顏才榮 朱景法 康麗萍 陳偉文

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院急診科，福建 泉州 362200；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院產(chǎn)科，福建 泉州 362200；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，福建 泉州 362200

膿毒癥（sepsis）是病原微生物感染機(jī)體導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），膿毒癥患者病情發(fā)展到后期可能會(huì)引發(fā)膿毒癥休克（septic shock）、多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）等多種情況，對(duì)患者的生命安全造成嚴(yán)重影響[1]。近年臨床治療水平在不斷提升，但是全球老齡化程度加重等因素導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)病率仍舊呈現(xiàn)增高趨勢(shì)[2-3]。S100 鈣結(jié)合蛋白A12（S100 calcium binding protein A12，S100A12）是目前研究的一個(gè)重點(diǎn)，S100A12 與機(jī)體細(xì)胞增殖分化、炎癥反應(yīng)、鈣離子穩(wěn)態(tài)等都有一定的關(guān)系，研究結(jié)果顯示S100A12可以通過(guò)參與多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)產(chǎn)生作用。S100A12 當(dāng)前主要是與自身免疫性疾病、腎病等疾病的研究相關(guān)，而與膿毒癥等急性感染病癥的相關(guān)研究相對(duì)較少。本文將研究S100A12在小鼠膿毒癥繼發(fā)急性肺損傷的表達(dá)及功能，探究S100A12 在小鼠膿毒癥繼發(fā)急性肺損傷中的作用和可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

48 只雄性C57BL/6 小鼠（年齡7 ～8 周，體重20 ～25 g），隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)（sham group，SHAM）組24 只、盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）組24 只。每組按實(shí)驗(yàn)后4、8、12、24 h 分為4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組，每亞組各6 只。小鼠在12 h 晝夜循環(huán)、22℃～25℃溫度下飼養(yǎng)，可自由獲得食物和水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（豫）2019-0002。

1.2 小鼠膿毒癥模型建立

通過(guò)參閱文獻(xiàn)建立小鼠膿毒癥模型，即采用CLP。小鼠禁食8 h，用1%戊巴比妥鈉溶液（碧云天Beyotime，25 mg/kg，批號(hào)：S1872）腹腔內(nèi)注射麻醉，常規(guī)手術(shù)消毒腹部，脫毛膏去掉右下腹部鼠毛。選擇正中偏下位置切開(kāi)小鼠腹部，打開(kāi)小鼠腹腔尋找盲腸末端。將大腸系膜和盲腸分離，盡量避免傷害小鼠大腸組織。在小鼠盲腸尾端0.5 cm 處使用無(wú)菌絲線緊緊系上，在結(jié)扎的盲腸部位中央使用無(wú)菌針頭刺穿，需要貫穿盲腸組織。結(jié)束后將小鼠盲腸回歸原位，進(jìn)行縫合。SHAM 組分離盲腸末端后，不進(jìn)行結(jié)扎穿孔，直接關(guān)閉腹腔，逐層縫合。所有動(dòng)物均在術(shù)后背后注射無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10016318）1 ml，行液體復(fù)蘇治療。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在室溫下進(jìn)行，術(shù)后小鼠自由飲食、飲水。置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分籠飼養(yǎng)，每籠各6 只，記號(hào)分組。

1.3 小鼠處死及組織標(biāo)本收集

在設(shè)定的目標(biāo)時(shí)間點(diǎn)，即實(shí)驗(yàn)后4、8、12、24 h，用1%戊巴比妥鈉溶液（25 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，將小鼠固定在鼠板上，沿胸腔中線剪開(kāi)皮膚，接著剪斷肋骨開(kāi)胸，露出心臟，用注射器從心尖部進(jìn)針，穿刺進(jìn)入左心室后進(jìn)行心臟取血（0.5 ml/只），將收集到的血液樣本置于1.5 ml Ep 管中，室溫靜止2 ～4 h。血液中的血清析出之后，離心機(jī)設(shè)置4℃低溫，500 g/10 min離心處理，將上層血清取出，放置在新的Ep 管中，12 800 g/10 min 繼續(xù)離心處理。再次取血清，-80℃保存。

采血后在操作臺(tái)上用剪刀將胸主動(dòng)脈剪斷，放血，將整個(gè)右肺用4 號(hào)絲線結(jié)扎，用剪刀剪下右上葉（右側(cè)最大的肺葉），小心取出，置于無(wú)菌平皿中，用磷酸鹽緩沖液沖洗后立即置液氮凍存，保存于-80 ℃液氮直至RNA 被提??；取右下肺葉用4%多聚甲醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：100092683）固定24 h。SHAM 組小鼠在麻醉后，同樣方法進(jìn)行標(biāo)本的采集。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）法測(cè)定血清S100A12蛋白水平

閱讀ELISA 法試劑盒（科艾博生物，批號(hào)：CB10001-Ra）說(shuō)明書(shū)，按照步驟對(duì)微量反應(yīng)板進(jìn)行編號(hào)和分組（空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔），經(jīng)過(guò)洗滌、加抗體、加酶結(jié)合物、加底物、加終止液、測(cè)吸光值，最終繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，根據(jù)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為S100A12 蛋白的實(shí)際濃度。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測(cè)肺組織中S100A12、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的mRNA表達(dá)水平

提取肺組織總RNA，經(jīng)過(guò)RNA 定量、cDNA 反轉(zhuǎn)錄，運(yùn)用Light Cyler480 自帶的軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)收集和定量分析。

1.6 肺組織病理學(xué)觀察及分析

小鼠相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)放血處死后，取右下肺葉用4% 多聚甲醛固定24 h，進(jìn)行石蠟包埋、切片，蘇木精- 伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在普通光鏡下觀察：按Zegdi R 法對(duì)急性肺損傷進(jìn)行評(píng)分，綜合肺泡水腫、間質(zhì)水腫、肺泡內(nèi)白細(xì)胞聚集數(shù)量、出血、肺泡壁厚度等情況，把肺損傷程度分為5 級(jí)：0= 無(wú)損傷，1= 輕度損傷，2= 中度損傷，3=重度損傷，4=極重度損傷。并尋找合適的視野，拍照存檔。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均由SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，不符合正態(tài)分布、方差齊性的計(jì)量資料采用[M（P25，P75）]表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組相關(guān)數(shù)據(jù)之間的比較采用Friedman 秩和檢驗(yàn)。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

CLP 組小鼠在實(shí)驗(yàn)后4 h，活動(dòng)度下降，呼吸頻率加快，情緒不穩(wěn)定，出現(xiàn)躁動(dòng)、目光呆滯、精神不振等情況。在實(shí)驗(yàn)后12 h，小鼠癥狀加重，開(kāi)始出現(xiàn)寒戰(zhàn)、呼吸窘迫、對(duì)外界反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)不靈活等現(xiàn)象，口鼻眼角均有分泌物出現(xiàn)，停止進(jìn)食。之后小鼠癥狀加重，有死亡情況出現(xiàn)。SHAM 組小鼠情況良好，呼吸、精神、進(jìn)食情況良好，無(wú)明顯分泌物，活動(dòng)度高、無(wú)異常排泄物。

2.2 病理學(xué)觀察及評(píng)分

2.2.1 標(biāo)本肉眼觀察 CLP 組小鼠肺部有淤血、腫脹表征，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的加長(zhǎng)，情況越發(fā)嚴(yán)重。小鼠肺部顏色偏向暗紅，肺部表面有明顯的出血點(diǎn)。SHAM 組小鼠肺部組織完整，表面無(wú)明顯出血點(diǎn)，肺部色澤偏向紅潤(rùn)，質(zhì)地相對(duì)柔軟。

2.2.2 HE 染色光鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu) CLP組小鼠肺細(xì)胞腫脹、廣泛性空泡變性、核濃縮，胞漿疏松呈絲網(wǎng)狀、著色深淺不一，纖維組織彌漫性增生，少量肺細(xì)胞萎縮、壞死。SHAM 組小鼠肺部結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)變性、壞死，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)異常，結(jié)構(gòu)明晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組小鼠病理切片（HE 染色，10×）

2.3 兩組小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果比較

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)兩組48 只小鼠進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較兩組之間的差異性，經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間點(diǎn)CLP 組小鼠的肺組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于SHAM 組，評(píng)分在實(shí)驗(yàn)后12 h 開(kāi)始明顯升高，在實(shí)驗(yàn)后24 h 到達(dá)最高值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分比較[分，M（P25，P75）]

2.4 血清指標(biāo)的ELISA檢測(cè)分析

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較兩組之間的差異性，同時(shí)采用Friedman 秩和檢驗(yàn)比較同一組不同時(shí)間濃度是否存在差異。經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CLP 組小鼠的S100A12 ELISA 檢測(cè)水平明顯高于SHAM 組，在實(shí)驗(yàn)后4 h 開(kāi)始明顯升高，在實(shí)驗(yàn)后12 h 到達(dá)最高值，之后稍有回落，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組小鼠血清指標(biāo)的S100A12 ELISA檢測(cè)結(jié)果比較[ng/ml，M（P25，P75）]

2.5 組織各指標(biāo) RT-PCR 檢測(cè)分析

經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)性，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較兩組之間的差異性，同時(shí)采用Friedman 秩和檢驗(yàn)比較同一組不同時(shí)間濃度是否存在差異。經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CLP 組小鼠RAGE mRNA、NF-κB p65 mRNA、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量相較于SHAM 組明顯增高，其中RAGE mRNA 在實(shí)驗(yàn)后8 h 開(kāi)始升高，至24 h到達(dá)最高值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見(jiàn)表3。NF-κB p65 mRNA、TNF-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)后4 h 即明顯升高，并明顯高于SHAM 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見(jiàn)表4 ～5。

表3 兩組小鼠RAGE RT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較（×10-3）[μg/μl，M（P25，P75）]

表4 兩組小鼠NF-κB RT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較[μg/μl，M（P25，P75）]

表5 兩組小鼠TNF-α RT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較[μg/μl，M（P25，P75）]

3 討論

成人流行病學(xué)研究表明[4-5]，全球每年有超過(guò)1800 萬(wàn)例嚴(yán)重膿毒癥，發(fā)病率為0.001%，且患者例數(shù)仍持續(xù)上漲，患者例數(shù)增長(zhǎng)速度約為年均1.5%[6-8]。膿毒癥屬于急性感染疾病，患者一般機(jī)體水平相對(duì)較低，常有合并高血壓、腦卒中等疾病的情況，目前臨床上尚未有統(tǒng)一的有效治療方案[9]。臨床治療膿毒癥一般采用常規(guī)替代治療、抗生素使用、單一細(xì)胞因子拮抗等治療方案[10]。臨床治療和相關(guān)研究顯示，這些治療方案均不能獲得較為理想的治療效果，對(duì)患者預(yù)后水平的改善不利。進(jìn)一步解析膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)明確膿毒癥的具體病理機(jī)制來(lái)尋求新的治療方案是當(dāng)前膿毒癥相關(guān)研究的重點(diǎn)之一。在過(guò)去的研究中[11-13]，膿毒癥被認(rèn)為是過(guò)度炎癥反應(yīng)，一般采取拮抗過(guò)度炎癥的治療方式進(jìn)行治療。但是隨著研究的不斷深入，膿毒癥的病理機(jī)制進(jìn)一步明確。膿毒癥發(fā)病過(guò)程中，患者體內(nèi)的各種細(xì)胞因子水平會(huì)持續(xù)升高，各種細(xì)胞因子互相作用，會(huì)導(dǎo)致患者血液中多種炎癥因子水平過(guò)高，對(duì)患者造成一系列損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)[14]。膿毒癥病情發(fā)作過(guò)程中的炎性因子反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的交互的網(wǎng)絡(luò)作用，采用單一炎性因子拮抗治療并不能取得較好的治療效果。因此不少研究學(xué)者轉(zhuǎn)向生物分子學(xué)[15]，試圖從膿毒癥的病理機(jī)制和炎癥反應(yīng)信號(hào)通路及相關(guān)蛋白入手，探究膿毒癥的治療方案。膿毒癥發(fā)展過(guò)程中會(huì)引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，患者機(jī)體中的多組織多器官都會(huì)受到一定程度的影響，患者很有可能會(huì)出現(xiàn)多種并發(fā)癥。膿毒癥繼發(fā)急性肺損傷是膿毒癥治療過(guò)程中較為常見(jiàn)的一種并發(fā)癥。當(dāng)前針對(duì)膿毒癥繼發(fā)急性肺損傷還沒(méi)有較好的治療方案，原因在于膿毒癥無(wú)法短期治愈，患者肺部會(huì)持續(xù)遭受損傷。本研究主要是針對(duì)膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷，結(jié)果顯示隨著膿毒癥的加重，小鼠肺部組織受到損壞，肺部出現(xiàn)明顯損傷，S100A12、RAGE、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平上升，S100A12 水平與促氧因子、肺部損傷存在正相關(guān)性，提示S100A12可能與膿毒癥后急性肺損傷存在一定的關(guān)系。

結(jié)合已有的研究，可以合理推測(cè)在膿毒癥小鼠急性肺損傷中S100A12 的表達(dá)與小鼠急性肺損傷病情發(fā)展存在一定的關(guān)系，S100A12 表達(dá)水平可能可以用于膿毒癥患者診斷中，改善膿毒癥患者急性肺損傷診斷水平不易、預(yù)后水平較低的問(wèn)題。