AGE-RAGE、TNF、IL-17、人巨細(xì)胞病毒感染、Toll樣受體等信號通路。取前20 位作氣泡圖，見圖5。

圖5 KEGG 通路富集分析

2.8 分子對接驗(yàn)證

以活性成分的度值排名靠前、相互連接關(guān)系多為條件，選出8 個(gè)活性化合物以及10 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，見表3。取結(jié)合能低、結(jié)合能力強(qiáng)的4 組信息，即槲皮素-PTGS2、山奈酚-PTGS2、異鼠李素-PTGS2、槲皮素-TP53，進(jìn)行可視化作圖，見圖6。

圖6 CI 成分與靶蛋白結(jié)合模式圖

表3 CI成分與核心靶蛋白的結(jié)合能（kJ/mol）

3 討論

CI 是普通感冒、流感及瘧疾等所致發(fā)熱的常用制劑之一。發(fā)熱多為病原體引起機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，白細(xì)胞釋放內(nèi)源性致熱源穿過血- 腦屏障，影響體溫調(diào)節(jié)中樞的體溫控制導(dǎo)致發(fā)熱[14]。該藥臨床應(yīng)用多、退熱效果顯著。分子對接中山奈酚、異鼠李素、槲皮素與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能最低、結(jié)合構(gòu)象更穩(wěn)定。既往研究中槲皮素的抗炎作用與抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、降低環(huán)氧合酶和脂氧合酶表達(dá)相關(guān)[15]。山奈酚可調(diào)節(jié)促炎酶活性和炎癥基因表達(dá)[16]，通過抑制轉(zhuǎn)錄因子、黏附分子以及基質(zhì)金屬蛋白酶等途徑發(fā)揮抗炎作用[17]。異鼠李素可通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的產(chǎn)生，發(fā)揮出強(qiáng)效的抗炎活性[18]。這3 種成分是CI 退熱的中心活性成分。

KEGG 結(jié)果提示CI 退熱作用與AGE-RAGE、TNF、IL-17、人巨細(xì)胞病毒感染等通路相關(guān)。它們均可觸發(fā)NF-κB、MAPK 途徑，另外還涉及PI3KAKT-mTOR、C/EBPs 途徑等。通路激活后引起多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL-1、IL-6、GM-CSF、IL-8。其中，IL-1 與lL-1RI 結(jié)合可觸發(fā)Toll 樣受體信號通路。該通路能識(shí)別脂多糖、肽聚糖、脂蛋白及病毒后活化成熟樹突細(xì)胞，提供獲得性免疫的共刺激信號，促進(jìn)lL-1β、IL-1α、IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子表達(dá)[19]。

PTGS2、TP53 是分子對接中最有可能發(fā)揮作用的靶點(diǎn)，PTGS2 的生物學(xué)功能是通過生成PGE2 和PGD2 進(jìn)而控制身體溫度、保護(hù)心血管健康、調(diào)節(jié)情緒等。TP53 編碼抑癌蛋白能對多種細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡、DNA 修復(fù)等。

此外本研究結(jié)果提示CI 可能通過脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE、癌癥途徑等相關(guān)通路發(fā)揮作用。綜上所述，本研究探討了CI 退熱中心成分、核心靶點(diǎn)和通路之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。但本研究局限在于分子對接驗(yàn)證是模擬狀態(tài)，初步闡述了機(jī)制，今后將進(jìn)一步探索CI 的作用機(jī)制。