陳 佳 黃燕霞 馮玉麗 劉貝珠

廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 511400

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性、進(jìn)行性的肺部疾病，目前幾乎沒有治愈的方法，而且預(yù)后不良[1]。肺泡上皮的損傷和再生能力下降是肺纖維化的機(jī)制之一[2]。本研究通過體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，HESC）分化為肺祖細(xì)胞（lung progenitor cells，LPC），移植至健康及博來霉素誘導(dǎo)PF 的免疫缺陷小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)LPC 可以在小鼠體內(nèi)長期存活并抑制PF 的程度。在PF 小鼠中，LPC 可以降低α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白-1（extracellular matrix protein 1，ECM-1）的表達(dá)，同時抑制細(xì)胞凋亡。但未找到LPC 在體內(nèi)表達(dá)表面活性物質(zhì)C（surfactant associated protein C，SPC），分化為肺泡上皮的證據(jù)。本研究提示LPC 可以抑制小鼠PF 的程度，為PF 的治療提供一種可行的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

NCG（NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52IL2rgem26Cd22/Gpt）小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，雌性，6 ～8 周齡。4%多聚甲醛固定液、免疫染色強(qiáng)力通透液、凋亡檢測試劑盒和Triton X-100 購自碧云天。人胚胎干細(xì)胞H9 系（HES H9）購自廣州徠智生物科技有限公司。DMEM 培養(yǎng)基、F-12 培養(yǎng)基購自Gibco公司。mTeSR1 干細(xì)胞培養(yǎng)基、ReLeSRTM 和StemDiff Definitive Endoderm Kit 購自StemCell Technologies 公司。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、Masson 染色試劑盒、細(xì)胞膜橙色熒光探針（1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI）和羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）檢測試劑盒購自索萊寶。防熒光淬滅封片劑（含DAPI）購自白鯊易。

1.2 HES H9體外培養(yǎng)并分化為LPC

HES H9 細(xì)胞體外培養(yǎng)并分化為LPC，培養(yǎng)方法參考StemCell Technologies 公司技術(shù)手冊，分化方案參考Hawkins 等[3]和Peng 等[4]的方法。

1.3 NCG小鼠肺纖維化造模及分組

NCG 小鼠隨機(jī)分為對照組10 只、造模組20 只和治療組20 只。對照組只通過氣管灌注LPC[1×106個細(xì)胞/只，重懸于40 μl 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）]；造模組通過氣管灌注博來霉素（2 μg/10 g）；治療組氣管灌注博來霉素（2 μg/10 g）后2 周再灌注LPC（1×106個細(xì)胞/只，重懸于40 μl PBS）。LPC 移植前使用DiI細(xì)胞膜橙色熒光探針標(biāo)記。小鼠每2 天記錄體重，4 周后犧牲，取肺組織進(jìn)行冰凍切片，檢測α-SMA、ECM-1 的表達(dá)，肺細(xì)胞凋亡和LPC 分化為SPC 成熟肺上皮的情況。病理切片進(jìn)行HE、Masson 染色，并檢測HYP 的表達(dá)。

1.4 相關(guān)指標(biāo)檢測方法

1.4.1 胚胎分化各階段免疫熒光和細(xì)胞流式術(shù) 各階段細(xì)胞提前接種于共聚焦培養(yǎng)皿，去除培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 次，固定10 min，破膜5 min。使用叉頭框轉(zhuǎn)錄因子A2（forkhead box transcription factor A2，F(xiàn)OXA2）和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1/NKX2.1）抗體進(jìn)行孵育，二抗孵育后加入DAPI 防熒光淬滅劑，使用共聚焦顯微鏡拍照記錄。細(xì)胞流式術(shù)處理基本同免疫熒光，處理完畢后上機(jī)。DE 階段使用流式檢測趨化因子受體4（chemokine receptor-4，CXCR4）和免疫熒光檢測FOXA2 評估分化率。LPC 階段使用流式檢測和免疫熒光檢測NKX2.1 評估分化率。

1.4.2 肺組織的冰凍切片免疫熒光 處死小鼠后剪開胸腔，暴露肺和心臟，剪開左心耳，從右心室注射冰凍PBS 灌洗肺部，減少紅細(xì)胞影響。分離肺組織后固定24 h，脫水24 h。肺組織包埋后，-80℃冰凍2 h 后進(jìn)行切片。切片解凍后破膜處理，洗滌后使用免疫組化筆標(biāo)記組織區(qū)域。對照組孵育SPC 抗體，造模組和治療組孵育α-SMA 和ECM-1 抗體。使用共聚焦顯微鏡拍照記錄，使用凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況。每個切片隨機(jī)選取3 個視野（放大倍數(shù)為400 倍）。陽性面積為熒光面積占所檢查的總組織面積的百分比（%Pixel）。

1.4.3 肺組織的石蠟切片HE 和Masson 染色 小鼠肺部取材方法同冰凍切片。取得小鼠肺部組織后使用4%多聚甲醛固定液浸泡48 h，使用全自動脫水機(jī)脫水處理后石蠟包埋。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，使用HE 染色試劑盒、Masson 染色試劑盒染色。樹漆封片后在光學(xué)顯微鏡下拍照記錄。使用Ashcroft score 評估肺纖維化程度，分為0 ～8 個等級，其中0 表示無纖維化，8 表示最嚴(yán)重的纖維化。每個切片隨機(jī)選取3 個視野（放大倍數(shù)為100 倍）。

1.4.4 肺組織HYP 含量測定 取0.2 g 小鼠肺部置于2 ml EP 管中，剪碎，加入1.5 ml 的6 mol/L 的鹽酸溶液，置于煮沸的水浴鍋中3 h。12 000 g 離心10 min，取上清液待測。按照HYP 檢測試劑盒說明書制訂標(biāo)準(zhǔn)曲線以及加入相關(guān)試劑。測定吸光度，計算HYP 含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行方差齊性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。圖片采用Image J 處理，圖表采用GraphPad Prism 制作。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPC體外分化以及在NCG小鼠體內(nèi)定植情況

HES H9 在體外分化為LPC 是需要經(jīng)過DE 階段，此階段的標(biāo)志物為FOXA2 和CXCR4，免疫熒光和細(xì)胞流式術(shù)顯示，F(xiàn)OXA2 和CXCR4 的表達(dá)率能達(dá)到90%。而LPC 的主要標(biāo)志物為NKX2.1，免疫熒光和細(xì)胞流式術(shù)顯示，LPC 的分化效率為70%（圖1A ～D）。將LPC 分別移植至對照組NCG 小鼠及造模組肺纖維化NCG 小鼠肺后4 周取材，通過冰凍切片依舊能找到預(yù)染Dil 染料LPC，提示LPC 能在正常肺部和纖維化肺部定植（圖1E ～F）。但通過免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)LPC 細(xì)胞并不表達(dá)成熟肺上皮的標(biāo)志物SPC，提示LPC 只能在肺內(nèi)定植，但不能分化為成熟肺上皮。

圖1 LPC 體外分化以及在NCG 小鼠體內(nèi)定植情況（n ≥10）

2.2 LPC對肺纖維化NCG小鼠肺部結(jié)構(gòu)影響

HE 染色和Masson 染色結(jié)果顯示，與對照組的肺組織相比，造模組出現(xiàn)了明顯的肺纖維化，肺泡正常結(jié)構(gòu)被破壞，取而代之的是致密的膠原組織。而治療組與造模組肺纖維化程度相比明顯減輕，但與對照組相比，仍然有一定程度的肺纖維化（圖2A ～B）。對照組、造模組、治療組反映肺纖維化程度的Ashcroft score 分別為（2.79±0.18）、（6.25±0.30）、（3.94±0.11），各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2C，F(xiàn)=1009.559，P=0.000）。

圖2 LPC 對肺纖維化NCG 小鼠體重及肺部結(jié)構(gòu)影響（n ≥10）

2.3 LPC對肺纖維化NCG小鼠α-SMA、ECM-1和SPC表達(dá)的影響

α-SMA 和ECM-1 是肺纖維化組織的主要成分，也是反映纖維化嚴(yán)重程度的指標(biāo)[5]。通過肺組織的冰凍切片，行免疫熒光觀察上述成分的表達(dá)量，通過計算熒光面積，從而對其進(jìn)行半定量評估。結(jié)果顯示在灌注LPC 后，治療組α-SMA 和ECM-1 表達(dá)量均比造模組低，但不能低至與對照組相似水平（圖3A ～B）。對照組、造模組、治療組α-SMA 熒光面積分別為（1.19±0.15）、（13.50±0.65）、（2.34±0.06）%Pixel，各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4553.080，P=0.000）；ECM-1 熒光面積分別為（0.77±0.11）、（23.50±0.65）、（1.34±0.07）%Pixel，各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17123.305，P=0.000）。SPC 為Ⅱ型肺泡上皮分泌的蛋白，能反映肺上皮的功能[6]，結(jié)果顯示在灌注LPC 后，治療組SPC 表達(dá)量比造模組高，提示肺上皮功能有所恢復(fù)，但不能恢復(fù)與對照組相似水平（圖3C）。對照組、造模組、治療組SPC 熒光面積分別為（24.90±1.03）、（4.38±0.15）、（13.90±0.49）%Pixel，各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4677.085，P=0.000）。

圖3 LPC 對肺纖維化NCG 小鼠α-SMA、ECM-1 和SPC 表達(dá)的影響（n ≥10）

2.4 LPC對肺纖維化NCG小鼠羥脯氨酸（HYP）表達(dá)量和細(xì)胞凋亡的影響

HYP 是膠原特有的氨基酸，其含量直接反映膠原水平的高低[7]。與對照組比較，造模組HYP含量顯著升高，經(jīng)過LPC 灌注治療后，HYP 水平下降，但不能降至正常水平（圖4A）。對照組、造模組、治療組HYP 濃度分別為（346.20±10.18）、（705.20±32.72）、（442.30±12.11）μg/mg，各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1079.647，P=0.000）。而反映細(xì)胞凋亡的原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TdTmediated-dUTP nick end labeling，TUNEL）染色實驗中，造模組細(xì)胞凋亡水平明顯高于其他組，對照組、造模組、治療組熒光面積分別為（1.94±0.22）、（31.90±1.70）、（4.83±0.22）%Pixel，各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4B，F(xiàn)=3962.008，P=0.000）。

圖4 LPC 對肺纖維化NCG 小鼠HYP 表達(dá)量和細(xì)胞凋亡的影響（n ≥10）

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞在肺纖維化治療方面取得了顯著的進(jìn)展，許多研究表明它們可以減輕肺纖維化的程度[8-9]。然而，這些研究大多數(shù)顯示間充質(zhì)干細(xì)胞無法替代和修復(fù)受損的上皮細(xì)胞[10]，而直接移植胚胎干細(xì)胞則存在形成畸胎瘤的風(fēng)險[11]。為了解決這些問題，本研究將胚胎干細(xì)胞分化為肺系祖細(xì)胞，減少畸胎瘤形成的風(fēng)險，并采用同系的細(xì)胞進(jìn)行移植，以期望實現(xiàn)原位修復(fù)，為臨床應(yīng)用提供實驗室支持。通過在實驗室中進(jìn)行此項研究，為肺纖維化的治療提供了一種新的方法。然而，盡管本研究在實驗室環(huán)境中取得了一定的成功，但在臨床應(yīng)用中仍需進(jìn)一步的研究和驗證。

目前，關(guān)于使用LPC 移植治療肺疾病的研究較少，主要是因為LPC 的誘導(dǎo)和產(chǎn)量存在困難[12-13]。最近，一種商業(yè)方案出現(xiàn)，可以從HT2 陽性肺細(xì)胞中提取并誘導(dǎo)成成熟的肺上皮細(xì)胞[14]。本研究采用了一種從胚胎干細(xì)胞開始的LPC 誘導(dǎo)方案，該方案成熟且產(chǎn)量較大，適用于移植研究。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，移植的LPC 能在肺中存活4 周的時間，但不能分化為能夠分泌SPC 的成熟肺上皮細(xì)胞，可能與缺乏分化因子和適宜的微環(huán)境有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)表明，LPC 可能通過旁分泌的方式緩解肺纖維化，而不是通過分化成成熟的上皮細(xì)胞替代原受損細(xì)胞。LPC 更接近于肺系細(xì)胞，可能具有更好的組織相容性。盡管本研究為LPC 在肺纖維化治療中提供了理論基礎(chǔ)，但仍需要進(jìn)一步研究LPC 的分化機(jī)制和提高治療效果的方法，特別是解決LPC 分化受限的問題，需要探索提供適宜的分化因子和微環(huán)境的策略。

本研究結(jié)果顯示，治療組的細(xì)胞凋亡率較低，同時治療組中纖維化水平的代表性蛋白α-SMA、ECM-1 和HYP 的表達(dá)顯著增加。此外，代表肺上皮細(xì)胞功能的蛋白SPC 在治療組中也呈現(xiàn)出恢復(fù)的趨勢。研究結(jié)果表明低劑量肺上皮細(xì)胞（LPC）可能通過旁分泌途徑減少細(xì)胞凋亡，從而降低α-SMA、ECM-1 和HYP 的水平，保護(hù)肺上皮細(xì)胞，并達(dá)到緩解肺纖維化的目的。這些發(fā)現(xiàn)為干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了實驗基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究LPC 在緩解肺纖維化中的作用提供了依據(jù)。然而，LPC 在體內(nèi)未能成功分化為肺上皮細(xì)胞，無法替代受損的肺上皮細(xì)胞。為了克服這一局限性，可以考慮在體外繼續(xù)將LPC 分化為上皮細(xì)胞，然后再進(jìn)行體內(nèi)移植。這種方法可能有助于突破LPC 無法替代原生肺上皮細(xì)胞的限制，并進(jìn)一步提高其在肺纖維化治療中的效果。然而，這一策略的實施需要更多的實驗和臨床研究來驗證其可行性和安全性。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示了LPC 在減少細(xì)胞凋亡、降低纖維化指標(biāo)蛋白水平、保護(hù)肺上皮細(xì)胞以及緩解肺纖維化方面的潛力。然而，進(jìn)一步的研究仍需要探索LPC 的分化機(jī)制以及提高其在治療肺纖維化中的效果的方法。這將有助于推動干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展，并為肺纖維化患者提供更有效的治療選擇。