曹查，朱作華，龔文兵，周映君，謝純良，彭源德

（中國農(nóng)業(yè)科學院 麻類研究所，湖南 長沙 410205）

芳基醇氧化酶是一種特殊的黃素過氧化物酶，具有廣泛的底物特性，能夠氧化非酚芳香醇類，包括苯甲基、萘基、苯丙烯醇和脂肪族的多不飽和醇等，生成相應的醛類物質(zhì)，醛類物質(zhì)再緩慢氧化成酸，在木質(zhì)素降解和芳香族污染物處理領(lǐng)域具有重要的應用價值[1-2]。酶的高效、大量表達是推動其應用的前提[3-5]。由于野生型真菌的木質(zhì)素降解酶合成效率普遍較低，且木質(zhì)素降解酶的合成常需要毒性芳香化合物誘導，致使發(fā)酵液后期的處理難度大、生產(chǎn)成本高且容易導致環(huán)境污染[6-8]。

分子生物學技術(shù)的高速發(fā)展能夠為木質(zhì)素降解酶遺傳物質(zhì)實現(xiàn)異源大量表達提供一定的基礎(chǔ)[9-11]。到目前為止，刺芹側(cè)耳（Pleurotuseryngii）原位表達系統(tǒng)尚未建立，在眾多表達體系中，巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）作為一種安全、高效的表達宿主，具有高密度培養(yǎng)和翻譯后修飾等優(yōu)點[12]。因此，將芳基醇氧化酶基因在畢赤酵母中表達可以促進該酶的實際工業(yè)化生產(chǎn)和應用。目前，P.eryngii芳基醇氧化酶基因在畢赤酵母表達系統(tǒng)中成功得到表達[13-14]。與原生真菌酶相比，異源重組表達的酶存在比活力、熱穩(wěn)定性和底物親和力降低的問題[5]。因此，如何提高異源表達芳基醇氧化酶的比活力和熱穩(wěn)定性等酶學性質(zhì)成為酶制劑制備過程中亟需解決的關(guān)鍵問題。

N-糖基化修飾能夠有效調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活力和穩(wěn)定性[15-17]。N-糖基化修飾還能夠使磷酸酶具有更強的抗胃蛋白酶降解能力[18]。Yang 等[19]通過對畢赤酵母表達根瘤菌脂肪酶的熱穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，含有更多N-聚糖的脂肪酶更具耐熱性。研究表明，4 種選定的漆酶經(jīng)糖苷內(nèi)切酶H 和N-糖酰胺酶F 對進行去糖基化處理后，它們對鄰苯二酚和2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽兩種底物的親和性變得基本相同[20]。Ma 等[21]對5 種具有單一N-糖基化位點突變的突變體進行了熱穩(wěn)定性測試、三維建模、動力學數(shù)據(jù)和二級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其中4 個位點的N-糖基化通過微調(diào)β-夾心結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)型，正向調(diào)節(jié)底物親和力從而引起酶活性的改變。Xu 等[22]通過比較不同漆酶突變體的催化性能，發(fā)現(xiàn)rLcc9 中N313 和N454 位點的糖基化會分別影響其對底物的結(jié)合親和力和催化速率。此外，糖基化也會影響rLcc9 和nLcc9 的熱穩(wěn)定性，因為這些lcc9 的去糖基化在一定程度上降低了它們的熱穩(wěn)定性。但是芳基醇氧化酶N-糖基化位點、糖基化程度、蛋白構(gòu)象與酶學性質(zhì)之間的關(guān)系尚不清楚，限制了利用糖基化工程對芳基醇氧化酶的酶學性質(zhì)進行提升。目前，通過糖基化改造提高畢赤酵母重組表達芳基醇氧化酶活力和穩(wěn)定性未見報道。本文以木質(zhì)素高效降解菌株P(guān).eryngii分泌的芳基醇氧化酶作為研究對象，分析天然狀態(tài)與重組表達芳基醇氧化酶N-糖基化修飾的特征與差異，闡明N-糖基化調(diào)控芳基醇氧化酶催化性質(zhì)的分子機制，以期獲得高活力、高穩(wěn)定性芳基醇氧化酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

畢赤酵母GS115（P.pastorisGS115）：美國Invitrogen 公司；刺芹側(cè)耳（P.eryngii，編號CICC 50126）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 材料、試劑和培養(yǎng)基

快流速DEAE-瓊脂糖凝膠柱（DFF100）：美國Sigma-Aldrich 公司；丙烯葡聚糖凝膠S-200 HR、Source 15Q：上海澤葉生物科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 連接酶、核酸膠回收試劑盒、DNA Marker：大連Takara 生物技術(shù)公司；質(zhì)粒提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；博來霉素：上海碧云天生物技術(shù)公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物：北京擎科生物科技有限公司；BMGY 液體培養(yǎng)基、BMMY 培養(yǎng)基：青島日水生物技術(shù)有限公司；甲醇、胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、瓊脂粉、山梨糖醇：美國Sigma 公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母提取物10.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L。

YPD 山梨糖醇（yeast extract peptone dextrose sorbitol medium，YPDS）+博來霉素平板：葡萄糖20.0 g/L，胰蛋白胨20.0 g/L，酵母提取物10.0 g/L，山梨糖醇182 g/L，博來霉素0.1 g/L，瓊脂粉20.0 g/L。

1.2 用于定點突變的芳基醇氧化酶N-糖基化位點篩選及確定

以已經(jīng)公布的芳基醇氧化酶蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)為模板，利用SWISS-MODEL 對其結(jié)構(gòu)進行模擬。經(jīng)過N-糖基化在線搜索引擎Net Glyc1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對潛在的芳基醇氧化酶N-糖基化位點進行預測。根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)合生物信息學分析選取目標突變糖基化位點。在上述芳基醇氧化酶上將關(guān)鍵位點進行單點或多點突變，將芳基醇氧化酶N89 和N249 號糖基化中的天冬酰胺（asparagine，Asn）突變成丙氨酸（alanine，A），構(gòu)建3 個突變體（N89A、N249A、N89/249A）。為了提高糖基化修飾的發(fā)生率，可將其構(gòu)成增強芳香族序列（enhanced aromatic sequence，EAS）的形式。目標突變序列主要關(guān)注那些較少氨基酸的突變就能導致EAS 序列形成的氨基酸序列，因此糖基化較高的loop/turn 區(qū)上的氨基酸序列比較合適。采用PyMOL 軟件的方式，在三維結(jié)構(gòu)晶體上，對目標突變位點的所處位置進行初步分析，最后得出該序列在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)表面上，而且遠離活性位點，且處于loop/turn 區(qū)的位置。根據(jù)以上原則，突變體表達如下：AAO（F-X-N-X-T），AAO（F-N-X-T）和AAO（F-X-X-N-X-T）。

1.3 P.eryngii 芳基醇氧化酶野生型和突變體的酵母表達載體構(gòu)建

雙酶切含有野生型及突變體基因質(zhì)粒后，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行膠回收純化和T 載體連接。采用CaCl2法制備大腸桿菌DH5α 感受態(tài)。將10 μL 的連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細胞中，進行轉(zhuǎn)染和菌落PCR 鑒定，出現(xiàn)目的條帶的菌種，進行測序分析。目的基因陽性菌種經(jīng)過鑒定正確之后，對其采取復蘇培養(yǎng)處理，對重組質(zhì)粒進行處理。針對目的基因重組質(zhì)粒與表達載體pPIC9K，采取雙酶切的方式，利用膠回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)過連接之后，實現(xiàn)重組表達載體的構(gòu)建。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 中，篩選出重組菌，擴培后提取質(zhì)粒并對其進行PCR 驗證和雙酶切驗證，陽性菌種測序，保存鑒定正確的目的基因重組表達菌種。

1.4 重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115 及其重組子的篩選

通過DNA 測序驗證突變后，對重組質(zhì)粒進行單酶切線性化，將酶切產(chǎn)物進行膠回收。電穿孔轉(zhuǎn)化為畢赤酵母GS115 感受態(tài)細胞。隨后，在含100 μg/mL 博來霉素YPDS 平板上選擇轉(zhuǎn)化子。

轉(zhuǎn)化子進一步劃線于含G418 的YPD 平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d 至單菌落出現(xiàn)后，轉(zhuǎn)接于10 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)48 h，收集菌體，棄上清液；通過采用BMMY 誘導培養(yǎng)基，稀釋菌體直到OD600=1，在30 ℃的溫度狀態(tài)下，200 r/min 搖床培養(yǎng)。添加甲醇，以保證每天終濃度為0.5%（體積分數(shù)），誘導3 d 后每隔24 h 收集一次培養(yǎng)上清液。得到的上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，篩選陽性單菌落。

1.5 P.eryngii 芳基醇氧化酶分離和純化

將陽性單菌落轉(zhuǎn)接至含100 mL BMGY 液體培養(yǎng)基的300 mL 錐形瓶進行擴大培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心時間5 min，收集上清液，利用35%飽和度硫酸銨，予以初次沉淀處理，在二次沉淀時，采用75% 飽和度硫酸銨將大多數(shù)雜蛋白從發(fā)酵液內(nèi)去除，進而采用化學親和、離子交換法、疏水和凝膠過濾等多層析方式純化表達中的重組蛋白質(zhì)，獲得較高純度的酶[14，23]，并進行后續(xù)酶活性的測定。

1.6 芳基醇氧化酶催化性質(zhì)研究

1.6.1 酶活力測定

在1 mL 反應混合液體系中，藜蘆醇為10 mmol/L，而且還含有100 mmol/L（pH6.0）磷酸鈉緩沖液以及一些酶液，室溫下，于310 nm 處測定吸光度的變化（310 nm 處藜蘆醇摩爾吸光系數(shù)ε=9 300），以100 ℃加熱滅活的酶反應混合液為對照。在每毫升反應混合液內(nèi)，1 μmol 產(chǎn)物在每分鐘需要的酶量定義為1 個酶活力單位（U）。

1.6.2 酶催化特性的測定

最適溫度：在相同pH 值反應條件和反應體系下，將重組突變酶或野生型酶與底物在不同溫度（20～80 ℃）下反應，按1.6.1 測定酶活力，確定木質(zhì)素降解酶的最適反應溫度。最適pH 值：野生型酶或重組突變酶在不同pH 值（1～12）下與底物反應，采用1.6.1 方法測定酶活力，從而明確最佳反應pH 值。pH 值穩(wěn)定性：分別將其混合到不同pH 值（1～12）緩沖液內(nèi)，在37 ℃的溫度環(huán)境下，放置3 h，對剩余酶活力進行測定，參照標準即為最適pH 值的酶活，并使其穩(wěn)定性得以明確。熱穩(wěn)定性：通過調(diào)整野生型酶樣品與表達的突變體，保持一致的濃度（0.15 mg/mL），在70 ℃及以上的水浴中處理15 min，處理后立即置于冰上冷卻，在37 ℃的條件下，溫育時間為5 min，對剩余酶活進行測定，各個反應的重復次數(shù)為3 次。動力學常數(shù)：基于最適pH 值的狀態(tài)下，配制不同濃度的底物，分別表示為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 以及1.2 g/L，取一定量的重組突變酶或野生型酶與底物在40 ℃反應10 min，進行酶活測定。利用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法得出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 對芳基醇氧化酶N-糖基化位點進行生物信息學預測和結(jié)構(gòu)分析

采取生物信息學預測的方式，以N-糖基化在線捜索引擎Net Glyc1.0 Server 為依托，預測分析N-糖基化位點，通過對芳基醇氧化酶進行研究后發(fā)現(xiàn)，在N89號和N249 號位點位置處，表現(xiàn)出糖基化修飾的特點。具體見圖1[24]。

2.2 突變體克隆表達

對突變體AAO（N89A）、AAO（N249A）、AAO（N89/249A）、AAO（F-X-N-X-T）、AAO（F-N-X-T）和AAO（F-XX-N-X-T）的全質(zhì)粒擴增產(chǎn)物進行DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2 和圖3 所示。

從圖2 和圖3 中可以看出，理論PCR 產(chǎn)物的大小約為2 275 bp；經(jīng)PCR 篩選后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，能篩選到較多的陽性克隆菌落，初步說明定點突變成功。

2.3 小量表達測試

誘導表達各重組子之后，上清液SDS-PAGE 的結(jié)果見圖4。

圖4 SDS-PAGE 電泳分析Fig.4 The analysis for SDS-PAGE electrophoresis

由圖4 可知，各重組子均可表達相應的突變酶且表達量與野生型大致相同。芳基醇氧化酶的理論分子量為70 kDa，在畢赤酵母中表達其分子量會因發(fā)生N-糖基化而增加，故實際分子量大于70 kDa。

2.4 重組表達芳基醇氧化酶分離純化及酶活性測定結(jié)果分析

重組表達野生型芳基醇氧化酶發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀，對粗酶液采取重溶透析之后，根據(jù)DEAE-Sepharose Fast Flow 弱陰離子交換層析柱進行操作，Sephacryl S-200 High Resolution 凝膠過濾層析柱和Source 15Q 強陰離子交換層析柱，隨峰值檢測芳基醇氧化酶活性并收集層析產(chǎn)物，重組表達芳基醇氧化酶分離純化及酶活性的結(jié)果見表1。

表1 芳基醇氧化酶分離純化Table 1 Isolation and purification of aryl-alcohol oxidase

由表1 可知，經(jīng)上述步驟純化后，芳基醇氧化酶比活力為221.3 U/mg，較粗酶液純化了4.6 倍，回收率為27%。通過Source 15Q 強陰離子交換層析柱繼續(xù)對6 個芳基醇氧化酶糖基化突變體進一步進行純化，進行了酶活檢測，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 芳基醇氧化酶野生型和6 個糖基化突變體酶活檢測結(jié)果Fig.5 Results of the enzyme activity of wild type aryl-alcohol oxidase and six glycosylation mutants

由圖5 可知，與野生型相比，突變體酶活沒有明顯差異。

2.5 野生型和6 個突變體純化后芳基醇氧化酶酶學性質(zhì)分析

2.5.1 pH 值對芳基醇氧化酶活性的影響

分別配制100 mmol/L pH2.0～4.5 的酒石酸鈉緩沖液、100 mmol/L pH6.0～8.0 的磷酸鈉緩沖液和100 mmol/L pH8.0～12.0 的廣泛緩沖液體系。對芳基醇氧化酶不同突變體進行酶活測定，改變緩沖體系，設(shè)定最高者的相對酶活為100%。在以上條件下，pH 值對野生型和6 個突變體芳基醇氧化酶活性的影響見圖6。

圖6 pH 值對芳基醇氧化酶酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on aryl-alcol oxidase activity

從圖6 中可以看出，以藜蘆醇為底物時，芳基醇氧化酶在pH5.0～7.0 之間顯示出較強的酶活，其中在pH值為6.0 時活力最高。如果pH 值高于8.0，將會迅速降低酶活力，如果這一數(shù)值為11.0，無法對酶活力進行檢測。同時，不同突變體的酶活力結(jié)果顯示，加入或刪除糖基化位點對芳基醇氧化酶的最適pH 值幾乎沒有影響。

2.5.2 溫度對芳基醇氧化酶活性的影響

由2.5.1 得出的最適催化pH 值的緩沖體系測定酶活力，將該緩沖體系在20～90 ℃溫度梯度下保溫10 min，設(shè)定最高者的相對酶活力為100%，緩沖體系應用的即為pH6.0。在以上條件下，溫度對野生型和6 個突變體芳基醇氧化酶活性的影響見圖7。

圖7 溫度對芳基醇氧化酶酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on aryl-alcol oxidase activity

從圖7 可知，突變N89 和N249 糖基化位點后，芳基醇氧化酶的最適溫度降低為60 ℃，引入新的糖基化位點后，最適溫度沒有明顯變化，同于野生型的65 ℃溫度。

2.5.3 芳基醇氧化酶的熱穩(wěn)定性

將芳基醇氧化酶與最適穩(wěn)定pH 值緩沖液充分混合，置于60～100 ℃溫度梯度下，保溫24 h，設(shè)定原始芳基醇氧化酶的相對活力為100%。采用pH6.0 的緩沖體系與芳基醇氧化酶的酶液混合，分別放在不同溫度的水浴鍋里保溫24 h 后測定酶活力。在以上條件下，野生型和6 個突變體芳基醇氧化酶的熱穩(wěn)定性見圖8。

圖8 芳基醇氧化酶野生型和6 個糖基化突變體熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of wild-type and six glycosylation mutants of aryl-alcohol oxidase

從圖8 中可以看出，芳基醇氧化酶在60 ℃和65 ℃時，經(jīng)過24 h 后仍能保持很高的活性；但隨著溫度的升高，酶活力逐漸下降，在80 ℃時，野生型酶殘余酶活力降至40% 左右；相較于野生型而言，N89 和N249 糖基化位點的突變導致了熱穩(wěn)定性的降低。相反地，F(xiàn)-X-N-X-T、F-N-X-T 和F-X-X-N-X-T 這3 種引入了不同糖基化位點的突變體，隨著溫度的上升，相對酶活力下降的速度明顯比野生型慢，當溫度上升至80 ℃時還保留了60%左右的酶活力。

2.5.4 野生型和6 個突變體純化后芳基醇氧化酶的動力學參數(shù)

野生型和6 個突變體芳基醇氧化酶的動力學參數(shù)見表2。

表2 芳基醇氧化酶動力學參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of aryl-alcohol oxidase

表2 結(jié)果表明，糖基化位點突變對芳基醇氧化酶比活力影響不大，但是，N89 和N249 糖基化位點突變后會影響酶和底物的親和力，突變體AAO（F-X-N-X-T）具有更高的糖基化水平，與此同時，催化效率與底物親和力也相對較高。

3 討論與結(jié)論

不同的側(cè)耳屬，煙管菌和黃孢原毛平革菌屬中都有芳基醇氧化酶表達[1]。其中P.eryngii芳基醇氧化酶研究最為廣泛[25]。吳茵等[25]從P.eryngii中獲得的純化芳基醇氧化酶分子量和等電點分別為70 kDa 和4.2。以藜蘆醇為底物進行酶活測定，最適pH 值為6.0，最適反應溫度40 ℃。同時，來自P.eryngii的芳基醇氧化酶基因分別在釀酒酵母和畢赤酵母表達系統(tǒng)中成功得到表達[13]。

研究表明，糖基化影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、酶對底物的識別催化能力及其熱穩(wěn)定性[26-28]。在現(xiàn)代酶學研究中，糖基化逐漸成為研究者關(guān)注的熱點[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白糖基化主要有兩種形式，其一是N-糖基化，其二即為O-糖基化。相關(guān)研究表明，N-糖基化修飾可以有效調(diào)節(jié)真菌胞外分泌酶活性和穩(wěn)定性。黑曲霉植酸酶phyA2 去糖基化處理后活性下降了10%[31]；對畢赤酵母重組表達的乙酰木聚糖酯酶33 號和99 號N-糖基化位點進行突變，突變體與原酶相比，在比活力上沒有明顯差別，而穩(wěn)定性均有明顯的下降[32]。泡盛曲霉阿魏酸酯酶糖基化位點N79 分別定點突變?yōu)镹79A 和N79Q，兩個突變體熱穩(wěn)定性和酶活性明顯降低[33]。相反地，突變位于反向轉(zhuǎn)角區(qū)具有EAS 特征的位點，能顯著提高堿性果膠酶和β-葡萄糖醛酸苷酶活性和熱穩(wěn)定性[34-35]。

本文以畢赤酵母GS115 為表達系統(tǒng)，成功表達了不同N-糖基化水平的芳基醇氧化酶突變體，對野生型和突變體蛋白進行酶學性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，突變芳基醇氧化酶N89 和N249 糖基化位點的突變導致最適溫度和酶熱穩(wěn)定性降低，在酶的loop/turn 區(qū)引入具有EAS 特征的新N-糖基化，對提高其熱穩(wěn)定性具有顯著促進作用。以藜蘆醇為底物時，突變體AAO（F-X-N-X-T）與底物親和力最高，其他突變體基本不變。結(jié)果表明，糖基化程度的提高與芳基醇氧化酶熱穩(wěn)定性提高存在明顯的相關(guān)性，這與之前的研究相符。

經(jīng)N-糖基化改造獲得的高酶活、高穩(wěn)定性重組芳基醇氧化酶突變酶AAO（F-X-N-X-T）的最適反應溫度為65 ℃、最適反應pH 值為6，其最適溫度和70 ℃下的熱穩(wěn)定性都明顯優(yōu)于野生型。通過合適的定點突變和引入N-糖基化位點[AAO（F-X-N-X-T）]等措施對芳基醇氧化酶N-糖基化進行改造，獲得了具有高親和力、高穩(wěn)定性的芳基醇氧化酶。本文為揭示N-糖基化修飾調(diào)控芳基醇氧化酶酶學性質(zhì)的普遍規(guī)律，利用糖基化工程生產(chǎn)高品質(zhì)的酶提供理論依據(jù)。