陳美樺，徐含翠，王林旭，羅洪，齊琦，王勃，段小濤

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，國家安全特需藥品全國重點實驗室，北京 100850）

水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）是彈狀病毒科水皰病毒屬，是一種負(fù)鏈RNA病毒。VSV 具有廣泛的宿主范圍，能夠感染豬、馬和人類等各類哺乳動物，其癥狀表現(xiàn)為舌、唇和乳頭等部位出現(xiàn)水皰和潰爛，頭疼和發(fā)熱等癥狀［1-3］。由于VSV 結(jié)構(gòu)簡單，且復(fù)制快，已被廣泛用于研究RNA病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制［4］。

單純皰疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus 1，HSV-1）屬于皰疹病毒亞科，是一種DNA 病毒［5］。人類是HSV-1 天然宿主，病毒經(jīng)呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破損皮膚等途徑侵入機(jī)體，引起口唇皰疹、角膜炎、腦炎和生殖器感染等疾?。?］。有研究報道，HSV-1可增加人類免疫缺陷病毒感染的風(fēng)險［7］，其復(fù)制快，致病性高，可使宿主終身感染［8］。

真核翻譯延伸因子1A1（eukaryotic translation elongation factor1A，eEF1A1）屬于GTP 結(jié)合蛋白，在mRNA 翻譯時促進(jìn)多肽鏈延伸［9］。eEF1A1具有多種功能，包括蛋白質(zhì)翻譯［10］、細(xì)胞生長［11-12］、腫瘤增殖［13］和病毒復(fù)制等［14-16］。eEF1A1參與多種蛋白的合成和翻譯，而大多數(shù)病毒的復(fù)制都需要宿主蛋白的參與，因此提示eEF1A1 是病毒復(fù)制的一個重要因素。但目前關(guān)于eEF1A1影響病毒復(fù)制的研究大多都停留在eEF1A1 與RNA 病毒相互作用，如eEF1A1 可以與人類免疫缺陷病毒Ⅰ型的逆轉(zhuǎn)錄酶或乙型肝炎病毒X 蛋白相互作用［15-16］；eEF1A1 對不同種類病毒基因組復(fù)制的影響尚未明確報道。

因此，本研究用VSV 與HSV-1 分別建立RNA與DNA 病毒感染體系，探究eEF1A1 對不同種類病毒復(fù)制的影響，以確定一個廣譜抗病毒新靶點；用雙鏈RNA 類似物聚胞苷酸〔polyinosinic-polycytidylic acid，poly（I：C）〕或脫氧核糖核酸鈉鹽（herringtestis DNA，HT-DNA）去探究eEF1A1 是否參與天然免疫，嘗試從宿主角度出發(fā)探究eEF1A1 對病毒復(fù)制的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒、試劑和儀器

人皮膚成纖維細(xì)胞株BJ-5ta 購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。VSV和HSV-1由本實驗室于-80 ℃保存。poly（I：C）與HT-DNA，美國Sigma公司。

DMEM 培養(yǎng)基，德國Sigma 公司；胎牛血清、胰酶和磷酸鹽緩沖液，北京中科邁晨；LipofectamineiMAX轉(zhuǎn)染試劑，美國Invitrogen公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，美國Selleck公司；Bradford蛋白定量試劑盒和ECL顯影液，美國Thermo公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 抗體（批號：AS003）和HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（批號：AS014），武漢愛博泰克生物科技有限公司；eEF1A1抗體（批號：sc21758），美國SantaCruz；VSV 糖蛋白（VSV-G）抗體（批號：Ab50549）、HSV 糖蛋白B（HSV-gB）抗體（批號：Ab6506）、干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor 3，IRF3）抗體（批號：Ab68481）和p-IRF3 抗體（批號：Ab76393），英國Abcam 公司；TANK 結(jié)合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）抗體（批號：3504S）和p-TBK1 抗體（批號：5483S），美國CST公司；PVDF 轉(zhuǎn)印膜，美國Millipore 公司；RNA 提取試劑盒（批號：DP419），天根生化科技（北京）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：RR035A-1），日本TaKaRa 公司。siRNA 核酸序列，廣州銳博生物科技有限公司。

CFX96 實時熒光定量PCR 儀，美國Bio Rad 公司；Synergy H1 多功能酶標(biāo)儀，美國Bio Tek 公司；JY300HE電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；2720 梯度PCR 儀、1384 生物安全柜、Heracell VIOS 160i CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱、NanoDrop One 分光光度計，美國Thermo 公司；TS2-FL 倒置熒光顯微鏡，德國Nikon 公司；KLCZ-1220A 超凈工作臺，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞傳代和培養(yǎng)

將BJ-5ta 細(xì)胞用DMEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素）培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。細(xì)胞密度至80%，按1∶3傳代。

1.3 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）的轉(zhuǎn)染

將對數(shù)生長期BJ-5ta細(xì)胞以7×107L-1接種于24孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)35%，轉(zhuǎn)染siRNA。siRNA 核酸序列見表1。A 液：Lipofectamine-iMAX 1 μL 與opti-MEM 25 μL 混合，靜置5 min；B 液：siRNA（20 μmol·L-1）0.6 μL 與opti-MEM 25 μL 混合，靜置5 min；將A 液和B 液輕輕混勻，室溫靜置15 min。均勻滴加至每孔培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h 后更換新完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實驗。

Tab.1 Sequences of small interfering RNA(siRNA)

1.4 病毒感染

將VSV 或HSV-1 病毒以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.1 或1.0，加入至1.3 制備的細(xì)胞，培養(yǎng)2 h 后，更換新的含2%血清的培養(yǎng)基，放置37 ℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。VSV 和HSV-1病毒均在Ⅱ級生物安全柜中使用。

1.5 核酸類似物poly（l∶C）或HT-DNA轉(zhuǎn)染

取1.3 制備的細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)染poly（I:C）或HT-DNA。轉(zhuǎn)染前1 h 更換DMEM 完全培養(yǎng)基，A液：Lipofectamine-iMAX 1 μL與opti-MEM 25 μL混合，靜置5 min；B 液：poly（I:C）或HT-DNA（1 mg·mL-1）0.25 μL分別和opti-MEM 25 μL混合，靜置5 min；將A 液和B 液輕輕混勻，室溫靜置15 min。均勻滴加至每孔培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3 h和6 h 后收集細(xì)胞樣品，提取RNA和蛋白檢測相關(guān)分子的表達(dá)。

1.6 實時熒光定量PCR

按照RNA 提取試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（反應(yīng)條件：37 ℃15 min，85 ℃10 s），以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，共45個循環(huán)），數(shù)值均以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，用2-ΔΔCt法計算目標(biāo)基因mRNA 的相對表達(dá)水平，每組設(shè)置3復(fù)孔；相關(guān)引物序列見表2。

Tab.2 Primer sequence for RT-qPCR

1.7 Western印跡法

PBS 洗細(xì)胞，加入RIPA 裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑）冰上靜置5 min，BCA 法定量蛋白，取15 μg 蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離蛋白，蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗〔抗VSV-G，HSV-gB，p-IRF3，p-TBK1，IRF3 和TBK1（均1∶2500），GAPDH（1∶10 000）〕4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠或山羊抗兔lgG 抗體（1:5000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影，暗室中曝光膠片。通過Image J軟件對蛋白條帶的積分吸光度進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值的比值表示目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，用Graphpad prism 8.3.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。多組間采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敲低eEF1A1效果驗證

圖1 顯示，與陰性對照組相比，eEF1A1基因沉默組eEF1A1 的mRNA 和蛋白水平顯著降低（P＜0.01），表明eEF1A1基因沉默的細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

Fig.1 Efficiency verification of knocking down of eEF1A1. BJ-5ta cells were transfected with siRNA for 48 h. A：the mRNA level of eEF1A1 was detected by RT-qPCR. B：the protein level of eEF1A1 was detected by Western blotting. C was the semi-quantitative result of B.IA:integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with si-control group.

2.2 敲低eEF1A1抑制VSV復(fù)制

圖2 顯示，與陰性對照組相比，eEF1A1基因沉默組的VSV 基因拷貝數(shù)下降70%～80%（P＜0.01）；VSV蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

Fig.2 Knockdown of eEF1A1 inhibits vesicular stomatitis virus(VSV)replication.BJ-5ta cells were transfected with siRNA for 48 h and then stimulated with VSV for 12 h. A：the genome copy number of VSV was detected by RT-qPCR.B：the protein level of VSV was detected by Western blotting. C was the semi-quantitativeresultof B. x±s，n=3.＊＊P＜0.01，comparedwith si-control group.

2.3 敲低eEF1A1抑制HSV-1復(fù)制

圖3顯示，與陰性對照組相比，eEF1A1基因沉默組HSV-1 的mRNA 水平下降50%～60%（P＜0.01）；HSV-1蛋白水平顯著降低（P＜0.01）。

Fig.3 Knockdown of eEF1A1 inhibits herpes simplex virus 1 (HSV-1)replication. BJ-5ta cells were transfected with siRNA for 48 h and then stimulated with HSV-1 for 12 h. A：the mRNA level of HSV-1 was detected by RT-qPCR. B：the protein level of HSV-1 was detected by Western blotting.C was the semi-quantitative result of B. x±s，n=3. ＊P＜0.05,＊＊P＜0.01，compared with si-control group.

2.4 敲低eEF1A1 不影響poly（l：C）及HT-DNA 激活的胞內(nèi)核酸識別免疫通路

圖4 和5 顯示，poly（I：C）或HT-DNA 誘導(dǎo)后，與陰性對照組相比，eEF1A1基因沉默組的IFN-β、ISG56和CXCL10的mRNA水平以及IRF3與TBK1的蛋白磷酸化水平無顯著差異。

Fig.4 Knockdown of eEF1A1 does not affect the innate immune response to polyinosinic-polycytidylic acid[poly(l∶C) ]. BJ-5ta cells were stimulated with poly（I：C）after transfected with siRNA for 48 h.A:the mRNA levels of IFN-β,CXCL10 and ISG56 were detected by RT-qPCR. B1：the protein levels of p-IRF3 and p-TBK1 were detected by Western blotting. B2 was the semiquantitative result of B1.

Fig.5 Knockdown of eEF1A1 does not affect the innate immune response to herringtestis DNA (HT-DNA). BJ-5ta cells were stimulated with HT-DNA after transfected with siRNA for 48 h. A: the mRNA levels of IFN-β,CXCL10 and ISG56 were detected by RT-qPCR.B1：the protein levels of p-IRF3 and p-TBK1 were detected by Western blotting.B2 was the semi-quantitative result of B1.

3 討論

病毒基因組mRNA 和蛋白是評價病毒復(fù)制量的關(guān)鍵因素。研究報道，eEF1A1 參與RNA 病毒轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體的形成［17］，但未涉及eEF1A1 對不同種類病毒基因組復(fù)制的影響。VSV 和HSV-1 常被當(dāng)作工具病毒運(yùn)用于先天免疫信號通路的研究中［18］。本研究表明，抑制eEF1A1 后，VSV 的基因拷貝數(shù)和蛋白水平顯著降低；HSV-1的mRNA 和蛋白水平顯著降低。以上結(jié)果提示，eEF1A1 對RNA 病毒和DNA病毒具有潛在的廣譜調(diào)控作用。

病毒感染的先天免疫反應(yīng)是由模式識別受體識別病毒核酸而引發(fā)的，其中包括Toll 樣受體，RIG-I樣受體和胞質(zhì)DNA傳感器。天然免疫是宿主抵抗病原入侵的第一道防線。感染病毒后，機(jī)體通過模式識別受體識別病毒的DNA 或RNA，快速啟動固有免疫反應(yīng)，有效清除入侵的病毒并進(jìn)行機(jī)體損傷修復(fù)。在感知危險信號后，調(diào)控細(xì)胞抗病毒免疫的關(guān)鍵激酶TBK1 被激活，并進(jìn)一步磷酸化轉(zhuǎn)錄因子IRF3，使其入核，誘導(dǎo)下游干擾素的產(chǎn)生［19］。TBK1 是固有免疫細(xì)胞抗病毒信號通路的中心節(jié)點，其活性和穩(wěn)定性均需受到精細(xì)的控制，功能異常將導(dǎo)致自身免疫疾病和慢性炎癥等疾病發(fā)生。本研究表明，干擾素激動劑雙鏈RNA 類似物Poly（I：C）或HT-DNA刺激eEF1A1基因沉默的細(xì)胞后，IFN-β、CXCL10和ISG56的mRNA 水平以及TBK1與IRF3 的蛋白磷酸化水平均無顯著差異。因此推測，eEF1A1 在體內(nèi)對病毒復(fù)制量的影響可能不通過胞內(nèi)核酸識別的天然免疫，但不排除eEF1A1 會通過其他天然免疫機(jī)制抑制病毒。同時有研究報道，eEF1A1 可與病毒相互作用［15-16］，推測其可能是直接靶向病毒。因此，關(guān)于eEF1A1 對病毒的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究首次提出eEF1A1 影響DNA病毒復(fù)制，也可影響RNA 病毒復(fù)制，為新型廣譜抗病毒藥物的研發(fā)提供了新思路?；谝种芿EF1A1 對Poly（I：C）或HT-DNA 刺激的天然免疫分子無影響，提示eEF1A1 可能不參與胞內(nèi)核酸識別的天然免疫，可能會通過其他機(jī)制幫助病毒進(jìn)行免疫逃逸，為宿主免疫和病毒逃逸的研究提供基礎(chǔ)。