崔霞＊，何微＊，肖智勇，王瑩，劉峰，周文霞

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，國家安全特需藥品全國重點實驗室，北京 100850）

血管主要由內(nèi)皮細胞、壁細胞（周細胞和平滑肌細胞）和基底膜構(gòu)成。然而，腫瘤組織中的血管具有結(jié)構(gòu)和功能異質(zhì)性的特點，表現(xiàn)為壁細胞覆蓋差和基底膜結(jié)構(gòu)異常等表型。異常的腫瘤血管會導(dǎo)致不利于免疫細胞“工作”的微環(huán)境（如低氧和酸性環(huán)境），從而促進腫瘤進展和化療耐藥。研究表明，實體瘤體積超過2 mm3便需要腫瘤血管的支持［1］，腫瘤血管的產(chǎn)生是實體瘤的典型特征之一。在腫瘤生長過程中，脈管系統(tǒng)不僅供氧和營養(yǎng)，還清除腫瘤組織中產(chǎn)生的二氧化碳和代謝物。此外，腫瘤脈管系統(tǒng)還為腫瘤遠處轉(zhuǎn)移提供輸運途徑。因此，腫瘤血管在腫瘤的生長、增殖和轉(zhuǎn)移中起重要作用，已被認為是腫瘤治療的有希望的靶標。

目前針對腫瘤血管治療的方法主要包括新生血管抑制劑和腫瘤血管破壞劑。新生血管抑制劑選擇性作用于血管形成過程中的血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor receptor，VEGF）和成纖維細胞生長因子等酪氨酸激酶受體，抑制腫瘤血管生長，減少腫瘤內(nèi)部血供和氧供，導(dǎo)致腫瘤細胞壞死。蘇尼替尼（sunitinib）是首個獲得美國FDA 批準的VEGF 受體抑制劑，用于胃腸間質(zhì)瘤、腎細胞癌和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤等腫瘤的治療［2-4］。然而，臨床數(shù)據(jù)表明，蘇尼替尼治療9～12個月后，大部分癌癥患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移［5］，其導(dǎo)致的低氧微環(huán)境可能是引發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要原因之一［6-8］。

與新生血管抑制劑不同，腫瘤血管破壞劑利用腫瘤血管和正常組織血管之間的差別，選擇性破壞腫瘤血管系統(tǒng)，現(xiàn)已成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點。當前臨床試驗中典型的小分子血管破壞劑之一，黃酮類腫瘤血管破壞劑5，6-二甲基黃嘌呤-4-乙酸（5，6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，DMXAA），可選擇性靶向腫瘤血管內(nèi)皮，破壞腫瘤血管，切斷血供，導(dǎo)致腫瘤細胞缺血壞死［9-10］。大量研究表明，DMXAA 可減輕小鼠乳腺癌［11］和結(jié)腸癌［12］等多種腫瘤轉(zhuǎn)移，在臨床試驗中對非小細胞肺癌、宮頸癌和前列腺癌等繼發(fā)性轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用［13-14］，但其作用機制尚不明確。

因此，本研究制備了小鼠Lewis 肺癌（Lewis lung cancer，LLC）異位移植瘤小鼠模型和轉(zhuǎn)移型LLC 小鼠模型，研究DMXAA 對LLC 增殖、轉(zhuǎn)移及對腫瘤血管結(jié)構(gòu)和腫瘤微環(huán)境的影響，并與新生血管抑制劑蘇尼替尼進行比較，為深入了解腫瘤血管破壞劑DMXAA抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用及其機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

DMXAA（批號：S1537）和蘇尼替尼（批號：1042），美國Selleckchem 公司；小鼠抗小鼠血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1（platelet/endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）單克隆抗體（批號：sc-376764）和兔抗小鼠周細胞α 平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）多克隆抗體（批號：sc-32251），美國Santa Cruz Biotechnology 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 抗體（批號：ZB-2301）和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號：ZB-2305），中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；酪酰胺信號放大（tyramide signal amplification，TSA）試劑盒（批號：NEL744001KT），美國perkinelmer 公司；低氧熒光探針哌莫硝唑（pimonidazole）試劑盒（HypoxyprobeTM RedAPC kit）（批號：HP2-100kit），美國Hypoxyprobe公司。

KLCZ-1220A 超凈工作臺，中國北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；3K15 高速離心機，德國Sigma公司；HF-90 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，上海Heal force公司；Milli-Q 純水機，美國Millipore公司；DM4000B正置熒光顯微鏡，德國Leica 公司；EVOS XL Core倒置顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；IVIS Spectrum小動物活體成像系統(tǒng)，美國Caliper公司。

1.2 細胞和細胞培養(yǎng)

LLC 細胞來源于中國科學(xué)院上海細胞庫，用含10%滅活胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。表達熒光素酶的LLC 細胞（LLCLuc）為軍事醫(yī)學(xué)研究院衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所詹林盛研究員實驗室惠贈。

1.3 實驗動物

SPF級雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重16～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001，飼養(yǎng)溫度23～27 ℃，濕度50%～60%，每12 h 明暗交替，自由攝食飲水。實驗中所有動物的處理均符合軍事醫(yī)學(xué)研究院倫理審查委員會的要求，倫理審批號（IACUC-DWZX-2022-78）。

1.4 LLC異位移植瘤小鼠模型的制備和分組

C57/BL6 小鼠實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。取LLC細胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，制備無血清單細胞懸液（4×109L-1），無菌條件下于小鼠右側(cè)腋窩sc 接種細胞懸液（100 μL），制備小鼠LLC 異位移植瘤模型。

待移植瘤體積達約200 mm3時，將15只模型小鼠隨機分為3 組：模型組（含1% DMSO 的生理鹽水，ip，2天1次）、模型+蘇尼替尼組（30 mg·kg-1，ip，2天1 次）和模型+DMXAA 組（25 mg·kg-1，ip，給藥1次）（圖1A）［15-17］。每隔1 天測量移植瘤體積和小鼠體重，移植瘤體積（mm3）=長徑（mm）×短徑2（mm）×0.5，繪制移植瘤體積生長曲線和小鼠體重變化曲線。

待移植瘤體積達約200 mm3時，將30只模型小鼠隨機分為3 組，每組10 只，分組及給藥方法同上，分別于給藥后2 和5 d，每組處死5 只小鼠，每只小鼠處死前1 h 尾靜脈注射低氧探針哌莫硝唑（60 mg·kg-1）。處死后剝離瘤體稱重，每組取瘤體固定于4%多聚甲醛中備用，后期將進行CD31 和SMA 免疫熒光染色以及哌莫硝唑免疫熒光染色，詳見1.6和1.7。

1.5 轉(zhuǎn)移型LLC小鼠模型的制備和分組

將LLC-Luc細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，制備無血清單細胞懸液（4×109L-1），將細胞懸液（100 μL）經(jīng)尾部靜脈注射于小鼠體內(nèi)，建立轉(zhuǎn)移型LLC 小鼠模型。

將24 只模型小鼠隨機分為3 組：模型組（含1% DMSO 的生理鹽水，ip，1 周2 次）、模型+蘇尼替尼組（60 mg·kg-1，ip，1 周2 次）及模型+DMXAA 組（25 mg·kg-1，ip，給藥1 次）（圖2A）［18-20］。分別于給藥后2 和5 周，用小動物活體成像系統(tǒng)（IVIS Spectrum）觀察小鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移，并進行熒光定量分析。觀測前將小鼠置于動物氣體麻醉機的麻醉盒，用異氟烷誘導(dǎo)麻醉，然后迅速將已麻醉小鼠腹部朝上置于小動物活體成像系統(tǒng)曝光成像。

1.6 免疫熒光染色檢測移植瘤組織中血管結(jié)構(gòu)

取1.4 制備的移植瘤組織制備石蠟切片，依次經(jīng)脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)和封閉，加入一抗〔CD31（1∶1000）和α-SMA（1∶500）〕4 ℃孵育過夜；TBST清洗2 次，加入二抗〔山羊抗小鼠IgG（1∶1000），山羊抗兔IgG（1∶1000）〕室溫孵育1 h；TBST 清洗2 次，加入TSA-FITC和TSA-CY3室溫孵育15 min；TBST 清洗3 次，最后用抗熒光淬滅封片液（含DAPI）封片，用熒光顯微鏡拍照，Image pro plus 軟件分析熒光強度。 α-SMA/CD31 熒光強度的比值表示周細胞覆蓋率。

1.7 哌莫硝唑檢測移植瘤組織低氧程度

哌莫硝唑可以共價結(jié)合低氧細胞的含巰基蛋白質(zhì)［21］并發(fā)出綠色熒光［22］，是動物和人類組織低氧標記物，常用于腫瘤低氧狀態(tài)的定位和定量檢測［23］。取1.4 制備的移植瘤組織進行免疫熒光染色：加入FITC 偶聯(lián)的探針抗體，4 ℃孵育過夜；TBST 清洗3 次，用抗熒光淬滅封片液（含DAPI）封片。用熒光顯微鏡拍照，cellSens1.13 軟件分析移植瘤組織低氧程度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較采用One-way ANOVA，組間兩兩比較采用DunnettT檢驗，其中腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，組間兩兩比較采用Kruskal-Wallis 檢驗。不同時間點各組間比較采用Two-way ANOVA 結(jié)合Newman-Keuls檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DMXAA抑制小鼠LLC移植瘤生長

與模型組相比，模型+蘇尼替尼組小鼠移植瘤體積從給藥后12 d 開始顯著縮?。≒＜0.05），而模型+DMXAA 組則從給藥后6 d 開始顯著縮?。≒＜0.01）（圖1B）；與模型組相比，模型+蘇尼替尼組瘤重從給藥后5 d開始減?。≒＜0.05），而模型+DMXAA組則在給藥后2 d 開始減小（P＜0.01）（圖1D）。同時，與模型組相比，模型+蘇尼替尼組小鼠體重明顯下降（P＜0.05），而模型+DMXAA 組則無顯著變化（圖1C）。以上表明，DMXAA 較蘇尼替尼起效更快，毒性更小。

2.2 DMXAA抑制小鼠體內(nèi)的LLC轉(zhuǎn)移

圖2B 所示，模型組小鼠給藥后2周出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，5 周腫瘤幾乎占滿整個肺部，甚至轉(zhuǎn)移到下腹部。給藥后2和5周，與模型組相比，模型+蘇尼替尼組熒光強度無顯著差異，表明蘇尼替尼未抑制LLC轉(zhuǎn)移；與模型組相比，模型+DMXAA組熒光強度在給藥后2 和5 周均顯著降低（P＜0.01），表明DMXAA可以抑制LLC轉(zhuǎn)移（圖2C，2D）。

Fig.2 DMXAA inhibits tumor metastasis in mouse model of metastatic LLC. C57BL/6 mice were injected with 4x106 LLC cells into the tail vein. The mouse model of metastatic LLC was randomly divided into 3 groups: model group [physiological saline containing 1% DMSO,ip,twice a week], model+sunitinib group [60 mg·kg-1,ip, twice a week] , and model+DMXAA group [25 mg·kg-1,ip,once]. Tumor metastasis were measured 2 and 5 weeks after administration. A：experimental metastasis assay scheme based on mouse model of metastatic LLC; B: representative images of bioluminescence intensity 2 and 5 weeks after administration；C was the semiquantitative result of B.±s，n=7-8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01,compared with model group.

2.3 DMXAA促進LLC血管正?；?/h3>

圖3所示，與模型組相比，給藥后5 d，模型+DMXAA 組和模型+蘇尼替尼組移植瘤組織中周細胞覆蓋率均顯著增加（P＜0.05），表明DMXAA 和蘇尼替尼均能誘導(dǎo)LLC血管正?；?。

Fig.3 DMXAA induces LLC vasculature normalization. See Fig.1 for the mouse treatment.A：representative images of immunofluorescence staining of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1（CD31）and α-smooth muscle actin（α-SMA）at 2 and 5 d after administration. Red：α-SMA；Green：CD31. B：statistical analysis of immunofluorescence staining of α-SMA/CD31.±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with model group.

2.4 DMXAA改善LLC移植瘤組織低氧微環(huán)境

低氧探針哌莫硝唑染色結(jié)果顯示，與模型組相比，給藥后5 d，模型+蘇尼替尼組移植瘤組織低氧面積無明顯變化，而模型+DMXAA 組顯著降低（P＜0.01）（圖4），表明DMXAA能顯著改善移植瘤組織低氧微環(huán)境，而蘇尼替尼無此作用，這可能是二者抗腫瘤轉(zhuǎn)移存在差異的重要原因之一。

Fig.4 DMXAA improves LLC tumor hypoxic microenvironment. See Fig.1 for the mouse treatment. Tumor hypoxia was detected using hypoxyprobe（pimonidazole）staining. A：representative images of hypoxyprobe staining at 2 and 5 d after administration；B: the semiquantitative result of A.±s，n=5.＊＊P＜0.01,compared with model group.

3 討論

DMXAA 在針對非小細胞肺癌的臨床試驗中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，能有效提高患者的客觀緩解率（objective response rate）和中位生存期［24-27］，但其作用機制尚不明確。本研究表明，DMXAA 顯著抑制小鼠LLC皮下移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移。DMXAA提高移植瘤組織血管表面周細胞覆蓋率，使腫瘤血管的表型趨于正常化，同時DMXAA 顯著改善移植瘤組織低氧微環(huán)境，這可能是其抑制LLC 轉(zhuǎn)移的重要原因之一。

腫瘤血管與正常血管不同，具有扭曲、膨脹、囊狀擴張和血流局部停滯等多種結(jié)構(gòu)和功能的異常。目前，評估腫瘤血管的指標主要包括血管形態(tài)、微血管密度、周細胞覆蓋率、血流灌注和血管通透性等。CD31 屬于免疫球蛋白超家族成員，表達于血管內(nèi)皮細胞表面，是新生血管的標志物，被用于評估腫瘤微血管密度和血管生成［28］。α-SMA 是周細胞的標志物，與血管成熟相關(guān)［29］。周細胞是環(huán)繞血管內(nèi)皮管的輔助細胞，周細胞與內(nèi)皮細胞相互作用調(diào)節(jié)血管功能。腫瘤細胞通過與周細胞相互作用，逃避免疫監(jiān)視并侵入周圍組織和血管［30］。此外，周細胞還可以分泌促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的因子，如基質(zhì)金屬蛋白酶，從而破壞基底膜和組織結(jié)構(gòu)，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移［31］。α-SMA/CD31 的比值可作為反映腫瘤組織中血管結(jié)構(gòu)的指標［32］，α-SMA/CD31 比值升高表示腫瘤血管出現(xiàn)正?；瘍A向［33］。正?；哪[瘤血管可以幫助藥物和氧更有效地輸送到腫瘤內(nèi)部，改善腫瘤患者對抗腫瘤治療的敏感性，抑制腫瘤生長,減少腫瘤轉(zhuǎn)移［30，34-35］。大量研究表明，蘇尼替尼治療肺鱗狀細胞癌、乳腺癌等腫瘤后2～7 d，可使腫瘤血管成熟度提高，腫瘤微血管密度降低，促進腫瘤血管正?；?6-37］。本研究表明，蘇尼替尼可使LLC 移植瘤中α-SMA/CD31比值升高，腫瘤血管出現(xiàn)正?；瘍A向，與文獻報道一致?？灯杖鹜×姿徕c（combretastatin A4-phosphate，CA4P）是一種強有力的腫瘤血管破壞劑。與DMXAA 類似，CA4P 對腫瘤生長過程中新形成血管的未成熟內(nèi)皮細胞有特異性抑制作用，而對正常組織血管成熟內(nèi)皮細胞無作用［38］。研究表明，CA4P 在子宮內(nèi)膜異位癥患者的治療中可誘導(dǎo)血管正?；?9］，這主要與腫瘤血管破壞劑主要破壞瘤內(nèi)幼稚的脈管系統(tǒng)，相對提高了瘤內(nèi)成熟血管的比例有關(guān)［40］。本研究表明，DMXAA也可通過增加周細胞覆蓋率提高血管成熟度，并誘導(dǎo)腫瘤血管正?；崾敬龠M血管正?；前邢蚰[瘤血管治療的重要途徑。

腫瘤低氧是誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一［41-42］。在低氧條件下，腫瘤細胞更易從原發(fā)部位擴散侵入鄰近組織，進而實現(xiàn)遠端轉(zhuǎn)移［43］，而緩解腫瘤低氧微環(huán)境可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［44-45］。為進一步闡釋DMXAA 顯著抑制小鼠LLC 轉(zhuǎn)移的作用機制，本研究檢測了DMXAA 對小鼠移植瘤組織低氧的影響。結(jié)果表明，DMXAA給藥后2 d移植瘤組織低氧面積有上升趨勢，5 d 時低氧面積顯著降低，表明DMXAA 給藥后在短期內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)大量血管破壞，加重腫瘤缺血低氧；后期腫瘤壞死消退耗氧量減少并伴隨腫瘤內(nèi)血管重構(gòu)，腫瘤低氧緩解［46］。這一結(jié)果與文獻報道中DMXAA 對腫瘤低氧的雙向影響基本一致［46-49］，提示DMXAA 對腫瘤低氧的影響可能與藥物暴露后腫瘤血管的早期破壞及隨后的正常化過程密切相關(guān)。目前關(guān)于蘇尼替尼對腫瘤組織低氧影響的研究還比較有限，但有一些研究表明蘇尼替尼可能會影響腫瘤組織的血供和氧供，從而改變腫瘤組織的低氧狀態(tài)［50］。本研究表明，蘇尼替尼給藥后2 d 低氧面積無明顯變化，5 d 時低氧面積有上升趨勢，可能是蘇尼替尼抑制血管新生的起效時間比較長，因此短期內(nèi)低氧程度與模型相比無顯著差異。而隨著蘇尼替尼開始抑制血管生成，雖然此時有腫瘤消退、耗氧量減少以及血管的正?；徑獾脱?，但腫瘤血管減少誘發(fā)的低氧更明顯，因此蘇尼替尼治療5 d 時腫瘤低氧有上升趨勢，繼續(xù)延長觀察時間可能更有利于獲得關(guān)于蘇尼替尼對移植瘤組織低氧影響的確切數(shù)據(jù)。DMXAA 在促進腫瘤組織血管正?；⒕徑饽[瘤組織低氧的同時顯著抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，而蘇尼替尼雖然也促進血管正常化，但對腫瘤低氧和腫瘤轉(zhuǎn)移均有促進的趨勢，提示DMXAA 與蘇尼替尼對腫瘤微環(huán)境低氧的不同影響可能是二者對腫瘤轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出差異效應(yīng)的原因之一。

綜上，腫瘤血管破壞劑DMXAA 抑制小鼠LLC生長和轉(zhuǎn)移，促進腫瘤組織血管正常化并顯著緩解腫瘤組織低氧狀態(tài)。在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和改善腫瘤低氧方面，DMXAA 與新生血管抑制劑蘇尼替尼相比具有明顯特色和優(yōu)勢。本研究為深入理解腫瘤血管破壞劑DMXAA 的抗腫瘤效應(yīng)和作用機制提供了實驗依據(jù)，為靶向腫瘤血管的藥物研究提供新的思路。