李明舉 楊小臺 趙瑋 戚卿業(yè) 由佳

摘? 要：隨著飼料中禁止添加除中草藥外的藥物飼料添加劑，畜禽生產(chǎn)中消化道和呼吸道疾病的發(fā)病率普遍升高。藥物投入增加和抗生素替代產(chǎn)品價格較高，導(dǎo)致飼養(yǎng)成本增加的問題凸顯，高效綠色抗生素替代產(chǎn)品的尋找已成為畜禽業(yè)關(guān)注的重點。本文通過對雞場中分離到的大腸桿菌和沙門菌進(jìn)行復(fù)合酸化劑體外抑菌試驗，研究復(fù)合酸化劑對常見細(xì)菌的殺滅和抑制效果，為在養(yǎng)殖業(yè)中的合理使用提供參考。

關(guān)鍵詞：復(fù)合酸化劑；大腸桿菌；沙門菌；最小抑菌濃度；抑菌效果

中圖分類號：S854.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2024）01-0080-04

酸化劑可作為添加劑用于飼料中，養(yǎng)殖場常用的酸化劑主要有檸檬酸、延胡索酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、苯甲酸及其鹽類，有的還混有適量的蘋果酸、琥珀酸、山梨酸和磷酸。由一種有機酸組成的酸化劑（簡稱“單一酸化劑”）存在功能簡單、添加量大、腐蝕性強、適口性差等缺點；由多種有機酸組成的復(fù)合酸化劑，能夠降低畜禽胃腸道內(nèi)腔的pH，對大腸桿菌、沙門菌、葡萄球菌和梭菌等細(xì)菌具有殺滅和抑制作用，同時，還能夠調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和平衡，促進(jìn)畜禽的生長和消化吸收，提高生產(chǎn)性能。因此，與單一酸化劑相比，復(fù)合酸化劑具有更多的優(yōu)點。本研究將從病死雞上分離到的大腸桿菌和沙門菌菌株復(fù)蘇，通過測定兩種復(fù)合酸化劑的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），比較兩種復(fù)合酸化劑對大腸桿菌和沙門菌的體外抑菌效果。

1? 材料

1.1 試驗菌株和復(fù)合酸化劑

試驗菌株為從雞場病死雞上分離的大腸桿菌和沙門菌。復(fù)合酸化劑有A、B兩種。

1.2 試驗材料

無菌試管和三角燒瓶，營養(yǎng)瓊脂平板，營養(yǎng)肉湯，2倍濃縮營養(yǎng)肉湯，8×100 ?L排槍，200 ?L移液器，1 mL移液器，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，滅菌水，無菌的0.22 ?m過濾器，分光光度計，酶標(biāo)儀。

2? 方法

2.1 菌株復(fù)蘇

取大腸桿菌、沙門菌凍存液各0.1 mL，分別接種到含有5 mL營養(yǎng)肉湯的試管中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)6 h。

2.2 菌液稀釋

用分光光度計將菌液中的細(xì)菌數(shù)調(diào)整至1.5×10⁸CFU/mL。用營養(yǎng)肉湯將調(diào)整好的菌液稀釋1 000倍，用于測定MIC。

2.3 酸化劑預(yù)處理

取10 mL的復(fù)合酸化劑A和復(fù)合酸化劑B，分別加入10 mL的2倍濃縮營養(yǎng)肉湯，混勻，備用。

2.4 最小抑菌濃度（MIC）測定^[1]

2.4.1 加入營養(yǎng)肉湯

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔加入100 ?L的營養(yǎng)肉湯。

2.4.2 加受試溶液并梯度稀釋

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板前4行的第2列（A2，B2，C2，D2）加入100 ?L預(yù)處理的復(fù)合酸化劑A，向該培養(yǎng)板后4行的第2列（E2，F(xiàn)2，G2，H2）加入100 ?L預(yù)處理的復(fù)合酸化劑B，用排槍混勻后吸取100 ?L到第3列中，混勻，再從第? 3列中吸取100 ?L到第4列中，如此依次稀釋第11列，從第11列吸取100 ?L溶液棄掉。

2.4.3 加稀釋好的菌液

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板第1、2、5和6行，自第12孔向第2孔加入100 ?L大腸桿菌液（細(xì)菌數(shù)為1.5×10⁵CFU/mL），向該培養(yǎng)板第3、4、7和8行，自第12孔向第2孔加入100 ?L沙門菌液（細(xì)菌數(shù)為1.5×10⁵CFU/mL）。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板第1列再加入100 ?L的營養(yǎng)肉湯，即第1列只有200 ?L的營養(yǎng)肉湯，不加酸化劑和菌液，作為陰性對照；細(xì)胞培養(yǎng)板第12列只有營養(yǎng)肉湯和菌液，不加酸化劑，作為陽性對照。

2.4.4 細(xì)菌培養(yǎng)

將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置振蕩器上輕輕振蕩混勻，注意不要把孔內(nèi)液體振出，然后放入? ?37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4.5 讀取結(jié)果

分別在培養(yǎng)18 h和30 h讀取MIC結(jié)果，自右向左完全不長菌的第1孔為受試溶液的MIC?？蓪?6孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀中，測定? ? 630 nm時的吸光度（optical density，OD），以O(shè)D630 nm值與200 ?L營養(yǎng)肉湯（陰性對照）一致的孔作為完全不長菌的陰性孔（圖1、圖2）。

3? 結(jié)果及分析

由表1得知，復(fù)合酸化劑A和B對大腸桿菌和沙門菌均具有抑制細(xì)菌生長的作用，培養(yǎng)18 h 后MIC結(jié)果顯示，試驗中選用的兩種復(fù)合酸化劑的最低抑菌濃度相同，均為0.2％（體積分?jǐn)?shù)）。由表2得知，隨著時間的增加，復(fù)合酸化劑A和B對兩種細(xì)菌的抑菌作用逐漸減弱，細(xì)菌開始繁殖；從渾濁度來看，復(fù)合酸化劑A和B對大腸桿菌的抑菌作用稍好于對沙門菌的，但相互間差異不大；復(fù)合酸化劑A的抑菌效果稍好于復(fù)合酸化劑B的，但差異不大。

4? 討論

4.1 酸化劑在抑制細(xì)菌方面的研究

葉幫同等^[2]指出，酸化劑的作用機理主要是破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，干擾細(xì)菌酶合成，抑制細(xì)菌內(nèi)酶的活性，影響致病菌DNA的復(fù)制，大腸桿菌、沙門菌和梭狀芽孢桿菌在腸道內(nèi)生長的最適pH分別為6.0～8.0、6.8～7.2和6.0～7.5，而乳酸桿菌生長的最適pH為5.4～6.4，酸化劑可以將腸道內(nèi)腔pH降低到6.0以下，從而抑制有害微生物的繁殖，同時促進(jìn)有益菌的增殖。雷燕等^[3]在同等酸度條件下比較了單一酸化劑及復(fù)合酸化劑的體外抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合酸化劑的抑菌效果優(yōu)于單一酸化劑的。嚴(yán)欣茹等^[4]研究了復(fù)合酸化劑和抗生素對大腸桿菌、沙門菌等常見致病菌的體外抑菌效果，發(fā)現(xiàn)復(fù)合酸化劑對沙門菌和大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于抗生素的，建議在日糧中添加適量的復(fù)合酸化劑。

4.2 酸化劑的應(yīng)用前景

酸化劑作為一種無殘留、無耐藥性、無毒副作用的產(chǎn)品，具有調(diào)節(jié)動物機體腸道內(nèi)腔pH、抑菌殺菌、提高酶活性、促進(jìn)禽畜生長以及改善機體免疫功能等作用，在畜禽飼養(yǎng)中越來越受到廣泛的關(guān)注。尤其是在蛋雞生產(chǎn)中，酸化劑可提高日糧蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，緩解應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的呼吸性堿中毒，調(diào)節(jié)因機體代謝加強而引發(fā)的鈣磷比例失調(diào)以及產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)的下降，因而在提高蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)方面具有重要作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 關(guān)飛，尤永君，安俊峰．三種酸化劑最小殺菌濃度（MBC）的測定[J]．中國動物保健，2015，17（4）：71-73.

[2] 葉幫同，李孟偉，陳清華．酸化劑的作用機理及應(yīng)用[J]．湖南飼料，2015（3）：38-40.

[3] 雷燕，李瀚林，曾凡坤，等．不同單一酸化劑及復(fù)合酸化劑體外抑菌能力比較研究[J]．現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2021（7）：28-31.

[4] 嚴(yán)欣茹，董璦榕，羅璋，等．磷酸復(fù)合型酸化劑及抗生素添加劑體外抑菌效果研究[J]．畜牧產(chǎn)業(yè)，2020（9）：65-70.

*通信作者：由佳（1982－ ），女，高級獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作