王健霞，劉袆帆，徐玉娟*，馬路凱，3*，肖更生

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點(diǎn)試驗(yàn)室，仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510631；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850000）

橄欖菜（olive vegetable）是以橄欖果和芥菜為原料，經(jīng)腌制得到有特殊鮮味和香味的醬菜[1]，富含多種營養(yǎng)成分、維生素及人體必需的鈣、碘、鐵鋅等元素，是嶺南潮汕地區(qū)特色代表性產(chǎn)品之一，其因特殊風(fēng)味深受消費(fèi)者喜愛。根據(jù)SB/T 10297—1999《醬腌菜分類》，橄欖菜屬于醬腌菜，醬腌菜原料的來源、用量、腌漬時(shí)間、溫度等均有嚴(yán)格要求。2007 年商務(wù)部頒布了SB/T 10439—2007《醬腌菜》，對醬腌菜制定了商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

腌制蔬菜香味成分豐富，其風(fēng)味的優(yōu)劣不僅關(guān)乎其品質(zhì)，還會(huì)直接影響其消費(fèi)市場。目前的研究主要集中在泡菜、酸菜、雪菜、大頭菜等醬腌菜的風(fēng)味方面，Xiao 等[2]采用氣質(zhì)聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對江西腌菜、四川泡菜、東北酸菜揮發(fā)性化合物進(jìn)行探究，得出四川泡菜的主要風(fēng)味化合物為異普勒醇和芳樟醇，江西腌菜中的主要揮發(fā)性化合物是二甲基二硫化物、2，4-二甲基噻唑、4-乙基-5-甲基噻唑和3-甲基-1，2-噻唑，在東北酸菜中，壬酸乙酯、2-甲基戊酸乙酯和二硫化二甲酯為主要揮發(fā)性化合物。Zhang 等[3]采用GC-MS 對雪菜中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行探究得出，異硫氰酸烯丙基酯、乙酸乙酯、3-丁腈、苯酚、乙醇和3-（2，6，6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-基）丙烯醛是雪菜傳統(tǒng)和現(xiàn)代發(fā)酵的主要風(fēng)味化合物；Luo 等[4]采用GC-MS 對小姜泡菜的揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小姜泡菜中相對含量最高的香氣成分是醋酸香葉酯；張鈺麟等[5]采用GC-MS 對不同溫度腌制大頭菜的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究，并結(jié)合相對氣味活度值（relative odor activity values，ROAV）法對主要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明大頭菜在低溫腌制下的風(fēng)味物質(zhì)主要是醇類、酯類、烯類和腈類，其中1-辛烯-3 醇、苯乙醇、2-苯基乙基異硫代氰酸酯、桉葉油醇、苯代丙腈為特征性的風(fēng)味物質(zhì)。Yun 等[6]采用GC-MS 對四川、重慶商業(yè)泡菜和接種泡菜揮發(fā)性化合物進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)乙酸香葉酯、二甲基三硫醚、桉葉油醇和芳樟醇是影響自然發(fā)酵泡菜風(fēng)味特征的主要化合物，二甲基三硫化物，二甲基二硫化物是接種泡菜的氣味貢獻(xiàn)者。以上研究均表明傳統(tǒng)醬菜風(fēng)味物質(zhì)組成較為復(fù)雜，且受加工工藝影響，對醬菜風(fēng)味解析可有效保證其品質(zhì)。目前對橄欖菜風(fēng)味的研究較少，關(guān)于潮汕地區(qū)特色醬菜橄欖菜的風(fēng)味物質(zhì)組成，以及其關(guān)鍵的風(fēng)味物質(zhì)尚缺乏系統(tǒng)研究。

氣相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，GCQTOF/MS）分辨率高，靈敏性好，并且以圖譜進(jìn)行檢索能夠推測化合物的裂解規(guī)律，比單純的串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，可以通過化合物的裂解規(guī)律進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。本研究通過頂空-氣相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)合ROVA 法及感官評(píng)價(jià)，對潮汕橄欖菜的風(fēng)味物質(zhì)組成進(jìn)行定性分析，并對其關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行解析，以期為潮汕橄欖菜的品質(zhì)分析提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖菜：廣東蓬盛味業(yè)有限公司。

氫氧化鈉（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、無水乙醚（均為分析純）：廣東廣試試劑科技有限公司；乙醇（分析純）、石油醚（分析純，沸程30～60 ℃）、乙腈（色譜純）：天津市富宇精細(xì)化工有限供公司；碘、碘化鉀、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硝酸銀、鉻酸鉀（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

7697-7890B-7200 頂空-氣相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、DB-624 色譜柱（30 m×250 μm，1.4 μm）：美國Agilent 公司；BSA423S-CW 電子天平（感量1 mg）：德國賽多利斯公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋、BPG-9156A 鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DL-400B 智能超聲波清洗器：上海之信儀器有限公司；DF-101S 磁力攪拌器：上海力辰邦西儀器科技有限公司；JB-1042 低速離心機(jī)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；CBM-20A 高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將同一批次的橄欖菜混勻，-80 ℃儲(chǔ)藏，待測。

1.3.2 理化指標(biāo)測定

參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》第一法測定樣品的水分含量；參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》第二法測定樣品的脂肪含量；參照GB 5009.8—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》第一法測定樣品的糖分含量；參照GB 5009.42—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食鹽指標(biāo)的測定》第一法測定樣品的食鹽含量。

1.3.3 定性分析

1.3.3.1 樣品前處理

精密稱取橄欖菜樣品5.0 g，置于20 mL 頂空瓶中，密封后置于樣品盤上。根據(jù)頂空進(jìn)樣條件（樣品瓶加熱溫度120 ℃，定量環(huán)溫度130 ℃，傳輸線溫度140 ℃，平衡時(shí)間30 min）進(jìn)行分析。

1.3.3.2 GC-QTOF/MS 條件

GC 條件：DB-624 色譜柱（30 m×250 μm，1.4 μm）；載氣為氦氣；傳輸線溫度280 ℃。進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口260 ℃，分流進(jìn)樣，分流比20∶1，流速1.2 mL/min；色譜柱初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升溫到120 ℃，然后以15 ℃/min 升溫到260 ℃保持5 min。

QTOF/MS 條件：掃描方式為Scan 模式，掃描范圍m/z 35～800，采集頻率500 ms；電離方式為電子轟擊離子源（electron ionization，EI），電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃。

1.3.4 定量分析

采用DB-624 色譜柱（30 m×250 μm，1.4 μm），通過NIST 14 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化合物檢索并鑒別，以組分面積為依據(jù)，采用面積歸一化方法進(jìn)行定量分析。

1.3.5 關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的評(píng)價(jià)

參照Zhu 等[7]的方法，根據(jù)ROAV 值來確定關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)對橄欖菜風(fēng)味的影響，樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大的物質(zhì)的ROAV 為100，樣品中其他風(fēng)味物質(zhì)的ROAV（W）可通過下列公式計(jì)算。

式中：Ca、Cmax分別為不同揮發(fā)性成分的相對含量和樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量，%；Tmax、Ta分別為對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大的揮發(fā)性物質(zhì)感官閾值和各揮發(fā)性成分的感官閾值，mg/kg。

對于所有的風(fēng)味物質(zhì)，0≤ROAV≤100。0.1≤ROAV<1，說明對樣品的風(fēng)味起修飾作用；ROAV≥1 時(shí)，說明這種物質(zhì)為樣品的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，ROAV 越大，則說明該揮發(fā)性物質(zhì)對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)越大。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

挑選10 名食品專業(yè)人員（男女各半）組成感官評(píng)價(jià)小組，分別從滋味、氣味、色澤和質(zhì)地4 個(gè)方面對橄欖菜進(jìn)行評(píng)分（10 分制）。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1 所示。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)3 次，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Excel 2010 分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，運(yùn)用Origin 2019 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖菜中理化指標(biāo)結(jié)果

橄欖菜中的成分較為復(fù)雜，通過對其水分、食鹽、脂肪、糖分檢測，結(jié)果顯示每100 g 橄欖菜中含水分（2.33±0.05）g、食鹽（3.10±0.08）%、脂肪（45.40±0.29）g、糖分（0.17±0.02）g。根據(jù)SB/T 10297—1999《醬腌菜的分類》可知橄欖菜屬醬油漬菜類，橄欖菜樣品中的水分和食鹽含量均符合SB/T 10439—2007《醬腌菜》規(guī)定的理化指標(biāo)。糖分的含量較少可能原因是蔬菜本身含有的糖分經(jīng)過加工而析出。橄欖菜中的脂肪含量很大，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道食用植物油含有多種揮發(fā)性物質(zhì)對食品的風(fēng)味的影響也很大，油脂是橄欖菜的主要風(fēng)味物質(zhì)之一[8]。

2.2 橄欖菜揮發(fā)性成分組成

橄欖菜因其特殊的香氣，增加消費(fèi)者的食欲。對橄欖菜的揮發(fā)性物質(zhì)組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表2 所示。進(jìn)一步可視化分析結(jié)果如圖1 所示。

圖1 橄欖菜揮發(fā)性物質(zhì)種類三維扇形圖（匹配因子≥80%）Fig.1 Three-dimensional fan chart of volatile substances of olive vegetable（matching factor≥80%）

由表2 可知，橄欖菜中共檢出匹配度大于80%的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)44 種，其中醇類物質(zhì)6 種、烷類物質(zhì)6 種、醛類物質(zhì)4 種、酯類物質(zhì)4 種、酸類物質(zhì)3 種、酮類物質(zhì)2 種、雜環(huán)類物質(zhì)7 種，硫化物4 種，其他物質(zhì)8 種。

橄欖菜眾多的揮發(fā)性物質(zhì)中，醇類物質(zhì)（28.06%）含量最高，其次是醛類（23.34%）和酸類（15.24%）物質(zhì)。在醇類物質(zhì)中環(huán)丙基甲基甲醇（26.93%）含量最高，在醛類物質(zhì)中，丙醛（23.07%）的含量最高，在酸類物質(zhì)中乙酸（14.99%）的含量最高。由此可判斷橄欖菜中主要的揮發(fā)性物質(zhì)成分為環(huán)丙基甲基甲醇、丙醛（腥味、青草味）、乙酸（酸香）。

橄欖菜中醇類物質(zhì)中環(huán)丙基甲基甲醇含量較多，占比26.93%。其主要是由于溴甲烷經(jīng)過一系列的反應(yīng)生成二溴甲烷，二溴甲烷與丁烯酮經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生大量的環(huán)丙基甲基甲醇。橄欖菜在發(fā)酵過程中含有大量微生物，據(jù)相關(guān)報(bào)道，芥菜在發(fā)酵過程中醇類物質(zhì)的增加除了與微生物的次生代謝物有關(guān)，還可能是由酯化、氧化和微生物在芥菜葉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次生代謝物引起[18]。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，橄欖菜中醛類物質(zhì)產(chǎn)生與脂肪氧化有關(guān)，不飽和脂類氧化產(chǎn)生的醛類物質(zhì)是油脂分為的主要來源，且主要為己醛和丙醛，橄欖菜中油脂含量豐富，油脂經(jīng)過脂肪氧化產(chǎn)生多種醛類物質(zhì)，例如亞麻酸經(jīng)過氧化生成丙醛，呈現(xiàn)出腥味和青草味[15]。此外，蔬菜在加工過程中細(xì)胞發(fā)生破損，醛類物質(zhì)得以釋放；發(fā)酵過程中也會(huì)生成醛類等新的揮發(fā)性物質(zhì)[19]。

橄欖菜中酸類物質(zhì)中乙酸含量較高，占比14.99%。這是與橄欖菜加工過程所使用的油脂中所含有的酸類呈香物質(zhì)較多有關(guān)，Ivanova-Petropulos 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，菜籽油、葵花籽油、芝麻油、南瓜籽油中含有大量的乙酸。與本文結(jié)果一致。

雜環(huán)類化合物也是一類重要的香氣成分，橄欖菜中也含有少量的該類物質(zhì)，包括吡嗪類和呋喃類物質(zhì)。這兩類物質(zhì)主要與非酶促的美拉德反應(yīng)有關(guān)。其中吡嗪類物質(zhì)是由兩個(gè)具有α-氨基羰基結(jié)構(gòu)的化合物經(jīng)縮合反應(yīng)，在生成二氫吡嗪后發(fā)生自動(dòng)氧化而產(chǎn)生，在較低濃度下呈現(xiàn)烤堅(jiān)果香味[21]；呋喃類物質(zhì)經(jīng)過脂質(zhì)過氧化、碳水化合物降解和美拉德反應(yīng)形成。例如，2-戊基呋喃在橄欖油、亞麻籽油、核桃油、葵花籽油和菜籽油等多種植物油中被檢測出[22]。該物質(zhì)通過亞油酸中的9-羥基自由基與氧氣反應(yīng)生成過氧化氫乙烯基，通過烷氧基環(huán)化反應(yīng)使含有這類物質(zhì)的食品呈現(xiàn)出濃郁的香甜味。

2.3 關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的ROAV 分析

通過查閱《化合物香味閾值匯編》[23]得到橄欖菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的感官閾值，橄欖菜每種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)ROAV 見表3。

表3 橄欖菜揮發(fā)性物質(zhì)相對氣味活度值Table 3 Relative odor activity value（ROAV）of volatile substances in olive vegetable

由表3 可知，乙硫醇（ROAV 為100）對其風(fēng)味的貢獻(xiàn)值最大。ROAV≥1 的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)成分為乙硫醇、甲硫醇，0.1≤ROAV<1 的揮發(fā)性物質(zhì)為正丙醛，對橄欖菜風(fēng)味起修飾作用。

乙硫醇和甲硫醇是由橄欖菜中含有硫化物經(jīng)過發(fā)酵反應(yīng)生成；通過表2 可知，橄欖菜中含有氧硫化碳、二硫化碳、二甲基三硫等揮發(fā)性成分，氧硫化碳遇橄欖菜中的水分后，可生成具有洋蔥、橡膠的味道的乙硫醇，乙硫醇在水中的閾值較低，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，因此賦予橄欖菜特殊風(fēng)味。而二硫化碳和二甲基三硫經(jīng)過一系列的化學(xué)反應(yīng)會(huì)生成具有熏菜味的甲硫醇。有研究發(fā)現(xiàn)蘿卜泡菜的特征風(fēng)味物質(zhì)也是二甲基三硫，且芳樟醇、辛酸乙酯等香氣物質(zhì)對蘿卜泡菜的香氣喜好度和整體喜好度貢獻(xiàn)較大[24]，與本文結(jié)果相似。李從聰[25]在探究腌制油菜苔風(fēng)味特征中也發(fā)現(xiàn)二甲基三硫是腌制油菜苔的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。橄欖菜中的成分復(fù)雜，因二甲基三硫轉(zhuǎn)化成甲硫醇的閾值比其自身的閾值更低，因而對橄欖菜的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

對橄欖菜風(fēng)味起修飾作用的丙醛除了因脂肪氧化和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生外，還可能是橄欖菜中添加的大蒜等物質(zhì)，在加工過程中受到破壞，異蒜氨與酶相互反應(yīng)生成的硫代醋酸S-甲酯在與蒜氨酸酶和催淚因子合成酶相互反應(yīng)生成丙醛[26]。橄欖菜中脂肪含有一定量的油脂，油脂中的不飽和脂肪酸（亞油酸和n-3 型脂肪酸）發(fā)生氧化分解，生成一定量的丙醛[27]。

2.4 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

橄欖菜感官評(píng)價(jià)結(jié)果如表4 所示。

從表4 中可以看出，新制作出的橄欖菜色澤烏艷誘人，質(zhì)地均勻細(xì)膩，油香濃郁，鮮咸可口。由于制作出來的橄欖菜中油脂的氣味、配料的香味的結(jié)合使橄欖菜呈現(xiàn)出這樣的特點(diǎn)。

橄欖菜感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖見圖2。

圖2 橄欖菜感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.2 Sensory evaluation radar map of olive vegetable

由圖2 可知，在橄欖菜感官評(píng)價(jià)中，橄欖菜整體評(píng)分較高，滋味、氣味、色澤、質(zhì)地較好，深受評(píng)價(jià)人員喜愛。結(jié)合表4 可以看出，色澤和質(zhì)地評(píng)價(jià)高于滋味和氣味，這表明新制作的橄欖菜客觀狀態(tài)得到消費(fèi)者的認(rèn)可，橄欖菜中油脂、配料、及橄欖菜本身會(huì)發(fā)出的香氣及制作手法因每個(gè)人的喜愛程度不同而產(chǎn)生差異。

3 結(jié)論

本研究采用HS-GC-QTOF/MS 對潮汕橄欖菜風(fēng)味物質(zhì)的組成進(jìn)行探究，結(jié)合ROAV 法對橄欖菜的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)橄欖菜中共檢出酸類、醇類、烷類、醛類、酯類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)44 種（匹配度大于80%），其中醇類物質(zhì)6 種、烷類物質(zhì)6 種、醛類物質(zhì)4 種、酯類物質(zhì)4 種、酸類物質(zhì)3 種、酮類物質(zhì)2 種、雜環(huán)類物質(zhì)7 種，硫化物4 種，其他物質(zhì)8 種。主要揮發(fā)性物質(zhì)為環(huán)丙基甲基甲醇、丙醛、乙酸，其關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)（ROAV≥0.1）為乙硫醇、甲硫醇、丙醛。本研究為橄欖菜主要揮發(fā)性物質(zhì)分析提供了理論依據(jù)，為潮汕橄欖菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了一定的理論支撐。