摘要：為促進東北春小麥抗性育種，利用與抗稈銹病基因Sr31連鎖的分子標記SCSS30.2和iag95，對300份東北春小麥抗稈銹病基因進行分子檢測及抗性分析。結果表明，在300份春小麥品種中，有8份小麥品種被檢測到含有iag95或SCSS30.2分子標記，含有抗稈銹病Sr31基因，而小麥品種農林45號中只鑒定到了含有iag95標記，鋼09-558中只鑒定到了含有SCSS30.2標記。通過ω-sec標記，發(fā)現9.67%的供試材料含有1BL/1RS易位系。其中，同時攜帶與抗性基因Sr31連鎖的兩個標記SCSS30.2和iag95的8份材料，均被檢測到含有1BL/1RS易位系。田間抗性鑒定進一步表明，被SCSS30.2檢測到的9個材料中，除黑春1號外，其余材料在田間均表現出了極強的抗病性。而僅被iag95標記檢測到的農林45號，對21C3CTHQM和34MKGQM兩類生理小種均表現為感病。本研究成功鑒定出攜帶Sr31基因及1BL/1RS易位系的小麥材料，可作為小麥抗病育種材料進一步利用。

關鍵詞：小麥；Sr31基因；分子標記；1BL/1RS易位系；田間抗病性

小麥是世界上最重要的糧食作物之一，占世界作物種植面積的1/5，能滿足人類提供日常所需的膳食營養(yǎng)需求［1-4］。在小麥各病害中，流行程度相同的條件下稈銹病造成的損失最大［5-7］。20世紀20年代至70年代，在我國東北春麥區(qū)共發(fā)生過9次小麥稈銹病大流行和1次中度流行，給小麥的生產帶來了極大的危害［8］。 為了解決這一難題，育種家們開始逐漸引入新的抗性資源來選育抗病小麥品種。然而，由于當時技術手段的限制，育種家主要依賴于田間表型鑒定，致使育種工作效率低，育種成效慢，且不能從分子角度解析東北春小麥品種的抗稈銹基因的分布和組成［8］。

近年來育種趨勢顯示，東北春小麥品種的遺傳基礎逐漸狹窄，類型單一［9］。這可能會導致小麥品種對新病害或新生理小種更加敏感，增加了病害爆發(fā)的風險［10］。在如今全球化和氣候變化的背景下［11］，隨著交通和貿易的增加，病原體可以快速地跨越大陸和國界，導致病原體的飛速傳播［12］。大面積種植不抗病的小麥品種，可能導致病害大面積發(fā)生和嚴重的產量損失。

現全球范圍內已經鑒定出了許多抗稈銹基因［13］。其中，Sr31基因分布廣泛，它源于栽培黑麥，并與小麥1BL/1RS易位系密切相關，已被廣泛用于小麥檢測和品種改良中［14］。這種易位系不僅提高了稈銹病抗性，而且也能提高小麥的產量和品質［15］。Sr31與條銹病抗性基因Yr9、葉銹病抗性基因Lr26、白粉病抗性基因Pm8存在連鎖關系［5，16-17］。20世紀70年代，含有Sr31的小麥在世界麥區(qū)推廣使用。但在1999年，首次發(fā)現了能夠克服Sr31抗性的稈銹菌小種Ug99［18］，并且該小種具有強大的變異能力，可侵染全球絕大部分小麥品種［19］。近年來，Ug99的分布已經從非洲東部擴展到亞洲，威脅著全球的小麥生產［20］。近年來針對Sr31基因的分子標記已經被相繼開發(fā)出來，為稈銹病基因的分子檢測以及抗性鑒定篩選提供了有效手段［21］。此外，東北春小麥材料中可能也含有Sr31基因［22］，因此，對東北春麥資源中Sr31的分子標記鑒定有助于掌握該基因的組成和分布，進而增強小麥的持久抗性，并降低小麥稈銹病爆發(fā)的風險［23］。

綜上所述，東北春麥區(qū)已育成眾多春小麥品種，在小麥生產過程中起到重要作用，但是東北春麥區(qū)小麥抗稈銹病基因和機理的相關報道較少，特別是Sr31基因對東北春麥抗稈銹的貢獻尚不清楚。為此，本研究選用300份東北春小麥代表性品種進行分子檢測和抗性分析，明確東北春麥區(qū)小麥抗稈銹病基因Sr31的組成和抗性，為春小麥抗性育種提供可靠的材料和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為東北春小麥代表性品種300份（附表1，詳見OSID碼），這些材料涵蓋了上世紀初到近年來推廣的有代表性品種，且地理分布范圍廣，遺傳背景清晰。陽性對照單抗基因系由黑龍江省農業(yè)科學院植物保護研究所提供，陰性對照選擇春小麥品種“克華”。對于田間表型抗性的鑒別，選擇了Little club作為易感品種進行對比。

同時，涉及到的小麥稈銹病小種包括21C3CTHTM和34MRGQM，它們最近20年內在我國小麥生產中都占據了主導地位。

1.2 方法

1.2.1 引物選擇

參照公開報道的小麥稈銹病抗性基因相關的分子標記進行選擇，進而確認其實際應用效果。對所選材料進行PCR驗證，所有的特異性引物由上海生工生物技術有限公司提供（表1）。

1.2.2 DNA提取及PCR反應

小麥幼苗生長至10 d時，取其葉片2 g，利用CTAB法提取DNA［24］。使用TaKaRa品牌的Taq DNA聚合酶展開PCR擴增。擴增體系設定如下：DNA樣品 50 ng，10×PCR緩沖溶液 2 μL，2.5" mmol·L-1 dNTPs混合液1.6 μL，10 μmol·L-1的引物0.8 μmol·L-1，Taq DNA聚合酶0.16 μL，再加去離子水至20 μL。具體反應條件參考各引物來源文獻［25-27］。擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，緩沖液體系為1×TAE溶液，140 V電壓電泳40 min，溴化乙錠染色。

1.2.3 田間抗性鑒定

在沈陽農業(yè)大學植物保護學院的試驗田內進行成株階段的抗性評估。試驗布局采用雙列模式，列間和行間距各為25 cm，每列長度為100 cm。在布局中，每個品種單獨播種于一行中，每隔10行設置一行易感品種作為對照。在小麥返青拔節(jié)階段開始接種，接種前，對實驗地進行噴水處理，以提高濕度，并在傍晚進行接種。首先，用0.05%的吐溫20溶液噴濕小麥葉片，然后利用噴粉器對葉片進行夏孢子噴粉接種（夏孢子與滑石粉的比例為1∶30）。接種后，用塑料薄膜覆蓋葉片，以保持濕度，持續(xù)14 h。

抗性評估依據Roelfs等［28］的分級準則和Cobb改良量表來評估病害嚴重程度。銹菌孢子堆占葉面積的0.37%對應于1%的病害嚴重度，病害等級分為1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%共12個等級［29］。當對照品種出現明顯的病害后（接種后的第14天），進行首次病害狀況調查，之后每隔5 d進行1次，共進行3次調查。最終的評估結果以最高的反應類型和病害嚴重程度為準。0表示免疫性，R表示抗病性，MR指示中等的抗病性，MS表示中度易感，S則代表易感。

2 結果與分析

2.1 Sr31和1BL/1RS易位系的分子標記鑒定

利用與抗性基因Sr31連鎖的兩個標記SCSS30.2和iag95對供試材料進行檢測。由圖1可以看出，SCSS30.2和iag95標記在含有抗性基因Sr31的陽性材料中分別可擴增出576 bp和1 100 bp的PCR片段。在檢測的300份材料中，有8個品種中同時存在iag95和SCSS30.2，這8個材料分別為北麥1號、北麥6號、克春5號、克春8號、克春9號、黑春1號、新曙光8號和吉春1004。而農林45號中只鑒定到了iag95，鋼09-558中只鑒定到了SCSS30.2。此外，本研究用ω-sec鑒定1BL/1RS易位系的存在［30］。結果表明，有29份材料鑒定到了ω-sec標記，意味著它們含有1BL/1RS易位系。8個同時存在iag95和SCSS30.2的品種也鑒定到了1BL/1RS易位系，而農林45號和鋼09-558沒有鑒定到1BL/1RS易位系。

2.2 田間抗病鑒定

本研究利用小麥稈銹病的典型癥狀進行田間抗病鑒定，結果表明，陰性對照品種Little club表現為易感（S）（圖2）。在標記SCSS30.2鑒定到的9個材料中：北麥1號、北麥6號、克春5號、克春8號、克春9號、黑春1號、新曙光8號、吉春1004和鋼09-558表現出極強的田間抗病性，只有黑春1號的嚴重度和普遍率為5%，其他材料都表現為免疫。而只被標記iag95檢測到的材料農林45號在21C3CTHQM和34MKGQM兩類小種抗性鑒定中都表現為感?。ū?）。

由表3可知，在300份材料田間抗性統計中，利用21C3CTHQM和34MKGQM兩個生理小種分別檢測到了5個抗性等級的材料?？剐缘燃墳槊庖撸?）的材料在兩個小種的檢測中都達到60%以上，分別為64.67%和69.00%；抗病（R）材料分別為23.00%和19.33%；中抗（MR）比例分別為4.33%和4.00%。中感（MS）比例分別為7.00%和6.33%；感?。⊿）的比例分別為1.00%和1.33%。在兩個生理小種的檢測中，不同抗性等級的材料數量分布相似，都是免疫材料數量最多，其次是抗?。≧），最少的為感?。⊿）。兩個生理小種檢測結果相同的材料一共有266份，占全部材料的88.67%。其中，對兩個小種都為免疫表現的材料為188份。

2.3 含有Sr31材料的亞群分析

有研究者在2021年對本研究所用群體進行遺傳分析，并利用55K SNP芯片的基因數據進行群體結構分析，結果表明，東北春麥主要資源的群體可分為3個亞群［32］。農林45號和吉春1004屬于第三亞群，新曙光8號屬于第一亞群，其他材料都屬于第二亞群（表3）。即第二亞群中包括更多攜帶Sr31抗病基因的品種，該亞群包含75份品種，主要來自于1990年到2010年在黑龍江省種植的品種，如北麥1號、克春9號、北麥6號和克春8號；第一亞群包含126個品種，主要來自于1950年到1980年在黑龍江省種植的品種，如克紅、克旱8號、克堅和新曙光5號；第三亞群包含50份品種，主要來自吉林、美國、加拿大和日本。

3 討論

3.1 Sr31的抗性表現和分布

在300份東北春麥資源中，有188份材料對兩種稈銹病生理小種均表現免疫，占全部材料62.67%（表3）。但是鑒定到含Sr31基因的材料僅有8個，說明Sr31不是東北春麥區(qū)主效抗性基因，該群體中還存在其他抗稈銹病基因，只有進行更多的抗性基因檢測，才能更好地分析東北春小麥的抗病基因組成。

在農林45號的鑒定過程中，僅檢測到分子標記iag95的存在，然而，該材料對主流稈銹病生理小種均表現為感?。?3］。一般而言，Sr31被認為對小麥稈銹病具有顯著的抗病效果［34］。因此農林45號有可能并未攜帶抗病基因Sr31，但攜帶了與Sr31連鎖的標記iag95。

Sr31抗性基因廣泛存在于世界上的小麥品種中，但是其不抗Ug99［18，35］，為了避免通過傳統抗性育種得到的抗稈銹栽培品種中主效抗性基因為Sr31，世界范圍內開展了眾多對Sr31的分子標記檢測。Pretorius等［36］在65個南非小麥品種中檢測到5個品種含有Sr31基因。Purnhauser等［37］利用分子標記檢測對匈牙利220個小麥品種進行檢測，發(fā)現24.1%的小麥品種含有Sr31。陳萬權等［38-39］推導出49個來自17個國家的小麥種質資源中有11個品系攜帶Sr31，44個江蘇主要小麥品種中的9個品種攜帶Sr31。李丹丹等［40］在2019年對黑龍江省83份小麥品種的檢測中發(fā)現，6份小麥品種可能含有Sr31。與前人研究結果相似，本研究中鑒定到8個可能含有Sr31的材料。這表明東北春麥資源抗稈銹Sr31基因相對其他地區(qū)比例較少。此外，還發(fā)現包含Sr31基因的樣本幾乎全部來源于1990年到2010年在黑龍江省培育并廣泛種植的品種。相對地，從其他地區(qū)引進的品種以及1950年到1980年在黑龍江省種植的小麥品種中，Sr31基因出現頻率極低。表明，Sr31基因可能是在20世紀末到21世紀初的黑龍江小麥育種活動中逐漸被引入和固定的。

3.2 東北春麥資源中存在Sr31較少的原因

抗稈銹病基因Sr31位于1BL/1RS易位系上［41］，1BL/1RS易位系攜帶了許多抗病和豐產基因［42-44］。研究表明，1BL/1RS易位系對條銹病、葉銹病和赤霉病具有較高的抗性［45］。1BL/1RS易位系也可以提高小麥的千粒重、穗粒數和籽粒重，從而提高產量［46］。本研究中鑒定到可能含有Sr31的8份材料全部存在1BL/1RS易位系，但是全部材料中有21份鑒定出1BL/1RS易位系卻不含Sr31。當小麥品種含有1BL/1RS易位系時，它通常也會攜帶Sr31基因，提供對稈銹病的抗性。然而，即使小麥攜帶Sr31基因，也不一定表示它具有完整的1BL/1RS 易位系。Lukaszewski等［47］描述了一種技術，可以通過誘導同源重組來操作1RS/1BL易位系轉位，從而只轉移與Sr31相關的特定1RS區(qū)段，而不是整個1RS染色體臂。

中國東北春麥資源中，部分材料存在1BL/1RS易位系但不存在Sr31，這可能由以下幾個原因造成，（1）選擇壓力：上世紀含有抗稈銹基因的材料Yaroslav等引入后，東北春小麥主要面臨的是非稈銹病的病害或其他生物和非生物壓力［8］，這使得育種者主要關注于改良其他性狀，而不是具有Sr31抗性的品種。這意味著1BL/1RS易位系可能因為其他與它相關的有益性狀被選入，而不是因為其攜帶的Sr31基因。（2）遺傳隨機性：隨著時間的推移，某些遺傳變異可能會在群體中丟失，這是一個隨機的過程，Sr31在這一過程中在大部分品種中丟失了。

3.3 1BL/1RS易位系和Sr31鑒定結果的應用

ω-secalin蛋白對小麥筋性的負向調控已逐漸得到學界的認識。有研究明確指出，在1BL/1RS易位系的小麥中，ω-sec與較低的筋性和較差的面包制作品質緊密相關［48-49］。本研究顯示，東北春麥資源中9.67%的品種可能存在ω-secalin蛋白的表達。通過篩選不含ω-secalin但含有1BL/1RS易位系上優(yōu)良抗病基因的小麥品種，可以在保證其抗病性基礎上提高加工品質。此外，本研究同時檢測到兩個分子標記的小麥品種北麥1號、北麥6號、克春5號、克春8號、克春9號、黑春1號、新曙光8號和吉春1004含有Sr31抗稈銹基因，可以作為種質資源進行廣泛應用，這為提高東北春小麥抗病能力和產量提供了材料支撐。

4 結論

本研究對300份東北春小麥資源的抗稈銹基因進行了分子標記檢測和抗性鑒定。其中有8個品種中同時存在iag95和SCSS30.2，占全部品種的2.67%，表現出極強的田間抗病性。這8個材料分別為北麥1號、北麥6號、克春5號、克春8號、克春9號、黑春1號、新曙光8號和吉春1004。有9.67%的材料鑒定到了ω-sec標記，意味著它們可能含有1BL/1RS易位系。

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Molecular Detection and Resistance Analysis of the Stem Rust Resistance Gene Sr31 in Northeast Spring Wheat

TANG Jingquan1， LIU Wenlin1， SUN Yan1， YANG Shuping1， LI Yuyao2， SUN Dan1， WANG Xiangyu1， ZHANG Hongji1

Abstract：In order to identify the presence of the resistance gene Sr31 in wheat materials the linked molecular markers SCSS30.2 and iag95 were used and to further determine the existence of the 1BL/1RS translocation in these materials. Using the PCR method， target fragments of 576 bp and 1100 bp were successfully amplified from positive control materials with SCSS30.2 and iag95， respectively. Among the 300 tested wheat materials， 10 varieties were detected with either the iag95 or SCSS30.2 molecular markers， with eight varieties carrying both markers. Using the ω-sec marker， we identified 9.67%， of materials possessing the 1BL/1RS translocation. Notably， all 8 materials identified as possibly containing the Sr31 gene were found to carry the 1BL/1RS translocation. Field disease resistance evaluations further revealed that， of the nine materials detected with the SCSS30.2 marker， all except Heichun 1 demonstrated strong field resistance. In contrast， the Nonglin 45， detected only with the iag95 marker， displayed susceptibility to both 21C3CTHQM and 34MKGQM pathotypes. In conclusion， this research successfully identified wheat materials carrying the Sr31 gene and the 1BL/1RS translocation， offering valuable molecular tools and germplasm resources for wheat resistance breeding.

Keywords：wheat;Sr31 gene;molecular markers;1BL/1RS translocation;field disease resistance

收稿日期：2023-10-19

基金項目：黑龍江省農業(yè)科學院院級科研項目（2021YYYF003）；“十四五”重點研發(fā)計劃項目（2022YFD1200701）；核能開發(fā)科研項目（春小麥核輻射生物誘變新品種創(chuàng)制與示范）；黑龍江省外向型農業(yè)產業(yè)技術協同創(chuàng)新體系。

第一作者：唐婧泉（1995-），女，碩士，研究實習員，從事小麥遺傳育種研究。E-mail： tangjingquan2020@163.com。

通信作者：張宏紀（1969-），男，博士，研究員，從事小麥遺傳育種研究。E-mail： fumai@163.com。