柳嘉毅 劉啟紅 彭先 楊慧 邱美珍 曾一鳴 燕海峰

摘 要：為篩選出效果較好的B系列雞精液稀釋液，以稀釋后冷藏保存不同時(shí)長(zhǎng)精子活力、受精率與孵化率為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：1）稀釋冷藏30 min 后，EL、EH組的精子活力顯著優(yōu)于B1組（P<0.05）；冷藏24 h后，EH、EL組的精子活力顯著高于P組（P＜0.05）；B1組和P組在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異；2）稀釋后立即輸精，EL組的受精率比B1組高4.9%，但受精蛋孵化率降低5.5%，最終B1組入孵蛋孵化率比EL組高0.7%；稀釋冷藏10 h后輸精，EL組受精率比B1組高7%，但受精蛋孵化率比B1組低11%。B1組入孵蛋孵化率比EL組高5%，但比原精組低3%；3）稀釋湘黃雞精液冷藏運(yùn)輸70 km后輸精，6個(gè)家系平均受精率為83.7%，受精蛋孵化率為89.8%，入孵蛋孵化率為75.2%；4）稀釋液實(shí)際應(yīng)用方面：B1、B2液輸精效果較好，但B2液成本較低，孵化結(jié)果優(yōu)于B1液與雞場(chǎng)自配稀釋液。綜上所述，單純降低B系列稀釋液中TES含量（B1液）不利于精子生存，而等比例降低各組分，將滲透壓調(diào)整為280 mOsm/kg（B2液）時(shí)，孵化效果較好。

關(guān)鍵詞：雞精液稀釋液；精子活力；受精率；孵化率

公雞精液具有體積小、精子密度大、體外存活時(shí)間短等特點(diǎn)[1]。采集的原精如果30 min內(nèi)不輸精，精子便會(huì)凝結(jié)、死亡[2]。雞精液稀釋液是通過模擬雞精液成分配制出適宜精子生存并保持其良好受精能力的液體。雞精液稀釋技術(shù)在雞人工授精中有較大的應(yīng)用價(jià)值，一是可以大幅度提高公雞配種的母雞數(shù)，減少種公雞的飼養(yǎng)量，降低雞場(chǎng)運(yùn)營(yíng)成本；二是能降低精子密度，改善精子體外生存環(huán)境，延長(zhǎng)精子體外存活時(shí)間，從而延長(zhǎng)輸精時(shí)間[3-4]；三是如果稀釋冷藏一定時(shí)間后輸精效果與原精無(wú)顯著差異，那么就能實(shí)現(xiàn)公雞與母雞分開飼養(yǎng)，集中采精、輸精，實(shí)現(xiàn)更科學(xué)的種雞管理[5]。然而，雞精液稀釋液的效果差異較大，受到溫度、滲透壓、稀釋液配方等因素影響。因此，通過對(duì)稀釋與冷藏后精子活力、輸精后受精率、受精蛋孵化率以及異地輸精效果等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，篩選出效果較好的雞精液稀釋液，為研發(fā)高效稀釋液及配套技術(shù)提供數(shù)據(jù)支撐。

1? 材料與方法

1.1? 精液稀釋液

B系列稀釋液配方見表1。與B1稀釋液相比，B2稀釋液各組分等比例降低，B3稀釋液TES含量降低，EH、EL稀釋液配方見文獻(xiàn)[5]，為湖南省畜牧獸醫(yī)研究所（簡(jiǎn)稱“畜牧所”）配制；J稀釋液為0.9%生理鹽水（湖南科倫制藥有限公司），簡(jiǎn)稱“鹽水”；P稀釋液為西班牙Pedro García Casado博士贈(zèng)送；D稀釋液為上海家禽育種有限公司（簡(jiǎn)稱“上海家禽”）種雞場(chǎng)自配。

1.2? 試驗(yàn)動(dòng)物

種雞為9月齡，其中湘黃公雞20只、羅曼母雞38只，于湖南省畜牧獸醫(yī)研究所單籠飼養(yǎng)；湘東公雞90只、母雞900只，于瀏陽(yáng)市湘依園生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司（簡(jiǎn)稱“湘依園公司”）單籠飼養(yǎng)。

1.3? 試驗(yàn)方法

1.3.1? 精子活力檢測(cè)? 提前在EP管各分裝0.6 mL稀釋液（P、B1、EH、EL液），采集湘黃公雞混精2.0 mL，在室溫下每管添加0.3 mL精液混勻，于5 ℃冷藏保存。分別于30 min、24 h和48 h后進(jìn)行精子活力檢測(cè)，每個(gè)時(shí)間段檢測(cè)3次[6]。

1.3.2? 立即輸精與冷藏輸精效果檢測(cè)? ?1）稀釋后立即輸精檢測(cè)：將羅曼蛋雞分為兩組，每組19只，利用上述優(yōu)選的B1、EL稀釋液，按體積比1：1稀釋湘黃雞混合精液，每只母雞輸精30 μL，每天輸精1次，連續(xù)2 d。第1次輸精24 h后開始撿蛋，連續(xù)撿蛋5 d后進(jìn)行恒溫恒濕孵化（37.5 ℃、65%相對(duì)濕度）。在孵化至第7天時(shí)檢測(cè)種蛋受精率，孵化至第27～29天時(shí)檢測(cè)孵化率；2）稀釋冷藏10 h輸精檢測(cè)：立即輸精試驗(yàn)結(jié)束20 d后，稀釋冷藏10 h后進(jìn)行輸精，以原精組（鮮精輸精）為對(duì)照，每只母雞輸精體積相同，操作方法與檢測(cè)指標(biāo)同上；3）稀釋冷藏后遠(yuǎn)距離運(yùn)輸輸精檢測(cè)：采用B1稀釋液等體積比稀釋湘黃公雞精液后，冷藏運(yùn)輸至70 km以外的湘依園公司對(duì)湘黃母雞進(jìn)行輸精（冷藏約5 h，每只母雞輸精體積為30 μL），對(duì)照組母雞為2個(gè)家系，采用湘東公雞鮮精，稀釋組母雞為6個(gè)家系，兩組輸精體積相同，操作方法與檢測(cè)指標(biāo)同上。

1.3.3? B系列稀釋液滲透壓與TES用量?jī)?yōu)化? 采用B1、B2、B3稀釋液與常用生理鹽水（J液）比較。在湖南湘依園公司，對(duì)湘東公雞精液等體積比稀釋后立即輸精，對(duì)照組為原精組，試驗(yàn)組分別為B1、B2、B3組，每只母雞每次輸精25 μL，每天輸精1次，連續(xù)2 d，第1次輸精24 h后開始撿蛋（連續(xù)5 d）入孵，測(cè)定孵化率。

1.3.4? B系列稀釋液實(shí)際應(yīng)用效果檢測(cè)? 1）小規(guī)模輸精效果檢測(cè)：將B1、B2稀釋液與種雞場(chǎng)自配稀釋液進(jìn)行小規(guī)模輸精效果對(duì)比試驗(yàn)。采用4種稀釋液（B1、B2、種雞場(chǎng)自配D稀釋液和J液）對(duì)28羽貴妃公雞精液進(jìn)行等體積比稀釋，然后對(duì)48羽洛島紅母雞進(jìn)行輸精，每只洛島紅母雞輸精25 μL，檢測(cè)孵化效果；2）擴(kuò)大規(guī)模輸精效果檢測(cè)：選擇B2稀釋液和種雞場(chǎng)自配D稀釋液，在河南某種雞場(chǎng)選擇條件相當(dāng)?shù)?、5號(hào)雞舍，每組采集48羽貴妃公雞精液進(jìn)行稀釋，分別對(duì)732羽洛島紅母雞進(jìn)行輸精，每只母雞每次輸精25 μL，檢測(cè)孵化效果。

1.4? 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2? 結(jié)果

2.1? 不同稀釋液對(duì)精子存活力的影響

表2為4種雞精液稀釋液對(duì)精子存活力的影響。由表2可知，稀釋冷藏保存30 min后，EH、EL組精子存活力顯著優(yōu)于 B1組（P＜0.05）；保存24 h后，EH、EL組保存效果顯著優(yōu)于P組（P＜0.05）；保存48 h后，4種稀釋液之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2? 輸精效果對(duì)比

2.2.1? 稀釋后立即輸精效果對(duì)比? 表3為B1、EL稀釋精液后立即輸精的孵化效果。由表3可知，稀釋后立即輸精，EL組受精率比B1組高4.9%，但受精蛋孵化率降低5.5%，最終B1組入孵蛋孵化率比E組高0.7%。說明不同稀釋液稀釋精液后立即輸精，受精率與受精蛋孵化率的變化趨勢(shì)并不一致。

2.2.2? 稀釋冷藏10 h后輸精效果對(duì)比? 表4為B1、EL稀釋精液冷藏10 h后輸精的孵化效果。由表4可知，EL組受精率比B1組高6.9%，但受精蛋孵化率卻降低10.7%，最終B1組入孵蛋孵化率比EL組高5.0%，但仍比原精組低3.0%。

2.2.3? 稀釋精液冷藏后遠(yuǎn)距離運(yùn)輸輸精效果? 表5為B1稀釋精液遠(yuǎn)距離冷藏運(yùn)輸?shù)妮斁ЧＳ杀?可知，湘黃雞精液經(jīng)B1稀釋液稀釋冷藏運(yùn)輸70 km后對(duì)6家系母雞輸精，受精率在79.0%～90.0%，受精蛋孵化率在86.8%～92.1%，平均受精率83.7%，平均受精蛋孵化率為89.8%，平均入孵蛋孵化率為75.2%。而湘東雞原精的受精率在91.5%～93.6%，受精蛋孵化率在94.4%～95.3%，平均受精率為92.6%，受精蛋孵化率為94.8%，入孵蛋孵化率為87.8%，均高于B1組。但是，原精組所用公雞與B1組不同，可能會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定影響。

2.3? B系列稀釋液滲透壓與TES用量?jī)?yōu)化

表6為不同稀釋液稀釋不同家系湘東雞精液后的輸精效果。由表6可知，5組受精率由大到小依次為B2（87.5%）＞J（86.7%）＞原精（86.6%）＞B1（86.5%）＞B3（82.0%）；5組受精蛋孵化率由大到小依次為原精（93%）＞B1（92.2%）＞B2（91.3%）＞J（86.3%）＞B3（85.6%）；5組入孵蛋孵化率由大到小依次為原精（80.5%）＞B2（80.1%）＞B1（78.8%）＞J（73.7%）＞B3（70.0%）；4個(gè)稀釋液組之間，受精率、受精蛋孵化率均沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.4? B系列稀釋液實(shí)際應(yīng)用效果

2.4.1? B稀釋液小規(guī)模應(yīng)用效果檢測(cè)? 表7為B1、B2稀釋液小規(guī)模應(yīng)用效果。由表7可見，B1組精子活力優(yōu)于D組，受精率比D組高4%。盡管B2組受精率比J組低4%，但無(wú)論是精子活力還是活胚率，B2組要優(yōu)于J組，尤其是活胚率提高26%。

3? 討論

3.1? 雞精液稀釋液篩選

雞精液稀釋液的主要成分有供能的糖類（葡萄糖、果糖等）、維持滲透壓的谷氨酸鈉、pH緩沖劑（檸檬酸鈉、TES）、廣譜殺菌物質(zhì)（鮭魚精蛋白硫酸鹽）等成分。國(guó)內(nèi)外常見的雞精液稀釋液有：BPSE（Beltsville Poultry Semen Extender）、Lake、FEB、Lake and Ravie等[7]。劉紅舉等[8]比較不同稀釋液的效果（Lake、BJJX、BPSE、F.sexton、生理鹽水、原精），結(jié)果表明受精率由高到低依次為L(zhǎng)akes（93.5%）＞原精（93.0%）＞BPSE（92.9%）＞生理鹽水（91.7%），健雛率由高到低依次為L(zhǎng)akes（88.2%）＞BJJX（87.7%）＞BPSE（87.2%）＞生理鹽水（86.3%），受精率與健雛率均沒有顯著差異，但稀釋液BPSE、BJJX按體積比2：1與精液稀釋，節(jié)約了原精使用量。蘇東頓[9]等采用STJX（自配稀釋液）、BPSE、Lake稀釋狄高黃羽肉雞精液，受精率自高到低分別為L(zhǎng)ake（96.0%）＞STJX（95.4%）＞BPSE（91.2%）；稀釋冷藏存活時(shí)間自高到低分別為STJX（288 h）＞BPSE（252 h）＞Lake（204 h）；稀釋冷藏5 h后受精率從高到低分別為STJX（93.3%）＞BPSE（85.9%）＞Lake（80.0%）；稀釋冷藏24 h后受精率分別為STJX（82.6%）、Lake（82.5%）。以上結(jié)果表明，稀釋后立即輸精、稀釋冷藏不同時(shí)間的精子活力、稀釋冷藏不同時(shí)間后輸精的受精率等指標(biāo)變化趨勢(shì)均不一致，這與本文結(jié)果相同。

徐松山等[10]將北京油雞混合精液等量分為4個(gè)組，Ａ組精液不處理作為對(duì)照，Ｂ組用BPSE液按體積比1：1稀釋，Ｃ組精液離心去除上層精漿，加入與精漿等體積的BPSE液，Ｄ組在Ｃ組基礎(chǔ)上再用BPSE稀釋液按體積比1：1稀釋，同樣發(fā)現(xiàn)冷藏不同時(shí)間后精子活力、受精率、受精蛋孵化率的變化趨勢(shì)不一致。Mohan等[11]采用BPSE稀釋液稀釋地方雞和白來航雞精液，立即輸精后受精率分別為85%、91%，受精蛋孵化率分別為87%與99%，冷藏24 h后的輸精受精率分別為47%與70%，說明不同品種的輸精效果差異很大。

近年來在常見稀釋液中添加溶質(zhì)改進(jìn)效果的研究逐漸增多。Long等[12]報(bào)道采用BPSE稀釋液時(shí)，添加2.5 mg/mL磷脂酰膽堿能顯著提高精子的水解能力以及24 h冷藏的火雞精液的受精率（66%）與孵化率（96.5%）。本課題組一直基于BPSE稀釋液在種雞場(chǎng)應(yīng)用研究，未來可在該領(lǐng)域進(jìn)行深入研究。

3.2? ?雞精液稀釋液滲透壓優(yōu)化

雞稀釋液滲透壓是影響受精能力最重要的特性之一[13-14]。有報(bào)道認(rèn)為雞精液的滲透壓一般為330～420 mOsm/kg[15]，也有報(bào)道為295～360 mOsm/kg[16]。張兆旺等[17]比較了不同滲透壓（304～576 mOsm/L）稀釋液對(duì)羅斯種公雞精液精子生存指數(shù)與存活時(shí)間影響，發(fā)現(xiàn)最適宜雞精子生存的稀釋液滲透壓為352～362 mOsm/L。趙建軍等[18]采用不同滲透壓（300、400、500 mOsm/kg）稀釋液對(duì)羅曼種公雞精子進(jìn)行低溫保存，發(fā)現(xiàn)300 mOsm/kg組精子活力與生成指數(shù)最高。稀釋液最佳滲透壓的范圍會(huì)受到不同的稀釋液種類、添加物質(zhì)、家禽種類等因素影響，普遍認(rèn)為稀釋液冷藏保存滲透壓接近等滲時(shí)效果更好。王曉娟等[19]比較了自配YHFB稀釋液在低溫保存黑鳳雞精液時(shí)滲透壓（261、294、340 mOsm/kg）的效果，其中261 mOsm/kg組在386 h內(nèi)精子活力最佳。Moce等[20]研究發(fā)現(xiàn)BPSE液最佳滲透壓在340～350 mOsm/kg。Woelders等[21]采用Lakes稀釋液稀釋科布雞精液在4種不同滲透壓下（290、325、365、410 mOsm/kg）冷藏保存4 d，滲透壓為290、325 mOsm/kg時(shí)精子活率顯著高于365、410 mOsm/kg，290 mOsm/kg的膜完整性顯著高于其他三組，但低于加入牛血清蛋白后的325 mOsm/kg組。以上研究以稀釋冷藏不同時(shí)間后精子的存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，未采用輸精后受精率與孵化率等指標(biāo)進(jìn)行衡量。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B2稀釋液（287 mOsm/kg）精子活力、受精率與B1液（340 mOsm/kg）沒有顯著差異，但稍高于B1液，與以上結(jié)果相同，揭示出略微低滲的環(huán)境更適合體外精子生存。

3.3? B系列稀釋液TES用量?jī)?yōu)化

TES是稀釋液中維持pH值的緩沖物質(zhì)，價(jià)格偏高，在保證減少稀釋液pH值與滲透壓維持在合適的范圍前提下，減少其用量對(duì)降低稀釋液成本至關(guān)重要。Lake等[22]研究表明，pH值直接影響雞精細(xì)胞內(nèi)的酶促反應(yīng)，進(jìn)而影響精子的新陳代謝與活力，稀釋液pH 在6.8～7.1對(duì)精子活力較好。陳理盾等[23]比較了9種不同配方的稀釋液對(duì)精子存活時(shí)間、生存指數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)最佳配方的pH值為6.7，其他較好的4種配方pH值為6.7～7.2。魏曉冉等[5]報(bào)道將低溫保存稀釋液中TES含量降低時(shí)，pH 值由7.16升至7.64，滲透壓略微降低，精子活力、受精率、胚早死率均沒有顯著差異。王曉娟等[19]在研究自配稀釋液低溫保存黑鳳雞精子效果時(shí)，發(fā)現(xiàn)稀釋液TES濃度降低時(shí)，滲透壓由340 mOsm/kg降低為261 mOsm/kg，pH值略微變化，TES濃度最低的稀釋液精子活力最佳；通過調(diào)整稀釋液中弱堿鹽含量，pH值變化后（pH 7.38、pH 7.29、pH 7.11）對(duì)稀釋后黑鳳雞精子保存相同時(shí)間精子活力差異均不顯著。低溫保存時(shí)，精子對(duì)稀釋液pH值適應(yīng)范圍較廣，原因可能是低溫保存的精子新陳代謝微弱。多數(shù)稀釋液的pH值為弱堿性，因?yàn)榫涸诒４孢^程中會(huì)產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，堿性稀釋液能夠中和一部分酸性物質(zhì)，防止pH值過低造成精子死亡[24]。

本試驗(yàn)TES用量減半時(shí)（B3液），pH值從7.30降低為7.16，滲透壓略微降低，盡管精子活力、受精率、孵化率與原精、B1液差異不顯著，但受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率遠(yuǎn)低于原精與B1液，說明單純降低TES含量，或者TES含量太低，都不利于精子體外生存。將各組分等比例降低（B2液），pH值為7.30，滲透壓為287 mOsm/kg，孵化效果與B1液和原精相近。

4? 結(jié)論

單純降低B系列稀釋液中TES含量（B1液）不利于精子生存，而等比例降低各組分，將滲透壓調(diào)整為280 mOsm/kg（B2液）時(shí)，孵化效果較好。

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